全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (9): 885~892 885
收稿 2011-06-24　　修定 2011-07-14
资助 国家“863”项目(2006AA100109)和国家林业局“948”项目
(2006-4-C07)。
* 通讯作者(E-mail: wangyan@caf.ac.cn; Tel: 010-62888963)。
牡丹二氢黄酮醇4-还原酶基因PsDFR1的克隆及表达分析
周琳, 王雁*, 任磊, 彭镇华
中国林业科学研究院林业研究所, 国家林业局林木培育重点实验室, 北京100091
摘要: 二氢黄酮醇4-还原酶(DFR)是花色素苷合成途径中的关键酶, 在植物花色的形成过程中起重要作用。本研究以牡丹
品种‘彩绘’为试材, 采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹DFR基因cDNA全长, 命名为PsDFR1, GenBank登录
号为HQ283448。序列分析结果表明, PsDFR1全长1 242 bp, 包含一个长为1 095 bp的开放阅读框, 编码364个氨基酸。生物
信息学分析显示该基因编码的蛋白具有典型的DFR蛋白功能结构域, 包括多个保守的短链脱氢/还原酶家族的特征位点, 属
于NADB_Rossmann超家族。氨基酸序列比对和系统进化树分析表明, PsDFR1与葡萄、棉花、毛果杨、梨等植物的DFR
相似性都在75%以上。实时荧光定量PCR分析表明, PsDFR1在花色素大量积累的花瓣中表达量最高, 其次是萼片和雄蕊,
再次是叶片, 在心皮中表达量最低。
关键词: 牡丹; 二氢黄酮醇4-还原酶基因; 克隆; 表达
Cloning and Expression Analysis of Dihydroflavonol 4-Reductase Gene PsD-
FR1 from Tree Peony (Paeonia suffruticosa Andr.)
ZHOU Lin, WANG Yan∗, REN Lei, PENG Zhen-Hua
Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation, State Forestry Administration, Research Institute of Forestry, Chinese Academy
of Forestry, Beijing 100091, China
Abstract: Dihydroflavonol 4-reductase (DFR) is a key enzyme in the anthocyanin biosynthesis pathway, and
plays a critical role in flower pigmentation. In this study, a full-length cDNA sequence of DFR gene was ob-
tained from petals of tree peony (Paeonia suffruticosa ‘Cai Hui’) using RT-PCR and RACE, and named PsD-
FR1 (GenBank accession No. HQ283448). Sequence analysis indicated that PsDFR1 is 1 242 bp in full length
and has an open reading frame of 1 095 bp encoding a deduced polypeptide of 364 amino acids. Bioinformatic
analysis showed that PsDFR1 had the typical functional domains of DFR protein, containing most conserved
characteristic sites in short-chain dehydrogenase/reductase and belonging to the NADB_Rossmann superfamily.
Sequence alignment and phylogenetic analysis revealed that PsDFR1 shared more than 75% homology with
DFR from grape (Vitis vinifera), cotton (Gossypium hirsutum), Populus trichocarpa and pear (Pyrus commu-
nis). Quantitative RT-PCR analysis indicated that PsDFR1 showed the highest transcript abundance in anthocy-
anin-pigmented petals, moderate levels in sepals and stamens, low level in leaves and the lowest level in carpels.
Key words: tree peony (Paeonia suffruticosa); dihydroflavonol 4-reductase gene; cloning; expression
花色素苷是广泛存在于被子植物中的一类重
要的类黄酮化合物, 是植物花朵、叶片和果实中
红色、紫色和蓝色等色泽形成的物质基础(李美茹
等2003; Cooper-Driver 2001; Mol等1998)。二氢黄
酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase, DFR)是
花色素苷合成途径下游的第一个关键酶, 它以二
氢堪非醇(dihydrokaempferol, DHK)、二氢栎皮黄
酮(dihydroquercetin, DHQ)和二氢杨梅黄酮(dihy-
dromyricetin, DHM)为底物, 在辅因子NADPH的作
用下将4位的羰基还原为羟基, 产生相应的不稳定
无色花青苷元, 然后这些无色花青苷元在花色素
合酶(anthocyanidin synthase, ANS)和类黄酮3-O-糖
基转移酶(flavonoid 3-O-glucosyltransferase, 3GT)
的催化下分别形成矢车菊素(红色至粉色)、天竺
葵素(橙色至砖红色)和翠雀素(蓝色至紫色), 与花
色的产生直接相关(图1) (Tanaka等2008, 2005)。
研究表明, DFR是一个短链还原酶, 属于DFR
超家族(Martens等2002)。O’Reilly等(1985)采用转
植物生理学报886
座子标签技术首次从玉米和金鱼草中分离了DFR
基因。随后, 矮牵牛、拟南芥、非洲菊、香石竹
等多种植物DFR基因的克隆也相继报道, 并通过转
基因进行了功能研究 (李春雷等2009; 刘娟等
2005)。Meyer等(1987)将玉米DFR转入矮牵牛中,
获得了开砖红色花的转基因矮牵牛。A i d a等
(2000)将反义DFR基因导入夏堇, 发现转化株的花
色素苷合成减少, 黄酮和黄酮醇(辅助色素)含量显
著提高, 最终使花朵呈现蓝色。Seitz等(2007)在利
用RNAi抑制了内源类黄酮3′,5′-羟基化酶(fla-
vonoid 3′,5′-hydroxylase, F3′5′H)活性的蓝眼菊中导
入了非洲菊或草莓的DFR, 最终使花色变红。
牡丹是我国传统名花中的精品, 具有极高的
观赏价值和经济价值。目前, 从化学水平上对牡
丹花色素组成的研究已较为深入(Li等2009; 张晶
晶等2006), 但在分子水平上对其花色形成机制的
研究还鲜有报道。本试验以红色品种‘彩绘’为试
材, 从花瓣中克隆了牡丹DFR基因的cDNA全长,
命名为PsDFR1, 并对其编码蛋白的结构特征及其
在不同器官中的表达特性进行了分析, 为进一步
研究PsDFR1基因功能、探讨牡丹花色形成的分子
机制提供理论依据和基础数据。
材料与方法
1 材料与试剂
试验材料为红色系牡丹品种‘彩绘’ (Paeonia
suffruticosa Andr. ‘Cai Hui’), 于花蕾透色期(Zhou
等2011; 袁涛等2004)采收自中国林科院北京良乡
基地, 1 h内运回实验室。短暂复水后, 分别取下叶
片、萼片、花瓣、雄蕊和心皮, 锡箔纸包好后立
即用液氮速冻, 存于−80 ℃冰箱备用。
总RNA提取所用药品均购自北京拜尔迪生物
公司; M-MLV反转录酶和克隆载体pGEM-T easy
为Promega公司产品; Taq DNA聚合酶、DNA凝胶
回收试剂盒、T4 DNA连接酶、大肠杆菌TOP10感
受态细胞、质粒DNA提取试剂盒和DNase I酶等
购自天根生化科技(北京)有限公司; SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit购自Clontech公司;
限制性内切酶和荧光定量试剂盒SYBR Prime-
ScriptTM RT-PCR Kit购自TaKaRa公司; 所用引物由
北京奥科生物公司合成。
2 PsDFR1基因cDNA全长的克隆
采用改进的CTAB法(孟丽等2006)提取花瓣总
RNA。根据GenBank中登录的DFR保守氨基酸序
列设计一对简并引物DFR-F和DFR-R (表1), 以
图1 花色素苷的生物合成途径
Fig.1 The biosynthetic pathway of anthocyanin
CHS: 查耳酮合酶(chalcone synthase); CHI: 查耳酮异构酶
(chalcone isomerase); F3H: 黄烷酮3-羟基化酶(flavanone 3-hydrox-
ylase); F3′H: 类黄酮3′-羟基化酶(flavonoid 3′-hydroxylase); F3′5′H:
类黄酮3′,5′-羟基化酶(flavonoid 3′,5′-hydroxylase)。
表1 牡丹DFR基因的克隆及表达分析所用引物
Table 1 Primers used to isolate and analyze the expression of DFR gene in tree peony
引物名称 引物序列(5→3) 用途
DFR-F C(G/C)AAGGA(C/T)CC(C/T)GAGAA(C/T)GA(A/G)GTG 扩增保守片段
DFR-R (A/G)GCA(A/T)A(C/T)TTCCA(C/T)GC(A/C)(G/T)CTTG
PsDFR1-3GSP TCGGTGTATGATGAAACCTGCTGGAGTG 3 RACE
PsDFR1-5GSP TTGCTCAGCCAGGATCTTGGACACGA 5 RACE
PsDFR1-F ATGGAAGCAGTGACCGAGTG 扩增cDNA全长
PsDFR1-R TTAGATTGTATCATTAACATGGTTTC
P1 TTCATCGGTTCATGGCTTGTC 检测PsDFR1的表达
P2 AATGGGTATCCGCTTTTGGC
Tub-F TGAGCACCAAAGAAGTGGACGAAC 扩增内参
Tub-R CACACGCCTGAACATCTCCTGAA
周琳等: 牡丹二氢黄酮醇4-还原酶基因PsDFR1的克隆及表达分析 887
DNase I酶(RNase free)消化处理后的RNA反转录
产物cDNA第一链为模板进行PCR扩增。反应体
系为25 μL, 扩增条件为: 94 ℃预变性3 min; 94 ℃
变性1 min, 58 ℃退火1 min, 72 ℃延伸40 s, 共30个
循环; 最后72 ℃延伸7 min。PCR产物经1.2%琼脂
糖凝胶电泳检测后, 凝胶回收与预期片段大小一
致(250 bp左右)的泳带, 连接克隆载体pGEM-T
easy并转化大肠杆菌TOP10感受态细胞, 通过蓝白
斑筛选及菌液PCR和质粒酶切鉴定阳性克隆后, 委
托北京奥科生物公司进行序列测定。
根据已获得的牡丹DFR基因的中间序列, 分
别设计3 RACE和5 RACE特异引物PsDFR1-3GSP
和PsDFR1-5GSP (表1), 按照试剂盒SMARTTM
RACE cDNA Amplification Kit说明书进行cDNA末
端快速扩增。反应体系为50 μL, 扩增方法采用
Touchdown PCR程序, 回收目的片段并测序。将获
得的片段进行拼接后设计全长引物PsDFR1-F和
PsDFR1-R (表1), 经PCR并测序后获得牡丹DFR基
因的cDNA全长序列。
3 PsDFR1蛋白的生物信息学分析
测序结果在GenBank中进行Blastp分析; 采用
在线软件ProtParam (http://www.expasy.org)预测所
编码蛋白的分子量、理论等电点及保守结构域等;
运用在线工具ProtScale、Tmpred、SignalP 3.0、
PSORT和NetPhos 2.0对其蛋白质亲水/疏水性、跨
膜结构域、信号肽、亚细胞定位和磷酸化位点进
行预测分析 ; 通过SOPMA和SWISS-MODEL
Workspace对蛋白质序列分别进行二级结构和三级
结构预测; 采用DNAMAN软件进行多序列比对及
系统进化分析。
4 PsDFR1基因的表达分析
分别提取‘彩绘’叶片、萼片、花瓣、雄蕊和
心皮等器官的总RNA, 用DNase I酶(RNase free)消
化基因组DNA后, 各取1 μg为模板, 反转录合成
cDNA第一链。按照荧光定量PCR引物设计原则,
分别以牡丹β-微管蛋白基因β-Tubulin (GenBank登
录号EF608942)和PsDFR1基因为基础设计内参引
物Tub-F、Tub-R和特异引物P1、P2 (表1)进行荧光
定量PCR。反应在ABI 7500实时定量PCR仪上进
行, 方法参照《美国应用生物系统公司7300/7500
实时定量PCR仪相对定量实验入门指南》和荧光
定量试剂盒SYBR PrimeScriptTM RT-PCR Kit (Ta-
KaRa)说明书。荧光定量PCR扩增的反应体系为20
µL。用两步法标准程序: 95 ℃预变性30 s, 95 ℃变
性5 s, 60 ℃复性34 s, 共40个循环。每个试验设3
次重复, 采用ABI 7500 PCR仪Sequence Detection
Software (2−ΔΔCT法) (Livak和Schmittgen 2001)和
Excel软件进行数据分析。
实验结果
1 PsDFR1基因cDNA全长的克隆及序列分析
根据已知的其他物种DFR氨基酸保守序列,
设计一对简并引物DFR-F和DFR-R (表1), 以‘彩绘’
透色期花瓣总RNA反转录所得的cDNA为模板, 通
过PCR扩增及序列测定, 获得一条长为261 bp的预
期片段(图2-A)。Blastx分析发现, 该片段编码的氨
图2 牡丹PsDFR1基因的PCR扩增电泳分析
Fig.2 Agarose gel electrophoresis analysis of PsDFR1 gene fragments in tree peony
A: 泳道1为用简并引物进行RT-PCR获得的中间片段; B: 泳道1为5 RACE扩增产物, 泳道2为3 RACE扩增产物; C: 泳道1为PsDFR1
cDNA全长扩增产物。M: DNA标准分子量DL2000。
植物生理学报888
基酸序列与多种植物的DFR蛋白同源, 其中与毛果
杨的DFR (GenBank登录号XP_002307667)同源性
最高, 为80%。
根据所得的中间片段设计末端扩增特异引物
PsDFR1-3GSP和PsDFR1-5GSP (表1), 经RACE扩
增和序列分析, 分别得到长度为590 bp的5末端和
755 bp的3末端(图2-B)。将RT-PCR和RACE-PCR
的扩增片段进行序列拼接, 在此基础上设计一对
全长引物PsDFR1-F和PsDFR1-R (表1), 经PCR扩
增后得到牡丹DFR基因的cDNA全长(图2-C)。
Blastn比对发现, 该cDNA序列与DFR基因同源, 命
名为PsDFR1, GenBank登录号为HQ283448。
利用NCBI提供的ORF Finder进行分析发现,
PsDFR1全长1 242 bp, 包含一个长度为58 bp的5非
翻译区、89 bp的3非翻译区[含poly(A)尾]和一个
长1 095 bp编码364个氨基酸的开放阅读框(图3-
图3 PsDFR1基因cDNA全长和推导的氨基酸序列及序列特征
Fig.3 Complete cDNA and deduced amino acid sequences of PsDFR1 and its sequence character
A: PsDFR1基因cDNA全长及其推导的氨基酸序列。起始密码子ATG和终止密码子TAA加粗显示。与NADPH结合的保守基序
(V12~Y34)用下划线表示; 26个氨基酸组成的底物特异结合的保守基序(T135~K160)用双下划线表示, 其中完全保守不变位点用灰色背景
表示, 与底物催化特异性相关的位点用方框表示。B: PsDFR1基因保守结构域。蛋白序列上的数字表示组成PsDFR1蛋白的氨基酸序号;
三角表示保守的NADPH结合位点及与底物催化特异性相关的位点。
周琳等: 牡丹二氢黄酮醇4-还原酶基因PsDFR1的克隆及表达分析 889
A)。ProtParam预测其编码蛋白的分子量为40.97
kDa, 理论等电点(pI)为5.67。
2 PsDFR1编码蛋白的生物信息学分析
2.1 PsDFR1编码蛋白的保守域和功能位点分析
利用NCBI的Blastp对PsDFR1基因编码的蛋
白进行保守区预测发现, PsDFR1编码的氨基酸序
列具有典型的DFR蛋白(PLN0650)功能结构域, 包
括多个短链脱氢/还原酶(SDR)家族的特征位点, 属
于NADB_Rossmann超家族(cl09931) (图3-B)。
功能位点分析(图3-A)发现, PsDFR1的N端含
有一个与NADPH结合的保守基序(V12~Y34)
(Johnson等1999)和一个由26个氨基酸组成的底物
特异结合的保守基序(T135~K160), 其中N137和
E149直接影响DFR的底物特异性, Q143、Y147、
D154和F157非常保守(Johoson等2001)。这些位点
在结构和功能均己知的葡萄VvDFR (GenBank登
录号CAA72420)和其他DFR蛋白中都存在, 而且都
在相同或相近的位置, 从而进一步推断PsDFR1属
于NADPH依赖的还原酶家族中的DFR。
2.2 PsDFR1编码蛋白的结构特征
利用ProtScale分析发现, PsDFR1编码的蛋白
在28~54区和204~241区各存在1个疏水域。同时,
运用Tmpred程序对该蛋白的跨膜结构进行预测发
现, 在32~50区和210~231区存在2个跨膜区, 分别
位于上述预测确认的疏水域中。蛋白质序列含有
跨膜区提示它可能作为膜受体起作用, 也可能是
定位于膜的锚定蛋白或离子通道蛋白。
进行信号肽及蛋白质亚细胞定位的预测有助
于了解蛋白质发挥功能的区域。使用SignalP 3.0
预测显示, PsDFR1编码的蛋白不具有信号肽, 说明
PsDFR1不是一个分泌蛋白。利用PSORT程序对
PsDFR1蛋白进行细胞定位的预测, 表明该蛋白定
位于质膜。通过NetPhos 2.0分析发现, PsDFR1蛋
白有10个Ser磷酸化位点、9个Thr磷酸化位点和4
个Tyr磷酸化位点, 推测PsDFR1蛋白生物活性的可
逆磷酸化调控机制十分复杂。
采用SOPMA程序对PsDFR1蛋白的二级结构
进行预测 , 结果显示该蛋白二级结构主要由
40.10%的随机卷曲(random coil)和38.54%的α-螺
旋(α-helix)组成, 另外还有13.8%的延伸链(extend
strand)和7.55%的β-折叠(β-turn) (图4-A)。用
SWISS-MODEL对PsDFR1蛋白进行三级结构的同
源建模, 结果表明, 其模型相似度与已知结构和功
能的葡萄VvDFR蛋白(2c29F) (Petit等2007)达到
83.23% (图4-B和C)。
2.3 PsDFR1蛋白序列的相似性比较和系统进化树
分析
利用Blastp对PsDFR1编码的氨基酸序列进行
图4 PsDFR1编码蛋白的结构预测
Fig.4 The structure predict of PsDFR1 protein
A: PsDFR1编码蛋白的二级结构预测。α为α-螺旋; β为β-折叠; E为延伸链; R为随机卷曲。B: 预测的PsDFR1蛋白三级结构。C:
VvDFR蛋白三级结构(Petit等2007)。
植物生理学报890
同源检索表明, PsDFR1与葡萄(XP_002281858)和
山葡萄(ACN82380)的DFR同源性最高, 都为82%;
其次, 与棉花(ABM64800)、毛果杨(XP_002307667)、
梨(AAO39818)和拟南芥(CAP08813)的DFR同源性
分别为80%、79%、76%和75%。通过DNAMAN
软件将PsDFR1与目前已发表的DFR氨基酸序列共
7条进行了多重比对, 结果如图5。
为进一步了解PsDFR1与其他植物DFR之间的
进化关系, 在GenBank中选择部分DFR氨基酸序列
利用DNAMAN软件构建了系统进化树, 结果表明,
图5 PsDFR1与其他物种DFR的氨基酸序列比对
Fig.5 Alignment of predicted amino acid sequence of PsDFR1 with other DFR proteins
方框处表示保守的NADPH结合基序; 下划线表示底物催化结合的保守基序。PtDFR: 毛果杨(Populus trichocarpa), XP_002307667;
MdDFR: 苹果(Malus × domestica), AAO39816; PcDFR: 梨(Pyrus communis), AAO39818; RhDFR: 月季(Rosa hybrid), BAA12723; CsDFR: 山
茶(Camellia sinensis), BAA84939; GhDFR: 棉花(Gossypium hirsutum), ABM64800。
PsDFR1的进化基本符合植物分类学分类, 并具有明
显的种属特性, 如同属蔷薇科的苹果(AAO-39816)、
梨(AAO39818)和月季(BAA12723)组成一个分支,
PsDFR1与棉花(ABM64800)、甜橙(AAS00611)和
毛果杨(XP_002307667)的DFR亲缘关系较近, 聚类
为同一簇, 而与菊花(ABK88311)的DFR亲缘关系
较远(图6)。
3 PsDFR1的器官特异性表达分析
以‘彩绘’透色期的花瓣、叶片、萼片、雄蕊
和心皮5个不同器官中提取的总RNA反转录而来
周琳等: 牡丹二氢黄酮醇4-还原酶基因PsDFR1的克隆及表达分析 891
的cDNA为模板 , 以GenBank中检索到的牡丹
β-Tubulin基因为内参照, 采用荧光定量PCR的方法
对这些器官中PsDFR1的表达差异进行了检测。反
应所得的熔解曲线峰值单一, β-Tubulin和PsDFR1
的Tm值分别为88和85
℃, 表明所用引物具有高度
特异性, 试验数据能够较准确地反映出PsDFR1的
相对表达量。
以表达丰度最低的心皮中的表达量为“1”进
行作图可见, PsDFR1在牡丹花瓣、叶片、萼片、
雄蕊和心皮中均有表达, 但表达水平有明显差异,
其中在花色素大量积累的花瓣中表达量最高, 其
次为萼片和雄蕊, 再次为叶片, 心皮中最低(图7)。
从相对表达量来看, PsDFR1在花瓣中的表达量为
萼片和雄蕊中的4~7倍, 心皮中的280多倍。
讨　　论
本研究从牡丹花瓣中克隆了DFR的同源基因
PsDFR1, 生物信息学分析发现其编码的蛋白质具
有典型的DFR蛋白功能结构域, 包括一个NADPH
结合的保守基序“VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY”
(Johnson等1999), 一个由26个氨基酸组成的底物特
异选择性结构域(T135~K160) (Polashock等2002),
以及多个保守的短链脱氢/还原酶家族的特征位点
(Martens等2002)。Johnson等(2001)发现, 底物结合
区中的134位与145位的氨基酸可直接影响酶的底
物特异性, 大多数物种在134位含有D (天冬氨酸)
或N (天冬酰胺)。本研究中PsDFR1编码蛋白的相
应位点是N, 推测它可能以DHQ或DHK为底物催
化生成无色矢车菊素和无色天竺葵素, 这与红色
系牡丹花瓣中花色素苷主要成分属于天竺葵素、
矢车菊素和芍药花素相一致。根据PsDFR1蛋白三
级结构的预测结果和系统进化树分析发现, 其模
型相似度与已知结构和功能的葡萄VvDFR蛋白达
到83.23%, 氨基酸序列与葡萄科、蔷薇科、杨柳
科等植物的DFR相似性都在75%以上, 进一步证明
分离得到的PsDFR1具有DFR蛋白典型的结构特征
和生物特性。
对DFR基因时空表达的大量研究表明, 不同
物种中DFR的器官特异性表达模式各有不同。Xie
等(2004)通过Northern blot分析发现, 苜蓿MtDFR1
和MtDFR2分别在刚成熟的种子和花瓣中表达量
最高, 且在叶片中只有MtDFR1的表达, 与其花色
素的积累相一致。Shimada等(2005)采用半定量的
方法对百脉根中5个DFR基因的表达差异进行分析
发现, DFR1在豆荚、花、根、茎、叶和结节中都
表达; DFR2在除叶以外的其他部位表达; DFR3只
在茎和叶表达; DFR4和DFR5除不在结节中表达
外, 在其他部位都表达, 其中在根中较弱。本研究
中PsDFR1在牡丹花瓣、叶片、萼片、雄蕊和心皮
中均有表达, 但不同器官间的表达差异十分显著,
其中在花色素大量积累的花瓣中表达最丰富, 几
乎达到表达量最低的心皮中的300倍, 说明PsDFR1
的表达具有一定的器官特异性, 且表达量的高低
与花色素的积累相关, 推测PsDFR1可能在转录水
平上参与了牡丹花色形成的分子调控。相似的结
果在亚洲百合(Nakatsuka等2003)和龙胆(Nakatsuka
图6 牡丹PsDFR1与其他物种DFR蛋白的系统进化树分析
Fig.6 Phylogenetic tree analysis of the PsDFR1 in tree peony
and DFR proteins from other species
图7 不同器官中PsDFR1基因的相对表达量
Fig.7 Relative quantity of PsDFR1 expression
in different organs
植物生理学报892
等2005)等植物中也有报道。
DFR是花色素苷合成途径中后期表达的第一
个关键酶, 通过导入新基因、共抑制、反抑制或
RNAi等方法调节DFR基因的表达, 从而引起花色
苷含量或成分的变化, 不仅有助于明确DFR基因的
功能, 而且还可以实现花色的分子改良, 因此, 本
实验室下一步拟通过转基因技术对PsDFR1进行功
能分析, 从而进一步阐明DFR基因在牡丹花色形成
过程中的作用机制。
参考文献
李春雷, 崔国新, 许志茹, 李玉花(2009). 植物二氢黄酮醇4-还原酶
基因的研究进展. 生物技术通讯, 20 (3): 442~445
李美茹, 李洪清, 孙梓健, 陈贻竹(2003). 影响蓝色花着色的因素. 植
物生理学通讯, 39 (1): 51~55
刘娟, 冯群芳, 张杰(2005). 二氢黄酮醇4-还原酶基因(DFR)与花色
的修饰. 植物生理学通讯, 41 (6): 715~719
孟丽, 周琳, 张明姝, 戴思兰(2006). 一种有效的花瓣总RNA的提取
方法. 生物技术, 16 (1): 38~40
袁涛, 赵孝之, 李丰刚, 赵卫(2004). 牡丹. 北京: 中国林业出版社,
127~132
张晶晶, 王亮生, 刘政安, 李崇晖(2006). 牡丹花色研究进展. 园艺学
报, 33 (6): 1383~1388
Aida R, Yoshida K, Kondo T, Kishimoto S, Shibata M (2000). Copig-
mentation gives bluer flowers on transgenic torenia plants with
the antisense dihydroflavonol 4-reductase gene. Plant Sci, 160:
49~56
Cooper-Driver GA (2001). Contributions of Jeffrey Harborne and co-
workers to the study of anthocyanins. Phytochemistry, 56 (3):
229~236
Johnson ET, Ryu S, Yi H, Shin B, Cheong H, Choi G (2001). Altera-
tion of a single amino acid changes the substrate specificity of
dihydroflavonol 4-reductase. Plant J, 25 (3): 325~333
Johnson ET, Yi H, Shin B, Oh BJ, Cheong H, Choi G (1999). Cym-
bidium hybrida dihydroflavonol 4-reductase does not efficiently
reduce dihydrokaempferol to produce pelargonidin-type antho-
cyanins. Plant J, 19 (1): 81~85
Li C, Du H, Wang L, Shu Q, Zheng Y, Xu Y, Zhang J, Zhang J, Yang
R, Ge Y (2009). Flavonoid composition and antioxidant activity
of tree peony (Paeonia section Moutan) yellow flowers. J Agric
Food Chem, 57: 8496~8503
Livak KJ, Schmittgen TD (2001). Analysis of relative gene expression
data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT method.
Methods, 25: 402~408
Martens S, Teeri T, Forkmann G (2002). Heterologous expression of
dihydroflavonol 4-reductases from various plants. FEBS Lett,
531 (3): 453~458
Meyer P, Heidmann I, Forkmann G, Saedler H (1987). A new petunia
flower color generated by transformation of a mutant with a
maize gene. Nature, 330: 677~678
Mol J, Grotewold E, Koes R (1998). How genes paint flowers and
seeds. Trends Plant Sci, 3 (6): 212~217
Nakatsuka A, Izumi Y, Yamagishi M (2003). Spatial and temporal
expression of chalcone synthase and dihydroflavonol 4-reductase
genes in the Asiatic hybrid lily. Plant Sci, 165: 759~767
Nakatsuka T, Nishihara M, Mishiba K, Yamamura S (2005). Tempo-
ral expression of flavonoid biosynthesis related genes regulates
flower pigmentation in gentian plants. Plant Sci, 168: 1309~1318
O’Reilly C, Shepherd NS, Pereira A, Schwarz-Sommer Z, Bertram I,
Robertson DS, Peterson PA, Saedler H (1985). Molecular clon-
ing of the a1 locus of Zea mays using the transposable elements
En and Mu1. EMBO J, 4 (4): 877~882
Petit P, Granier T, d’Estaintot BL, Manigand C, Bathany K, Schmitter
JM, Lauvergeat V, Hamdi S, Gallois B (2007). Crystal structure
of grape dihydroflavonol 4-reductase, a key enzyme in flavonoid
biosynthesis. J Mol Biol, 368: 1345~1357
Polashock JJ, Griesbach RJ, Sullivan RF, Vorsa N (2002). Cloning
of a cDNA encoding the cranberry dihydroflavonol 4-reductase
(DFR) and expression in transgenic tobacco. Plant Sci, 163 (2):
241~251
Seitz C, Vitten M, Steinbach P, Hartl S, Hirsche J, Rathje W, Treutter
D, Forkmann G (2007). Redirection of anthocyanin synthesis in
Osteospermum hybrida by a two-enzyme manipulation strategy.
Phytochemistry, 68: 824~833
Shimada N, Sasaki R, Sato S, Kaneko T, Tabata S, Tabata S, Aoki
T, Ayabe S (2005). A comprehensive analysis of six dihydro-
flavonol 4-reductases encoded by a gene cluster of the Lotus
japonicus genome. J Exp Bot, 56 (419): 2573~2585
Tanaka Y, Katsumoto Y, Brugliera F, Mason J (2005). Genetic engi-
neering in floriculture. Plant Cell Tiss Org, 80: 1~24
Tanaka Y, Sasaki N, Ohmiya A (2008). Biosynthesis of plant pig-
ments: anthocyanins, betalains and carotenoids. Plant J, 54:
733~749
Xie DY, Jackson LA, Cooper JD, Ferreira D, Paiva NL (2004). Mo-
lecular and biochemical analysis of two cDNA clones encoding
dihydroflavonol-4-reductase from Medicago truncatula. Plant
Physiol, 134: 979~994
Zhou L, Wang Y, Peng ZH (2011). Molecular characterization and ex-
pression analysis of chalcone synthase gene during flower devel-
opment in tree peony (Paeonia suffruticosa). Afr J Biotechnol,
10 (8): 1275~1284