全 文 ：植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月 163
均匀设计优化橡胶树细胞悬浮系培养基
吴紫云, 华玉伟, 黄华孙 *
中国热带农业科学院橡胶研究所, 农业部橡胶树生物学重点开放实验室, 海南儋州 571737
Optimization for Cell Suspension Culture Media of Hevea Rubber by Uniform
Design
WU Zi-Yun, HUA Yu-Wei, HUANG Hua-Sun*
Key Laboratory of Rubber Biology of Ministry of Agriculture, Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical Agricultural
Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China
提要: 以橡胶树(Hevea brasiliensis)‘热研7-33-97’和杂交种杂交种B1 (H. brasiliensis × H. nitida)的细胞悬浮系为材料, 用目
测打分和生物量鲜重作为评判指标, 进行KT (X1)、2,4-D (X2)、NAA (X3) 3因素各 12个水平以及肌醇(X4)、L-天冬酰胺
(Asn) (X5)、水解酪蛋白(CH) (X6) 3因素各 6个水平的混合水平均匀设计的结果表明, 目测法作为评判细胞生长状况的指
标含量优于生物量法, KT、2,4-D和NAA浓度对橡胶树细胞悬浮培养影响较大, 用时应该适当保证KT浓度, 降低 2,4-D含
量并提高NAA用量, 肌醇、Asn和 CH对细胞生长有一定作用, 肌醇和Asn能维持细胞的良好生长, 抑制细胞生物量的过
快增长, Asn作用强于肌醇, CH对细胞生物量的增长有促进作用。
关键词: 橡胶树; 细胞悬浮系; 均匀设计; 目测法
正交设计(or thogonal design)和均匀设计
(uniform design)是目前最流行的两种试验设计的方
法, 正交试验设计的优点是实验的次数少、均匀分
散、整齐可比。但若考察的因素数和水平数较多,
特别是水平数较多时, 正交试验设计法的实验次数
仍然很多。均匀设计由方开泰和王元共同提出, 是
处理多因素多水平试验设计的卓有成效的试验技
术, 可用较少的试验次数, 完成复杂的科研课题开
发和研究, 现在广泛用于生理学研究。对于遗传改
良非常困难和耗时的橡胶树, 细胞悬浮培养物不仅
可直接用于原生质体分离、培养与杂交, 获取次生
代谢产物, 进行大规模的无性系繁殖, 还可以在短
期内在细胞水平筛选出所需要的突变体(Thorpe
2007)。此外用微原生质体(microprotoplast)与原生
质体融合技术将供体部分或全部基因组直接转移到
受体中, 直接改良目标性状, 创制新种质材料, 与生
产上的老态型芽接苗相比, 经体细胞胚培育的幼态
型无性系保持着幼态材料的良好生长性能和抗逆
性、提高产量, 是一种潜力很大的种植材料。因
此, 培养细胞悬浮系作为育种研究的材料, 可以缩短
育种周期, 提高育种效率, 克服传统育种的缺陷
(Verhoeven等 1991; Ramulu等 1993; Rutgers等1997;
Matthews等1999; Binsfeld等2000; Louzada等2002)。
植物细胞悬浮培养的运用已很广, 相关文献非
常多, 对培养的细胞的生长状态的评判指标众多, 如
鲜重(FW)、干重(DW)、沉淀细胞体积(settled cell
volume, SCV)、密实细胞体积(packed cell volume,
PCV)、细胞数(number of cells)、光密度(optical
density, OD)、细胞大小和数目(cell size and
number)、氮含量(nitrogen content)、蛋白质含量
(protein content)、核酸(DNA 和 RNA)、有机物质
(organic matter)、有丝分裂指数(mitotic index,
MI)、EC、pH 等(Ryu 等 1990), 对于不同的应用
目的, 评判细胞生长好坏所用标准有所不同。在一
定范围内, 细胞生物量增加越快, 细胞生长越好, 但
细胞生长过快, 会导致细胞变异的加剧(Barandiaran
等1999; Fereol等2005), 这在细胞组织培养工作中,
是不希望发生的。我们根据长期细胞悬浮培养的
经验, 采用目测法打分和细胞生物量鲜重两个评判
标准, 避免单以鲜重为指标, 单纯追求鲜重最大, 而
导致结论与实际不一致; 引入目测打分做标准, 这
可进一步提高理论推测的情况与实际情况之间的一
致程度的可信性。此外, 还用均匀设计对其悬浮培
养基的几个成分进行分析, 探讨它们对细胞悬浮培
收稿 2008-09-08 修定 2008-12-18
资助 国家自然科技资源平台项目(2005DKA21 000-5-11)。
* 通讯作者(E-mail: huayuwei667@yahoo.com.cn; Tel:
0 89 8-23 3 06 73 3)。
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月164
养物生长状况的影响, 以寻求最佳培养环境, 以期
为今后进一步研究建立基础。
材料与方法
本实验材料为我国橡胶树[Hevea brasiliensis
(Willd ex A. Juss) Muell. Arg.]大规模推广品种 ‘ 热
研 7-33-97’ 和杂交种 B1 (Hevea brasiliensis×H.
nitida)单核靠边期(late uninucleate stage)花蕾取自
国家橡胶树种质资源圃(海南儋州)。整个实验所
用的培养基为改良的MS培养基和添加不同附加成
分, MS 基本培养基中经调整的成分为 260 mg·L-1
CaCl2、555 mg·L-1 MgSO4·7H2O、425 mg·L-1
KH2PO4 和 30.31 mg·L-1 MnSO4·4H2O, 培养基用前
将 pH 调至 5.8, 以 1.05 kg·cm-1 压力, 121 ℃下灭菌
20 min。均用暗培养, 温度(28±2) ℃, 悬浮培养在
转速为 100 rpm 的摇床上进行。不作说明的药品
和试剂均为国产分析纯。
花蕾用 75% 酒精表面消毒 1 min, 再用 0.1%
(W/V) HgCl2 消毒 10 min, 最后用无菌水冲洗 3 次,
每次 3 min。剥出花蕾中的花药, 接种到诱导愈伤
组织的培养基[改良的MS 培养基并添加 1.5 mg·L-1
2,4-D、1.5 mg·L-1 NAA、1.5 mg·L-1 KT、70 g·L-1
蔗糖、2.2 g·L-1植物凝胶(phytagel, Sigma)和5% (V/
V)椰子水], 培养 40~50 d。再转入到同样的培养
基上每10 d一次继代培养3次, 这样诱导出的愈伤
组织由致密、坚硬、半易脆和易脆的愈伤组织组
成, 将易脆的愈伤组织破碎成 0.1~0.5 cm颗粒, 取
3 g 接种到含 20 mL 液体培养基[改良的 MS 培养
基并添加 1 mg·L-1 2,4-D、2 mg·L-1 NAA、1.5
mg·L-1 KT、0.5 mg·L-1 6-BA、50 g·L-1 蔗糖和 5%
(V/V)椰子水]的 100 mL 三角瓶中, 置于摇床上培
养, 7 d继代一次, 每次换培养液时将新形成的分散
的小细胞团或愈伤组织转入新的三角瓶中培养, 继
代 4~6 次后, 即获得细胞悬浮培养物分散性良好、
细胞团较小、内含物丰富、大小均一、生长迅
速的细胞悬浮系。
在我们实验室多年从事橡胶树组织培养经验
和多次预备试验的基础上, 进行 KT (X1)、2,4-D
(X2)、NAA (X3) 3 因素各 12 个水平, 肌醇(inositol)
(X4)、L- 天冬酰胺(Asn) (X5)、水解酪蛋白(CH)
(X6) 3 因素各 6 个水平的混合水平试验设计。用
软件 DPS v10.0 企业版的均匀设计功能, 以中心化
偏差(CD)为均匀性度量指标, 经过计算机多次运算
寻优(CD值越小越好)确定多因素多水平的均匀设
计试验方案(表 1)。
取 0.5 g细胞继代培养到 12种液体培养基(表
1)中, 7 d 后观察结果, 2 个品种的细胞悬浮系(‘ 热
研 7-33-97’和杂交种B1)各重复 5次。均匀设计的
实验结果按 2种方式统计。一是目测法, 即以生物
量、细胞颜色、培养液浑浊度和细胞死亡, 作为
细胞生长状态的度量指标(表 2), 进行人工目测打
分, 每个指标分好(20~30 分)、中(10~20 分)、差
(0~10分)三个级别, 4个指标得分之和为目测法最
终得分; 二是生物量法, 即吸干培养液后称量细
胞鲜重。用软件 DPS 的均匀设计回归分析分别
对两种实验结果进行分析, 只考虑KT和2,4-D之
表 1 多因素多水平的均匀设计试验方案表 U12 (123×63)
培养基 因子
编号
KT 浓度(X1)/mg·L-1 2,4-D 浓度(X2)/mg·L-1 NAA 浓度(X3)/g·L-1 肌醇浓度(X4)/g·L-1 Asn 浓度(X5)/g·L-1 CH 浓度(X6)/g·L-1
N1 1.2 0.2 0.1 0.8 0.1 0.2
N2 0.6 1.2 4.0 0.6 0.1 0.8
N3 0.1 4.0 0.8 0.2 0 0.4
N4 0.8 2.0 3.2 0.1 0.6 0.1
N5 2.6 2.6 1.6 0.8 0.8 0.4
N6 3.2 0.6 1.2 0 0 0.1
N7 0 0.4 2.0 0.6 0.4 0
N8 2.0 0 2.6 0.1 0.2 0.6
N9 4.0 0.8 0.4 0.4 0.6 0.8
N10 1.6 3.2 0.2 0.4 0.2 0
N11 0.4 0.1 0.6 0.2 0.8 0.2
N12 0.2 1.6 0 0 0.4 0.6
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月 165
间以及2,4-D和NAA之间的交互作用, 即X1X2和
X 2X 3。
实验结果
1 均匀设计的回归分析
表 3是 12种培养基处理杂交种B1和 ‘热研7-
33-97’细胞悬浮系后的结果, 杂交种B1得分最高的
为 N5 培养基(94.8), N12 最低(38.6); 杂交种 B1 鲜
重最高的为 N10 培养基(3.298), N4 最低(1.375);
‘热研7-33-97’得分为N5最高(103.8), N12最低(49.5);
‘热研7-33-97’鲜重N10最高(2.988), N4最低(1.465)。
采用 DPS 软件的均匀设计回归分析得到回归方差
如下:
Y得分(杂交种 B1)=-4.8998+19.9470X1+24.9298X2+
13.1412X3+30.3538X4+38.7186X5-22.8394X6-
8.2859X1X2-6.6057X2X3 (1)
Y得分(热研7-33-97)=5.2542+20.4718X1+25.5561X2+
13.7034X3+30.2084X4+39.3787X5-23.8872X6-
8.6675X1X2- 7.1108X2X3 (2)
Y 鲜重(杂交种 B1)=3.2944-0.4785X1-0.2094X2+
0 . 1490 X 3-1 . 25 04 X 4-1 . 84 39 X 5+0 .81 98 X 6+
0.4879X1X2- 0.1318X2X3 (3)
Y 鲜重(热研 7-33-97)=2.7072-0.3380X1-0.0856X2+
0 . 1912 X 3-0 . 66 04 X 4-0 . 97 80 X 5+0 .65 75 X 6+
0.3390X1X2-0.1719X2X3 (4)
方程(1)和(2)分别是根据杂交种B1和‘热研7-
33-97’ 细胞悬浮系目测法打分结果得到的回归方
程。表 4 分别给出 4 个回归方程各变量的回归系
数, t 检测值和显著水平 p 值。方程(1)中, 所有变
量的显著水平 p 值都小于 0.01, 达极显著水平, 即
所有变量都与 Y 值高度相关。X5 (Asn)的回归系
数最大, 说明Asn对杂交种B1细胞悬浮系的生长影
响较大, 而X6 (CH)的回归系数为负值, 即培养基中
CH 的存在阻碍了杂交种 B1 细胞悬浮的生长; X1
(KT)的 t 值最大(11.188), p 值最小(<0), 可知在方
程(1)中, KT 差异达极显著, 且其显著度比其他变
量高, 也揭示出X1的变化对Y值影响最大, 而X6的
t值最小(5.781), p值最大(0.004), 说明X6的变化对
Y 值影响最小; 交互作用 X1X2 和 X2X3 的回归系数
为负值(-8.286、-6.606), 这表明 KT和 2,4-D 以及
2,4-D 和 NAA 同时存在于培养液中会抑制细胞生
长。方程(2 )与方程(1 )相似。
方程(3)和(4)分别是根据杂交种B1和‘热研7-
33-97’ 细胞悬浮系鲜重结果得到的回归方程。方
程(3)杂交种B1的鲜重回归方程中各p值均大于0.05,
差异不显著, 即各变量与 Y 值(鲜重)相关性低。X1
(-0.479)、X2 (-0.209)、X4 (-1.250)、X5 (-1.844) 和
X2X3 (-0.132)的回归系数为负, 这些变量与Y值呈
负相关, 其中肌醇 (X4)和Asn (X5)对杂交种B1细胞
悬浮系鲜重增长有抑制作用, 而 X6 (CH)回归系数
为0.820, 即对鲜重增长有促进作用; X1X2的p值最
小, 揭示它对鲜重增长影响最大。方程(4)与方程
(3 )相似。
2 均匀设计的单因子效应分析
由方程(1)和(2)可知, X4 和 X5 的系数为负, 即
肌醇和Asn与目测法结果得分成正相关, CH为负相
关; 根据方程(3)和(4), 肌醇和Asn与生物量法测得
的鲜重成负相关, CH 则与之成正相关。在不考虑
其他因素影响时, 分析 X1、X2 和 X3 对 Y 的影响,
图 1-a为目测法中X1、X2和X3对Y (得分)的影响,
杂交种B1和 ‘热研7-33-97’结果相似, X3与Y成直
线正相关, 而 X1 和 X2 与 Y 成抛物线关系, 随 X 值
表 2 细胞生长状态的度量指标
生物量 细胞颜色 培养液 细胞死亡 得分
较大 浅黄 清澈 无明显死亡 20~30
非常大 深黄 浑浊 部分死亡 10~20
较小 其他 很浑浊 严重死亡 0~10
表 3 不同处理对杂交种 B1 和 ‘ 热研
7-33-97’ 细胞悬浮系的影响

编号
杂交种 B1 ‘ 热研 7-33-97’
得分 鲜重 /g 得分 鲜重 /g
N1 48.8 1.493 59.5 1.698
N2 54.4 3.042 64.3 2.774
N3 78.8 2.580 89.5 2.347
N4 73.6 1.375 84.0 1.465
N5 94.8 2.443 103.8 2.532
N6 64.4 3.092 75.8 2.638
N7 58.6 1.959 70.0 2.144
N8 68.4 2.424 80.5 2.483
N9 88.6 1.791 100.0 2.008
N10 83.8 3.298 95.0 2.988
N11 43.6 2.044 54.3 2.192
N12 38.6 2.571 49.5 2.473
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月166
表 4 杂交种 B1 和 ‘ 热研 7-33-97’ 细胞悬浮系的逐步回归优化结果

变量
杂交种 B1 ‘ 热研 7-33-97 ’
得分 鲜重 得分 鲜重
回归系数 t 值 p 值 回归系数 t 值 p 值 回归系数 t 值 p 值 回归系数 t 值 p 值
X1 19.947 11.188 0 -0.479 1.570 0.192 20.472 10.36 90.000 -0.338 1.621 0.180
X2 4.930 10.826 0 -0.209 0.532 0.623 25.556 10.02 10.001 -0.086 0.318 0.766
X3 13.141 7.761 0.001 0.149 0.515 0.634 13.703 7.308 0.002 0.191 0.966 0.389
X4 30.354 6.653 0.003 -1.250 1.603 0.184 30.208 5.979 0.004 -0.660 1.238 0.284
X5 38.719 7.256 0.002 -1.844 2.021 0.113 39.379 6.664 0.003 -0.978 1.567 0.192
X6 -22.839 5.781 0.004 0.820 1.213 0.292 -23.887 5.460 0.005 0.658 1.423 0.228
X1X2 -8.286 5.947 0.004 0.488 2.048 0.110 -8.668 5.618 0.005 0.339 2.080 0.106
X2X3 -6.606 5.919 0.004 -0.132 0.691 0.528 -7.111 5.753 0.005 -0.172 1.317 0.258
增大, Y 值先增加后减小。总的来说, X1、X2 和
X3 对Y值的增加效应增大, 即NAA对增大得分的
效果最佳, 2,4-D 的效果次之, KT 的效果最小。图
1-b为生物量法中X1、X2 和X3 对Y (鲜重)的影响,
杂交种B1和 ‘热研7-33-97’结果相似, X3对Y影响
较小, X2 与 Y 成直线负相关, X1 与 Y 成抛物线, X1
对 Y值增加作用最大, 即KT对鲜重的增加效果最
图 1 其他因子为零水平时的因子效应分析
a: 目测法中 X1、X2 和 X3 对杂交种 B1 和 ‘ 热研 7-33-97’ (P1)细胞悬浮系得分 Y 的影响; b: 生物量法中 X1、X2 和 X3 对杂交种
B1 和 ‘ 热研 7-33-97’ (P1)细胞悬浮系鲜重 Y 的影响。
明显, 而 NAA 影响较小, 2,4-D 浓度增加时则鲜重
降低。交互作用X1X2和X2X3 对Y值影响是: X2X3
对得分和鲜重有负作用, X1X2 对得分有负作用, 对
鲜重有正作用。
3 均匀设计的方差分析
4个回归方程的方差分析结果(表5)显示, 方程
(1)的 F 值为 49.299, p 值 0.004<0.01, 即差异达极
显著, 说明方程(1)是可靠的。同样, 方程(2)也是
可靠的。方程(3)的 F 值仅为 1.635, p 值 0.374>
0.05, 即差异不显著, 说明方程(3)可信度较低。同
理, 方程(4)可信度较低。
4 均匀设计的最优化分析
根据表 6最高指标时各因素组合, 当 4.0 mg·L-1
KT、0 mg·L-1 2,4-D、4.0 mg·L-1 NAA、0.8 g·L-1
肌醇、0.8 g·L-1 Asn、0 g·L-1 CH 时, 杂交种 B1 和
‘热研7-33-97’细胞悬浮系得分最高, 分别为183和
198; 而 4.0 mg·L-1 KT、4.0 mg·L-1 2,4-D、0 mg·L-1
NAA、0 g·L-1 肌醇、0 g·L-1 Asn、0.8 g·L-1 CH
时, 杂交种B1 细胞悬浮系鲜重最高(9.0 g); 0 mg·L-1
KT、0 mg·L-1 2,4-D、4.0 mg·L-1 NAA、0 g·L-1
肌醇、0 g·L-1 Asn、0.8 g·L-1 CH 时, ‘ 热研 7-33-97’
细胞悬浮系鲜重最高(4.0 g)。
5 回归方程的预测能力分析
根据回归方程, 我们对 12 个实验的观察值和
方程计数出的拟合值进行比较, 从图 2可以看出, 4
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月 167
表 5 实验结果方差分析表
变异来源 平方和 自由度 均方 F 值 p 值
杂交种 B1 得分 回归 3595.676 8 449.459 49.299** 0.004
残差 27.351 3 9.117
总变异 3623.027 1 1
鲜重 回归 3.488 8 0.436 1.635 0.374
残差 0.800 3 0.267
总变异 4.287 1 1
‘ 热研 7-33-97’ 得分 回归 3544.313 8 443.039 39.624** 0.006
残差 33.543 3 11.181
总变异 3577.857 1 1
鲜重 回归 1.738 8 0.217 1.742 0.352
残差 0.374 3 0.125
总变异 2.112 1 1
表 6 指标值最高时各个因素组合

变量
杂交种 B1 ‘ 热研 7-33-97’
得分 鲜重 /g 得分 鲜重 /g
Y 183 9.0 198 4.0
X1 4.0 4.0 4.0 0
X2 0 4.0 0 0
X3 4.0 0 4.0 4.0
X4 0.8 0 0.8 0
X5 0.8 0 0.8 0
X6 0 0.8 0 0.8
图 2 均匀设计回归方程预测能力检验
个方程的拟合效果较好, 方程(1) (图 2-a)和(2) (图
2-b)的拟合效果好于方程(3) (图 2-c)和(4) (图 2-d),
4 个回归方程的拟合误差分别为 0.04~2.31、0.34~
2.59、0.04~0.42 和 0.01~0.29。
讨　　论
本实验在设计时考虑了 6 个因素(KT、2,4-
D、NAA、肌醇、Asn、CH), 结合均匀设计的
理论, 通过回归方程、显著性检验、方差分析、
单因子效应分析、交互作用分析以及预测值与观
察值的对比分析, 来分析这些因素对细胞生长的影
响, 获取最佳培养环境, 并比较了这两种评判标准
的可靠行和均匀设计的易用性, 此外, 对相同的因
素做回归分析, 增加了两个评判标准试验的可比性
和可靠性。
根据表4和表5的显著水平p值, 可以得出, 回
归方程(1)和(2)的拟合效果明显好于方程(3)和(4),
即目测法作为评判标准比生物量(鲜重)法更适合本
次均匀设计试验, 在用目测法时, 最高指标时的各
植物生理学通讯 第 45 卷 第 2 期，2009 年 2 月168
因素组合对于橡胶树细胞悬浮培养是可信的。为
了便于分析这6个因素以及激素间的相互作用, 我
们只考虑 6 个单因素(KT、2,4-D、NAA、肌醇、
Asn、CH)和 2 个交互作用(KT 与 2,4-D、NAA 与
2,4-D), 由于试验次数的过少, 在用软件计算时还有
更多因素的互作(如X1X4、X1X5、X12、X13、X12X2
等)没有考虑, 这导致回归方程的因素(X)与指标(Y)
基本呈线性关系, 所以才会出现最高指标时, 各因
素的值都为极值。
由于X2X3对得分和鲜重都有负作用, 而X2 (2,
4-D)对增加鲜重的效果最佳, 对得分影响较小, X3
(NAA)对鲜重影响较小, 对增大得分的效果最佳, 所
以, 我们在细胞悬浮培养过程中, 应该适当增加NAA
的浓度, 降低2,4-D的浓度。X1X2对得分有负作用,
对鲜重有正作用, X1 (KT)对得分降低的效果最佳,
对鲜重增加作用最大, X2 对得分影响较小, 对鲜重
有负作用, 因此, 应该适当保持 KT 浓度, 以免浓度
过大而降低得分, 过小而减少鲜重的增加。我们在
橡胶树细胞悬浮培养中常用的 KT:2,4-D:NAA 是
1.5:1.0:2.0 和 1.0:0.2:2.0 (mg·L-1), 这进一步验证了
本实验结果的可信性。考虑到肌醇、Asn 和 CH
对于目测法和生物量法结果的互斥性, 即肌醇和
Asn对得分成正相关, 对鲜重成负相关, 而CH与得
分成负相关, 与鲜重成正相关, 所以我们建议取适
中比值。我们实验室常用的配比是肌醇:Asn:CH为
0.6:0.2:0.4 (g·L-1)。在试验过程中, 我们看到 12 种
培养液处理的悬浮细胞均无严重死亡, 这说明细胞
悬浮培养液的各组分浓度可调性较大。
参考文献
Barandiaran X, Martin N, Rodriguez-Conde MF, Di Pietro A,
Martin J (1999). An efficient method for callus culture and
shoot regeneration of garlic (Allium sativum L.). HortSci, 34
(2): 348~349
Binsfeld PC, Wingender R, Schnabl H (2000). Characterization
and molecular analysis of transgenic plants obtained by
microprotoplast fusion in sunflower. Theor Appl Genet, 101:
1250~1258
Fereol L, Chovelon V, Causse S, Triaire D, Arnault I, Auger J,
Kahane R (2005). Establishment of embryogenic cell sus-
pension cultures of garlic (Allium sativum L.), plant regen-
eration and biochemical analyses. Plant Cell Rep, 24:
319~325
Louzada ES, del Rio HS, Xia D, Moran-Mirabel JM (2002). Prepa-
ration and fusion of Citrus sp. microprotoplasts. J Amer Soc
Hort Sci, 127: 484~488
Matthews D, Millam S, Wilkinson MJ (1999). Factors influenc-
ing the utility of gametic microprotoplasts for partial ge-
nome transfer in potato. Plant Cell Rep, 18: 786~790
Ramulu KS, Dijkhuis P, Famelaer I, Cardi T, Verhoeven HA (1993).
Isolation of sub-diploid microprotoplasts for partial genome
transfer in plants: enhancement of micronucleation and en-
richment of microprotoplast with one or a few chromosomes.
Planta, 190: 190~198
Rutgers E, Ramulu KS, Dijkhuis P, Blaas J, Krens FA, Verhoeven
HA (19 97) . Identi fication a nd molecula r analysis of
transgenic potato chromosome transferred to tomato through
microprotoplast fusion. Theor Appl Genet, 94: 1053~1059
Ryu DDY, Lee SO, Romani RJ (1990). Determination of growth
rate for plant cell cultures: comparative studies. Biotechnol
Bioeng, 35: 305~311
Thorpe TA (2007). History of plant tissue culture. Mol Biotechnol,
37: 169~180
Verhoeven HA, Ramulu KS, Gilissen LJW, Famelaer I, Dijkhuis P,
Blaas J (1991). Partial genome transfer through micronuclei
in plants. Acta Bot Neerl, 40 (2): 97~113