全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (11): 1086~10901086
收稿 2011-06-01　　修定 2011-09-20
资助 陕西师范大学中央高校基本科研业务费重点项目(GK-
200901014)。
* 通讯作者(E-mail: licuiqin16@snnu.edu.cn; Tel: 029-85310282)。
丹参异戊烯焦磷酸异构酶基因(SmIPI)的生物信息学及表达分析
杨滢, 周露, 化文平, 王喆之, 李翠芹*
教育部药用资源与天然药物化学重点实验室, 西北濒危药材资源开发国家工程实验室, 陕西师范大学生命科学学院, 西安
710062
摘要: 异戊烯焦磷酸异构酶(IPI)是萜类合成途径的关键酶之一。本文在丹参转录组高通量数据分析的基础上, 对丹参IPI基
因(SmIPI)进行了克隆及序列分析。SmIPI全长1 234 bp, 包含681 bp的开放读码框, 编码226个氨基酸。生物信息学结构分
析表明, SmIPI为亲水性α/β蛋白, 包含有IPI结构域, 在序列组成、结构及活性位点等方面与其他植物的IPI均具有高度的相
似性。实时荧光定量PCR分析结果表明, SmIPI在丹参生长的各个时期和不同组织器官中差异表达, 其表达受病原菌和茉
莉酸甲酯的诱导。
关键词: 丹参; 异戊烯焦磷酸异构酶; 生物信息学分析; 实时荧光定量PCR; 表达模式
Bioinformatics and Expression Analysis of Isopentenyl Diphosphate Isomerase
(SmIPI) from Salvia miltiorrhiza Bunge
YANG Ying, ZHOU Lu, HUA Wen-Ping, WANG Zhe-Zhi, LI Cui-Qin*
Key Laboratory of the Ministry of Education for Medicinal Resources and Natural Pharmaceutical Chemistry, National Engineer-
ing Laboratory for Resource Development of Endangered Crude Drugs in Northwest of China, College of Life Sciences, Shaanxi
Normal University, Xi’an 710062, China
Abstract: Isopentenyl diphosphate isomerase (IPI) is a key enzyme in terpenoid biosynthetic pathway. By ana-
lyzing transcriptome sequences of Salvia miltiorrhiza, a gene which showed high homology with IPI from other
plants was found and named as SmIPI. SmIPI consists of 1 243 nucleotides, including a single 681-bp opening
reading frame and encoding a 226 amino-acid peptide. Bioinformatics analysis showed that SmIPI belongs to α/β
protein and contains an IPI domain. The core structure, sequence and activity sites of SmIPI are highly con-
served as compared with IPI from other plants. Quantitative real-time PCR analysis revealed that the gene ex-
pressed in different developmental stages and different organs, and could be induced by methyl jasmonate
(MeJA) and fungal elicitor signal.
Key words: Salvia miltiorrhiza; isopentenyl diphosphate isomerase; bioinformatics analysis; quantitative real-
time PCR; expression pattern
丹参为唇形科鼠尾草属多年生草本植物, 其
脂溶性成分主要包括丹参酮IIA、隐丹参酮、二氢
丹参酮、丹参酮I和丹参酮IIB等。这些活性成分
具有抗癌、抑菌、改善心血管病等作用, 被广泛
应用于各类临床治疗(刘娟和刘颖2010)。丹参
酮是由二萜衍生的二萜醌类化合物。在植物中,
二萜类主要是通过甲羟戊酸(mevalonate, MVA)
途径和2-C-甲基-D-赤藓糖醇-4-磷酸(2-C-methyl-
D-erythritol-4-phosphate, MEP)途径合成C5前体
异戊烯焦磷酸(isopentenyl diphosphate, IPP)或其同
分异构体二甲基烯丙基焦磷酸 (d imethyla l ly l
diphosphate, DMAPP), 再经萜类合酶逐级缩合而
成(张长波等2007)。Phillips等人(2008)对异戊二烯
合成途径研究发现, IPP和DMAPP两者的摩尔比不
同, 合成的萜类物质的种类也不同: 当两者比例为
1:1时合成单萜类物质; 为2:1时合成倍半萜或固醇
类化合物; 为3:1时合成二萜、类胡萝卜素、叶绿
醇、聚戊烯醇或更长链的多萜类化合物。已有的
研究表明, 萜类在植物体内的两条合成途径中, 质
体中的MEP途径可以合成IPP和DMAPP两种物质,
而细胞质中的MVA途径仅合成IPP (Hoeffler等
2 0 0 2 ) , 而且M E P途径最后一步合成的 I P P和
杨滢等: 丹参异戊烯焦磷酸异构酶基因(SmIPI)的生物信息学及表达分析 1087
DMAPP的比例为6:1 (Rohdich等2003)。植物体内
IPP和DMAPP的比值受到异戊烯焦磷酸异构酶
(isopentenyl diphosphate isomerase, IPI; EC 5.3.3.2)
的调节。IPI可催化IPP和DMAPP之间的可逆转
化。因此, IPI被认为是萜类合成途径的一个关键
酶(Phillips等2008)。
IPI分为两类: I型IPI发现较早, 存在于大多数
物种中, 蛋白单体是一紧密的球形蛋白, 在二价阳
离子作用下发挥功能; II型IPI为近几年发现, 主要
存在于一些革兰氏阳性菌、蓝藻和古生菌中, 为
TIM桶状黄素蛋白 , 不仅需阳离子还需FMN和
NAD(P)H辅助(化文平和王喆之2008)。Kajiwara等
(1997)将酵母(Pharffi arhosozyma)和雨生红球藻中
分离的IPI基因 cDNA转入大肠杆菌菌株JMl01, 能
增加番茄红素的产量3.6~4.5倍, β-胡萝卜素的含量
增加2.7倍。Sun等(1998)在单细胞绿藻(Haemato-
coccus pluvialis)中导入外源IPI基因, 导致细胞中
类胡萝卜素大量积累, 并且含量与IPI基因表达量
呈正相关。Liao等(2008)在甘薯(Ipomoea batatas)
中导入外源IPI基因, 同样增加了β-胡萝卜素的积
累量。以上研究表明, IPI基因在萜类物质生物合
成中是一个重要的调节因子, 它的超量表达利于
代谢流向下游流动, 促进下游相关产物的生物合
成。许多植物的IPI基因已经克隆, 如烟草(Nicoti-
ana tabacum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、伯
惠绣衣(Clarkia breweri)、曼地亚红豆杉(Taxus me-
dia)、龙胆草(Gentiana lutea)、喜树(Camptotheca
acuminate)、茶树(Melaleuca alternifolia)、海岛棉
(Gossypium barbadense)和玉米(Zea mays)等。
Zhao等人(2010)研究发现, 逆境信号分子茉莉
酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)和真菌诱导子可
在丹参毛状根中诱导丹参酮的合成。因此, 本文
在进行丹参IPI基因(SmIPI)生物信息学分析及其在
丹参不同生长时期、不同组织表达分析的同时,
也进行了SmIPI在MeJA和甘蓝黑腐病黄单胞菌诱
导下的表达分析, 以期为了解SmIPI在丹参酮合成
过程中的作用及机制奠定基础。
材料与方法
1 材料与试剂
丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge)种子采自陕西
商洛, 种于RXZ2500D人工气候箱(宁波江南仪器
厂)内培养。培养条件为: 光照强度150 μmol·m-2·s-1,
光周期为光照16 h/黑暗8 h; 温度25 ℃; 湿度48%。
自种子萌发后2 d、2周、2个月以及花期取材, 分
别作为萌芽期、幼苗期和生长期的实验材料, 花
期的丹参分别取根、茎、叶和花, 幼苗期的材料
用于各项处理。上述材料取材后放入液氮速冻并
储藏于-80 ℃备用。
RNA提取试剂盒和DNase消化酶试剂购自
OMEGA公司; SYBR Green I购自TaKaRa生物公
司; MeJA购自Sigma公司。甘蓝细菌性黑腐病菌
(Xanthomonas campestris pv. campestris, XC-1)为本
实验室保存。
2 材料处理方法
MeJA溶液处理: 将5 mmol·L-1 MeJA溶液喷洒
于八周龄的丹参实生苗表面, 于0、12、24、48和
72 h分别取样, 液氮速冻, -80 ℃储藏备用。病原菌
处理: 挑取生长期甘蓝细菌性黑腐病菌XC-1, 用生
理盐水稀释至约108 cfu·mL-1, 喷洒于生长旺盛的八
周龄丹参实生苗叶片上, 于人工气候箱中按原条
件继续培养, 分别于喷洒后0、12、24、48和72 h
采样, 液氮速冻, -80 ℃储藏备用。
3 丹参总RNA的提取及cDNA第一链的合成
用OMEGA试剂提取丹参全株、根、茎、叶
以及各处理样品的总RNA, 并按照反转录试剂盒
PrimeScript® RT reagent Kit (TaKaRa)说明书合成
cDNA第一链, 反转录产物保存于-80 ℃备用。
4 SmIPI基因克隆
依据丹参EST序列, 采用Premier Primer 5.0软
件设计一对特异性引物: 5′-GGACTAGTCATG-
GACGCCGTTCAGAG-3′ (SpeI)和5′-CTAGCTAG-
CACTTCATTTCTAAGTCAGCTTGTGA-3 ′
(NheI)。以丹基因组cDNA为模板, 扩增SmIPI片
段。反应程序: 95 ℃变性3 min; 95 ℃变性30 s, 67 ℃
退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 30个循环; 72 ℃延伸10
min。PCR扩增产物经胶回收后与pMD19-T Simple
Vector连接, 再转化大肠杆菌DH5α, 送至上海华大
测序公司测序。
5 SmIPI基因的生物信息学分析
根据生物信息学软件进行在线分析(http://
www.ncbi.nlm.nih.gov/; http://www.cbs.dtu.dk/;
植物生理学报1088
http://cn.expasy.org/; http://psort.nibb.ac.jp/)。用
DNAstar、ProtParam进行开放阅读框的查找和翻
译、理化性质分析; 用在线工具PSORT、TMHMM
2.0 Server、ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL
完成跨膜结构域、二级结构和三维结构的分析。
6 SmIPI基因的表达分析
将上述方法3中合成的各样品cDNA稀释50倍
后作为模板进行荧光定量PCR反应。以持家基因
磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehy-
drogenase, GAPDH)基因为内参(引物: 5′-CCAC-
CGTCCACTCCATCACT-3′; 5′-TGG2GAACTCG-
GAACGACATAC-3′), 检测SmIPI的表达量(检测引
物 : 5 ′ -TTCCTTTGGGGCGTATGCTGTA-3′ ;
5′-TCTGCCTTCCGTAGAAGCTCTTTC-3′)。反应
条件: 95 ℃变性3 min; 95 ℃变性10 s, 60 ℃退火25
s, 40个循环。每个样品3个技术重复及2次生物学
重复。数据分析采用“2-Ct”的方法(Vandesompele
等2002), 并用SPSS 13.0中one-way ANOVA方法进
行单因素方差分析, 利用Tukey test分析各样品间
基因表达的显著性差异(P<0.05)。
结果与讨论
1 SmIPI基因的生物信息学分析
对本实验室前期高通量转录组测序结果(Hua
等2011)进行分析发现, contig1126 (1 243 bp)与其
他植物IPI基因具有较高的同源性, 包含一个681
bp的开放读码框(ORF)。依据该序列从ORF两端
设计引物克隆和测序得到一条695 bp序列(Gen-
Bank No. EF635967), 包含完整的ORF, 编码226个
氨基酸残基, 理论分子量26.30 kDa, 理论等电点
5.58。利用Blastn比对分析发现, SmIPI与烟草(Nic-
otiana tabacum; AB049816.1)、互叶白千层(Mela-
leuca alternifolia; AF483190.1)、番薯(Ipomoea sp.
Kenyan; DQ150100.1)、蓖麻(Ricinus communis;
XM002514802.1)等物种IPI基因的一致性分别为
82%、81%、81%和80%。Blastp分析发现, SmIPI
与烟草(BAB40974.1)、番茄(Solanum lycopersi-
cum; ABX55779.1)、番薯(BAI47570.1)、互叶白千
层(AAL91979.1)等物种IPI蛋白的一致性达到90%
以上, 分别为93%、93%、93%和92%, 可以看出,
不同物种中IPI基因及其编码氨基酸序列间具有高
度的相似性, 在初级结构上是保守的, 这可能与其
重要功能相关。用Blast-Conserved Domains Search
进行分析, 结果显示, SmIPI含有IPI结构域, 属于
NUDIX (nucleoside diphosphate linked moiety X)水
解酶超家族成员。
用SOPMA程序对SmIPI氨基酸序列的二维结
构进行预测, 结果显示, SmIPI由46.90%的α-螺旋、
11.95%的β-折叠、35.84%的不规则卷曲和5.31%
的β-转角组成(图1)。由SWISS-MODEL在线同源
建模方法构建的SmIPI分子模型显示: 丹参IPI单体
主要由7个螺旋、10个不同大小的折叠和一些转
角构成, 这与已研究清楚的人和大肠杆菌的IPI蛋
白的高级结构一致 , 都为紧密球形的α /β蛋白
(Zhang等2007)。与拟南芥等植物 IP I相比较
(Campbell等1997), 丹参IPI在高级结构上没有明显
变化, 预示其可能具有相同的功能。
采用Clustal W将SmIPI与其他几种植物及大
肠杆菌IPI氨基酸序列进行多序列比对分析, 结果
显示: 植物IPI的N端区域没有同源性, 在这个区域
后是高度同源的区域, 即IPI的功能区段, 可判定
SmIPI同拟南芥、烟草、伯惠绣衣及大肠杆菌IPI
类似 , 为I型IPP异构酶(图2)。参照Durbecq等
(2001)对大肠杆菌IPI活性位点的研究发现, 丹参
IPI的活性位点为: H33、H45、S49、R64、K68、C80、
H82、K105、E109、Y130、E140、E142、E161和W192, 其
中H33、H45、H82、E140和E142为几种IPI蛋白金属离
图1 SmIPI蛋白三维结构预测
Fig.1 3-D structure prediction of SmIPI protein
杨滢等: 丹参异戊烯焦磷酸异构酶基因(SmIPI)的生物信息学及表达分析 1089
子结合位点。只有K105与大肠杆菌IPI的R83有所变
化, 但与所比对的其他植物IPI完全一致, 总体上
看, 植物的IPI在功能位点上是非常保守的。
2 SmIPI在丹参不同发育时期和不同器官中的表达
对SmIPI在丹参发育的不同时期、不同器官
中的表达进行分析, 发现SmIPI在丹参萌发期的表
达量比幼苗期及生长期高, 推测其可能参与了丹
参种子萌发过程中萜类激素(如赤霉素等)的合成;
在丹参花期的各个器官中, SmIPI在根中的表达量
最高, 其次是花中, 再次是叶中, 在茎中的表达量
最低, 推测其可能参与丹参根和花中萜类物质的
合成(图3)。
丹参酮类物质属于二萜化合物, 主要在丹参
的根中富集。本研究中丹参IPI基因在丹参器官中
的表达也同样主要集中在根中, 这与丹参酮的分
布有着类似的特点, 预示SmIPI在丹参根中的表达
具有重要的作用。
图2 推导的SmIPI氨基酸序列与其他几种植物及大肠杆菌IPI的多序列比对
Fig.2 Alignment of deduced amino acid sequence of SmIPI protein and other IPI proteins
其他几种IPI为: 拟南芥AtIPI1 (AAB67741.1)和AtIPI2 (AAL57687.1)、烟草NtIPI1 (BAB40973.1)和NtIPI2 (BAB40974.1)、伯惠绣衣
CbIPI (CAA57047.1)、大肠杆菌EcIPI (AAD26812.1)。
图3 SmIPI在丹参不同发育时期和不同器官中的表达
Fig.3 Expression pattern of SmIPI in different developmental
stages and different organs in S. miltiorrhiza
植物生理学报1090
3 SmIPI在MeJA和XC-1诱导下的表达
在5 mmol·L-1 MeJA的诱导下SmIPI表达量明
显上调, 处理后24 h表达量最大。在XC-1诱导处理
后 , SmIPI表达量同样受到诱导 , 在处理后24 h
SmIPI表达量约为对照的3倍(图4)。可见, SmIPI表
达受到MeJA和病原菌等逆境信号分子的诱导。
Zhao等人(2010)发现MeJA和真菌诱导信号可
诱导丹参毛状根中丹参酮的积累。本研究中SmIPI
的表达也同样受到MeJA和真菌诱导信号的诱导, 这
预示SmIPI可能是丹参酮合成的关键酶之一。
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图4 MeJA (A)或XC-1 (B)诱导下SmIPI的表达
Fig.4 Expression pattern of SmIPI under induction of MeJA (A) or XC-1 (B)