全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (7): 937~945　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0017 937
收稿 2014-03-02　　修定 2014-05-08
资助 江苏省农业科技自主创新资金[cx(12)1004]。
* 通讯作者(E-mail: ganlj@njau.edu.cn; Tel: 025-84396069)。
番茄Sl_OASTL/LCD基因的克隆与表达及其对侧根生长的作用
李艳军1,2, 陈健2, 陈浩3, 石志琦2, 甘立军1,*
1南京农业大学生命科学学院, 南京210095; 2江苏省农业科学院食品质量安全与检测研究所, 南京210014; 3南京绿仙子生物
技术有限公司, 南京210014
摘要: 硫化氢(H2S)是植物中最新发现的一种气体信号分子, 高等植物中内源H2S主要由L-型半胱氨酸脱巯基酶(LCD)和D-
型半胱氨酸脱巯基酶(DCD)两类蛋白产生。我们的前期研究结果表明外源H2S能够促进植物侧根发育。为了研究内源H2S
的产生机制及H2S与一氧化氮(NO)在调控侧根发育中的作用, 本实验以番茄幼苗为材料, 克隆了编码H2S合成酶基因Sl_
OASTL/LCD; 研究抑制内源H2S对NO诱导侧根发育的影响; 并研究了NO对Sl_OASTL/LCD表达的影响。结果显示: (1)番茄
根中存在3个O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解酶基因(Sl_OASTL1、Sl_OASTL2、Sl_OASTL3)。比对和结构分析显示, Sl_OASTL1为
编码H2S合成酶基因LCD, 所以将Sl_OASTL1命名为Sl_OASTL/LCD; 启动子区域分析显示, Sl_OASTL/LCD基因上游含有多
个响应NO和植物激素信号的保守基序。(2)与对照相比, 内源H2S合成酶抑制剂DL-炔丙基甘氨酸(PAG)和内源H2S清除剂
亚牛磺酸(HT)处理均能抑制侧根生长。(3)外源NO供体硝普钠(SNP)显著诱导侧根生长。(4) PAG和HT处理均能够抑制NO
对侧根生长的诱导作用。(5) RT-PCR分析显示, SNP处理能够显著诱导幼苗根中Sl_OASTL/LCD的表达。上述结果表明,
NO可能通过调控Sl_OASTL/LCD的表达产生内源H2S诱导番茄幼苗侧根发育。
关键词: Sl_OASTL/LCD; 硫化氢; 侧根; 番茄
Cloning and Expression Analysis of Sl_OASTL/LCD on Promoting Lateral
Root Formation in Tomato (Solanum lycopersicum)
LI Yan-Jun1,2, CHEN Jian2, CHEN Hao3, SHI Zhi-Qi2, GAN Li-Jun1,*
1College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2Institute of Food Safety and Quality, Jiangsu
Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 3Nanjing F-Zone Biotech. Co., Ltd., Nanjing 210014, China
Abstract: Hydrogen sulfide (H2S) is a novel gaseous signaling molecule. Previous study suggested that
endogenous H2S is synthesized by L-cysteine desulfhydrase (LCD) and D-cysteine desulfhydrase (DCD) in
plants. We suggested that exogenous H2S could promote the growth of tomato (Solanum lycopersicum) lateral
root in another research. In order to investigate the origin of endogenous H2S and the role of it in NO-modulated
lateral root formation, the full-length sequence of H2S-producing gene Sl_OASTL/LCD has been cloned from
tomato (S. lycopersicum) root. The effect of prohibiting endogenous H2S generation in nitric oxide (NO)-
induced lateral root formation in tomato (S. lycopersicum) seedling have been investigated, as well as the effect
of NO on the expression of Sl_OASTL/LCD. The main results are as follows. (1) Three O-acetylserine(thiol)
lyase genes (Sl_OASTL1, SI_OASTL2, and Sl_OASTL3) have been cloned from tomato (S. lycopersicum) root.
The alignment and structural analysis suggested that Sl_OASTL1 might code for a H2S biosynthesis enzyme,
which was designated as Sl_OASTL/LCD. And there are many conserved NO- and hormone-responsive cis-
elements by analyzing the promoter region of Sl_OASTL/LCD. (2) Compared to the control, the growth of
lateral root could be significantly inhibited under the treatment DL-propargylglycine (PAG) (a H2S biosynthesis
inhibitor) and hypotaurine (HT) (a H2S scavenger), respectively. (3) Exogenous NO donor sodium nitroprusside
(SNP) could significantly induce the formation of lateral root. (4) PAG and HT could block the stimulating
effect of NO on lateral root formation. (5) Treatment with SNP could stimulate the expression of Sl_OASTL/
LCD in tomato (S. lycopersicum) root by RT-PCR analysis. These results suggested that NO promoted the
growth of tomato (S. lycopersicum) lateral root by inducing endogenous H2S.
Key words: Sl_OASTL/LCD; hydrogen sulfide; lateral root; tomato (Lycopersicon esculentum)
植物生理学报938
硫化氢(hydrogen sulfide, H2S)是生物体内新
发现的第三大气体信号分子(Wang 2010), 它参与
调控植物多种重要的内在生理过程(Zhang等2009;
Jin等2011; 侯智慧等2012; Liang等2012), 但关于植
物内源H2S的产生机制研究较少。现有研究表明,
高等植物中内源H2S主要由L-型半胱氨酸脱巯基
酶(L-cysteine desulfhydrase, LCD)和D-型半胱氨酸
脱巯基酶(D-cysteine desulfhydrase, DCD)两类蛋白
产生(Papenbrock等2007), 挖掘植物体内的H2S合成
酶基因工作也已相继展开(Riemenschneider等
2005; Papenbrock等2007; Alvarez等2010; Jin等
2011; Xie等2013)。研究发现油菜中H2S合成酶基
因BnDES1的表达受包括脱落酸(abscisic acid,
ABA)、赤霉素 (gibberel l in , GA)、吲哚乙酸
(indole-3-acetic acid, IAA)在内的多种植物激素调
控, 同时外源添加的一氧化氮(nitric oxide, NO)供
体硝普钠(sodium nitroprusside, SNP)和H2S供体硫
氢化钠(sodium hydrosulfide, NaHS)也会影响
BnDES1的表达(Xie等2013)。番茄中的DCD基因
已有报道(Papenbrock等2007; Alvarez等2010; Lisjak
等2013), 但其中的LCD基因一直未被发现。近期
研究报道拟南芥中某些O-乙酰丝氨酸(硫醇)裂解
酶[O-acetyl-serine(thiol)lyase gene, OASTL]具有
LCD活性(Alvarez等2010), 油菜中也发现了具有
LCD活性的OASTL蛋白, 且其基因BnDES1的表达
受包括NO在内的多种因素调控(Xie等2013)。
OASTLs是一类广泛存在于原核生物和真核生物
中具有高度保守性的蛋白, 具有催化O-乙酰丝氨
酸和硫反应产生半胱氨酸的作用 (Kumaran等
2009), 在植物细胞中广泛存在。根据实验室前期
研究结果, 番茄中很可能存在这种OASTL/LCD基
因, 并受NO调控表达, 具体机制需要进一步研究。
侧根是植物根系重要的组成部分, 它的生长
是遗传因子和内外因素等共同作用的结果(刘大同
等2013; 罗琎等2008; 王峰和邵敏2011等)。气体信
号分子NO在植物根系生长过程中起着重要作用,
NO可以通过蛋白激酶(Lanteri等2006; Liao等2012)
或血红素加氧酶(heme oxygenase, HO) (Chen等
2012)诱导植株侧根的生长, 也可以通过气体信号
分子一氧化碳(carbon monoxide, CO)诱导番茄幼
苗侧根发生(Guo等2008)。本实验室前期研究发现
H2S供体NaHS对于番茄幼苗侧根生长有很好的促
进作用, 初步证明H2S信号分子参与了番茄侧根生
长(徐庆宣等2013)。
番茄不但是重要的农艺作物, 也是研究双子
叶的模式植物之一。本文以番茄为供试植株, 首
次克隆到番茄的OASTL/LCD基因, 分析其结构功
能, 挖掘Sl_OASTL/LCD基因在NO和H2S促番茄幼
苗侧根生长中的重要作用, 为后续研究NO调控
H2S信号促进植物根系发育提供理论基础。
材料与方法
1 试剂和仪器
番茄(Solanum lycopersicum L.)品种‘苏红
2003’, 市售; NO供体硝普钠(sodium nitroprusside,
SNP)、亚牛磺酸(hypotaurine, HT)、DL-炔丙基甘
氨酸(DL-propargylglycine, PAG)购自Sigma公司;
克隆载体pMD19、DNase I、Tag DNA聚合酶、
DNA Markers、PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA
Synthesis Kit购自Takara公司、PCR Mix购自东盛
生物公司; 智能光照培养箱购自宁波江南仪器厂;
PCR仪(BIO-RAD, T100); 荧光显微镜(ECLIPSE,
TE2000-S, Nikon); 引物合成和测序委托英潍捷基
(上海)贸易有限公司进行。
2 植株培养
选取饱满的番茄种子经1.0%次氯酸钠消毒15
min后, 用蒸馏水冲洗4~5次, 于25 ℃黑暗中催芽,
待根长2 cm时挑选生长一致的番茄幼苗转移至用
5 mL处理液润湿的培养皿上, 于光照培养箱中培
养。光周期为16 h, 温度27 ℃, 每隔24 h更换一次
处理液。SNP处理液现配现用。处理浓度为0.2
mmol·L-1。PAG和HT配成100 mmol·L-1母液保存,
工作浓度为0.1 mmol·L-1 。每个处理10棵苗, 每个
处理3个重复。
3 番茄幼苗侧根数目统计
处理后3 d开始统计幼苗侧根数, 直到8 d。用
Excel和SPSS 12.0软件进行数据处理分析, 用t检验
进行显著性分析。
4 番茄OASTLs基因的克隆
取生长5 d的番茄幼苗根组织及萌发的种子、
番茄植株的茎、叶、花和角果组织提取总RNA,
按照TaKaRa PrimeScriptTM RT reagent 试剂盒说明
李艳军等: 番茄OASTL/LCD基因的克隆与表达及其对侧根生长的作用 939
书合成 cDNA, 4 ℃保存, 作为RT-PCR的模板。以
拟南芥DES1 (AT5G28030)基因序列为查询序列,
利用BlastN程序, 通过功能检索、同源比对、表达
序列标签(expressed sequence tags, ESTs)拼接, 从番
茄基因组数据库Sol genomics network (http://solge-
nomics.net)中获得相似性较高的3个OASTL基因,
根据序列设计全长特异性引物。引物序列分别为:
Sl_OASTL1-F: 5′-ATGGAAGAGAAGGATGA-
TATA G C G - 3 ′ ; S l _ O A S T L 1 - R : 5 ′ - T TA C T-
CAAAAGTCATGTTCATCACCT-3′; Sl_OASTL2-F:
5′-ATGGCATCTTTCATCAACAATCCCTT-3′; Sl_
OASTL2 -R: 5 ′ -TCACAATTCTGGCTTCAT-
GTTCTCG-3′; Sl_OASTL3-F: 5′-ATGGCGGGG-
GAAAAGACTGGAATTG-3′; Sl_OASTL3-R:
5′-TCAAGGCTCCACAGTCATGTTCTCT-3′。RT-
PCR反应体系及条件 : 25 μg·L -1模板1 μL, 10
μmol·L-1引物各1 μL, 超纯水9.5 μL, PCR Mix 12.5
μL。94 ℃预变性10 min; 94 ℃变性30 s; 50 ℃退火
30 s; 72 ℃延伸1 min; 72 ℃延伸10 min; 30个循
环。PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测, 于
凝胶成像系统下成像观察。
5 PCR产物回收、纯化、连接与转化
按照切胶回收试剂盒说明书进行PCR产物的
回收、连接与转化。将回收的DNA片段与载体
pMD19于16 ℃连接过夜。反应体系为10 μL, 其中
DNA片段7.5 μL, pMD19载体0.5 μL, Ligation Mix
2 μL。将DH5α感受态细胞50 μL在冰上解冻后加
入连接产物5 μL和LB培养基400 μL, 37 ℃振荡培
养2 h后取适量菌液, 涂布于含有50 μg·L-1的氨苄青
霉素(ampicillin, Amp)的LB固体培养基上, 过夜。
次日, 挑菌并置于37 ℃培养箱中振荡培养6~8 h。
进行菌液PCR, 反应体系和程序同前。反应结束后
取PCR产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳, 检测是
否有相应大小的条带, 随后将菌液送往英潍捷基
(上海)贸易有限公司进行测序, 剩余菌液加入适量
甘油置于–80 ℃保存。
6 Sl_OASTLs基因结构分析
将测序结果与番茄基因组数据库中获得序列
进行比对确认后, 在染色体上的定位, 分析外显子
内含子结构模式。使用NCBI的ORF Finder工具
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)对Sl_
OASTLs基因序列进行ORF预测, 并结合数据库中
已知的数据进行综合。使用PLACE工具 (http://
www.dna.affrc.go.jp/PLACE/) 对基因上游启动子
区域进行预测分析。
7 Sl_OASTLs氨基酸序列分析、同源比对和进化
分析
所得Sl_OASTLs的ORF序列经翻译后获得氨
基酸序列 , 通过NCBI在线Blast比对(邵西群等
2010), ClustalX 2.0分析、MegaAlign构建发育进
化树, 进行保守功能域和同源性分析(陈国忠等
2005)。
8 Sl_OASTL/LCD蛋白质结构预测与分析
通过ExPASy服务系统中的ProtParam (http://
web.expasy.org/protparam/)分析Sl_OASTL/LCD蛋
白的氨基酸组成及理化性质(Gasteiger等2005)。
采用PridectProtein (http://www.predictprotein.org/)
分析该蛋白质二级结构。采用ProtScale (http://
www.expasy.ch/cgi-bin/protscale.pl)分析该蛋白的
亲疏水性(Krogh等2001)。使用丹麦科技大学生物
序列分析中心(CBS)的TMHMM (http://www.cbs.
dtu.dk/services/TMHMM/) 进行该蛋白的跨膜结构
域预测(Horton等2006)。使用WoLF PSORT Predic-
tion (http://psort.hgc.jp/)对该蛋白进行胞内定位预
测(Marchler-Bauer等2011)。使用NCBI的Con-
served Domain Search进行蛋白保守结构域的预测
(Horton等2006)。使用ExPASy的PRosite (http://
prosite.expasy.org/)进行蛋白修饰位点的分析
(Marchler-Bauer等2011)。最后利用ExPASy系统的
蛋白质比较建模服务器SWISS-MODEL (http://
swissmodel.expasy.org) (Arnold等2006)通过Auto-
mated model对该蛋白质进行同源3D建模。
实验结果
1 Sl_OASTLs基因 与全长序列的克隆
从番茄基因组数据库中搜索得到3个OASTL
基因电子克隆序列, 基因编号分别为SGN- U5792-
81、SGN-U565167、SGN-U585413, 分别将其命
名为Sl_OASTL1、Sl_OASTL2、Sl_OASTL3 (表
1)。三个cDNA均含有合理的起始密码子和终止密
码子。ORF分析显示三个基因均含有完整编码的
ORF, 长度分别为972 bp、1 131 bp、978 bp (表1)。
植物生理学报940
以cDNA为模板, 用3对特异性引物进行PCR
扩增, 获得目的基因特异条带, 电泳结果如图1所
示, 电泳所获得的基因片段长度与在番茄基因组
数据库中检索到的3个OASTL基因大小相同。测序
结果与番茄基因组数据库中检索到的OASTL基因
序列进行比对, 比对结果显示, 从番茄中克隆到的
全长序列与从番茄基因组数据库中搜索到的电子
克隆序列100%匹配。
2 Sl_OASTLs基因结构分析
根据基因组序列显示的结果, Sl_OASTL1序列
DNA长度为4 554 bp (表 1), 由10个外显子和9个内
含子构成(图2-A)。Sl_OASTL2 DNA长度为7 286
bp (表1), 由10个外显子和9个内含子构成(图2-B)。
Sl_OASTL3 DNA长度为5 037 bp (表1), 由11个外
显子和10个内含子构成(图2-C)。
3 Sl_OASTLs氨基酸序列同源比对分析
将Sl_OASTLs的ORF编码区翻译成氨基酸
序列, 3个基因(Sl_OASTL1、Sl_OASTL2、Sl_
OASTL3)分别编码323、376和325个氨基酸。将这
3个蛋白质序列与已报道的拟南芥(Arabidopsis
thaliana)、油菜(Brassica napus)、青菜(Brassica
rapa)、印度芥菜(Brassica juncea) 中的OASTL和
LCD蛋白质序列进行多重比对分析显示: 它们的
相似性极高, 且都具有OASTL保守的功能结构域,
如典型的PLP结合位点、特异性底物半胱氨酸结
合位点、以及保守的SAT绑定互作位点(图3)。此
结果证明番茄中3个Sl_OASTL基因编码的蛋白质
属于OASTL家族。进一步的进化树分析显示, Sl_
OASTL1与拟南芥、青菜、油菜中的LCD亲缘关
系最近(图4)。因此我们推测Sl_OASTL1很可能也
具有LCD的功能, 因此将其命名为Sl_OASTL/LCD。
4 Sl_OASTL/LCD基因启动子区域分析
PLACE分析结果显示, Sl_OASTL/LCD基因上
游具有多个响应NO和植物激素调控的元件, 如与
bZIP转录因子结合的ACGT box、与MYBI转录
因子结合的 IBOX、与bHLH转录因子结合的
MYCL、与WRKY转录因子结合的W-BOX及生长
素响应因子ARFAT、生长素响应元件RYRE-
PEATBNNA和生长素/水杨酸响应因子ASFIMO-
TIFCAMV。
5 Sl_OASTLs/LCD蛋白结构的生物信息学预测与
分析
综合ProtParam和PridictProtein的分析结果, 显
示Sl_OASTL/LCD由323个氨基酸组成, 分子量为
表1 番茄基因组中三个OASTLs的基因特征
Table 1 The gene characteristics of three OASTLs from tomato genome
基因 基因编号 拼接EST数量 cDNA长度/bp ORF长度/bp DNA长度/bp 染色体
Sl_OASTL1 SGN-U579281 17 1 430 972 4 554 1
Sl_OASTL2 SGN-U565167 26 1 383 1 131 7 286 8
Sl_OASTL3 SGN-U585413 74 1 298 978 5 037 9
图1 番茄中OASTLs基因PCR扩增全长产物电泳图
Fig.1 Agarose gel electrophoretic analysis of PCR product of
three Sl_OASTLs genes in tomato
图2 番茄Sl_OASTLs基因结构
Fig.2 The gene structures of Sl_OASTLs in tomato
A: Sl_OASTL1; B: Sl_OASTL2; C: Sl_OASTL3; 黑色方块表示
外显子, 黑线表示内含子。
李艳军等: 番茄OASTL/LCD基因的克隆与表达及其对侧根生长的作用 941
图3 番茄OASTLs与其他植物中OASTL和LCD蛋白质序列多重比对
Fig.3 Multi-alignment of Sl_OASTLs with other OASTLs and LCDs from different plant species
图左At: 拟南芥(A. thaliana); Bn: 油菜(B. napus); Br: 白菜(B. rapa); Bj: 印度芥菜(B. juncea), 图4同此。图中●表示PLP结合位点; *表示
底物结合位点; 表示与SAT蛋白互作位点。
植物生理学报942
34.5 kDa; 从氨基酸组成上看, 出现了20种氨基酸,
丙氨酸(Ala)最多, 出现34次, 所占比例最高, 为
10.5%, 色氨酸(Trp)仅出现5次, 所占比例最小, 占
0.3%; 从氨基酸的类型来看, 负电荷的氨基酸残基
数 ( A s p + G l u )是3 9 , 正电荷的氨基酸残基数
(Arg+Lys)是33; 理论等电点即pI值为5.34; 脂肪系
数为 100.90, 表明其为脂溶性蛋白; 不稳定系数为
22.52, 表明该蛋白较稳定。总平均亲水性为 0.065,
该蛋白属于疏水性蛋白, 但疏水性不高。这与Pri-
dictProtein的分析结果吻合, 即溶剂可及性氨基酸
占43.96%。预测结果显示该蛋白无跨膜结构, 定
位于真核生物细胞质。
蛋白质二级结构预测发现Sl_OASTL/LCD中
α-螺旋和β-片层结构分别占37.77%和12.38%, 剩余
49.85%为环状结构; 内部无二硫键; PridictProtein
中的Gene Ontology分析显示此蛋白主要参与半胱
氨酸的生物合成和调控活性氧代谢。
对Sl_OASTL/LCD进行同源建模分析, 得到
该蛋白的3D模型(图5-A), QMEAN Z-score为–0.83
(图5-B), 表明了该3D模型构建具有较高的准确
性。该3D结构中包含的二级结构特征与Pridict-
Protein的预测结果基本吻合。NCBI中的Con-
served Domain Search保守结构域的预测显示, Sl_
OASTL/LCD属于半胱氨酸合成酶超家族。蛋白
修饰位点预测显示, Sl_OASTL/LCD在37~55位氨
基酸残基的位置存在一个磷酸化位点, 推测该蛋
白可能通过自身的磷酸化和去磷酸化反应结合底
物分子实现催化功能。
6 SNP处理对番茄幼苗侧根生长的影响
番茄幼苗处理后结果如图6, 发现未处理的幼
苗的平均侧根生长在5 d达到稳定, 且侧根数目维
持在5左右。与此同时, 0.2 mmol·L-1 SNP 处理的幼
苗的平均侧根数目从4 d开始就显著高于未处理组
的平均侧根数目, SNP处理的幼苗的平均侧根数在
6 d达到稳定, 侧根数目维持在11左右, 比对照组高
出45%左右。由于SNP作为NO的供体, 可以给植
株提供外源NO, 表明适当浓度的NO对番茄幼苗侧
根发生的影响有显著的时间效应。
7 PAG、HT、SNP+PAG处理对番茄幼苗侧根生
长的影响
用不同药剂处理番茄幼苗, 5 d后统计侧根数
图4 番茄OASTL与其他植物OASTL和LCD蛋白构建的进
化树
Fig.4 Phylogenetic relationship of Sl_OASTLs and its related
members of OASTL and LCD in plants
图5 SWISS-MODEL构建的Sl_OASTL/LCD蛋白质3D结构
Fig.5 The 3D structure of Sl_OASTL/LCD from SWISS-MODEL
李艳军等: 番茄OASTL/LCD基因的克隆与表达及其对侧根生长的作用 943
目。结果如图7, 分别是处理5 d后的侧根表型图及
侧根统计图, 如图所示, 处理5 d后, PAG和HT处理
组的侧根数目明显低于CK对照组, 而SNP处理组
的侧根数目则明显高于对照组; SNP处理1 d后更
换PAG处理, 4 d后侧根数目明显低于SNP处理组。
8 Sl_OASTL/LCD基因在番茄中的组织表达特征
及SNP处理对Sl_OASTL/LCD表达的影响
为了确定Sl_OASTL/LCD在番茄各组织中的
表达, 取萌发的种子、番茄根、茎、叶、花和角
果提取总RNA反转录合成的cDNA为模板, 用Sl_
OASTL/LCD基因的特异性引物进行PCR扩增, 获
得目的基因特异条带, 观察Sl_OASTL/LCD基因在
番茄各个组织中的表达情况。电泳结果如图8所
示, Sl_OASTL/LCD在萌发的种子、番茄根、茎、
叶、花中都有表达, 在角果中不表达, 且在萌发的
种子中表达量最高。
取SNP处理3 d的番茄幼苗根组织和对照组的
番茄幼苗根组织提取总RNA反转录合成的cDNA
为模板, 用Sl_OASTL/LCD基因的特异性引物进行
PCR扩增, 获得目的基因特异条带, 观察SNP处理
后对Sl_OASTL/LCD表达的影响。电泳结果如图9
所示, SNP处理的条带亮度明显强于对照组。表明
SNP处理后Sl_OASTL/LCD的表达上调。
图6 0.2 mmol·L-1 SNP处理影响番茄幼苗侧根生长的时间效应
Fig.6 The time-dependent effect of 0.2 mmol·L-1 SNP on the
growth of tomato lateral root
*表示处理和对照间差异显著(P<0.05)。
图7 不同药剂处理对番茄幼苗侧根生长的影响
Fig.7 The effect on tomato lateral root development under different chemical pharmacies
*表示处理和对照间差异显著(P<0.05), PAG和HT的处理浓度为0.1 mmol·L-1 , SNP的处理浓度为0.2 mmol·L-1。
图8 番茄各组织中Sl_OASTL/LCD的表达情况
Fig.8 Expression patterns of Sl_OASTL/LCD in various tissues of tomato
A: 电泳图, B: 电泳条带的平均光密度值统计图, 图9同此。
植物生理学报944
讨　　论
本文首次在番茄中克隆得到Sl_OASTL/LCD
基因, 发现NO很可能是通过上调Sl_OASTL/LCD基
因的表达, 促进了内源H2S的产生, 进而诱导番茄
幼苗侧根发生。
氨基酸序列同源分析表明Sl_OASTL/LCD具
有OASTL保守的功能结构域, 如典型的PLP结合位
点、特异性底物半胱氨酸结合位点、以及保守的
SAT绑定互作位点。进化树分析结果显示, Sl_
OASTL1与拟南芥、青菜、油菜中的LCD亲缘关
系最近, 与已报道的拟南芥中的编码具有OASTL
和LCD双重功能的LCD极为类似(Alvarez等2010),
因此推测Sl_OASTL/LCD基因属于一类LCD, 与番
茄中内源H2S的产生密切相关。
本文使用0.1 mmol·L-1 H2S清除剂HT和0.1
mmol·L-1 H2S合成抑制剂PAG明显抑制了番茄侧根
的生长, 说明内源H2S信号分子参与了侧根的发生,
使用0.2 mmol·L-1 NO供体SNP处理的番茄幼苗, 其
侧根数目显著高于对照, 进一步用SNP和PAG共同
处理番茄幼苗时, SNP的促侧根效应被减弱了, 同
时SNP处理后Sl_OASTL/LCD基因的表达也显著升
高, 推测外源供给NO通过上调Sl_OASTL/LCD的表
达促进了番茄幼苗侧根的数目。对Sl_OASTL/LCD
基因的上游启动子区域分析显示, 其含有特异性
的NO响应基序(AGCT box、IBOX、MYBS、
MYCL、W-BOX), 而有报道受NO调控的基因上
游启动子区域也含有这些特异性的NO响应基序
(Palmieri等2008; Gomez-Ros等2012), 另有报道证
实NO可通过调节H2S影响紫花苜蓿植株的某些生
理活动(Wang等2011; Li等2012), 结合本文试验结
果外源添加SNP诱导了番茄侧根中的Sl_OASTL/
LCD基因的表达上调, 因此推测NO很可能是通过
上调Sl_OASTL/LCD基因的表达, 促进了内源H2S
的产生, 进而诱导番茄幼苗侧根发生。
同时, 生长素和脱落酸在调控植物侧根发育以
及与NO信号互作研究已有明确报道(Guo等2008;
Duan等2013)。本文中Sl_OASTL/LCD基因的上游
启动子区域亦含有丰富的植物激素响应基序, 推测
Sl_OASTL/LCD基因在响应激素与NO的互作过程
中发挥重要作用, 具体机制有待于进一步研究。
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