全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (5): 521~524 521
收稿 2011-01-17 修定 2011-03-16
* 通讯作者(E-mail: yaoyuanjane9296@sina.com; Tel: 024-
88487093)。
植物生理学实验中一类偶氮化合物的分光光度检测
刘少霞1, 陈贵1, 秦萍1, 姚远2,*
沈阳农业大学1生物科学技术学院, 2科技开发公司, 沈阳110866
摘要: 偶氮化合物在可见光特定波长下有最大吸收峰, 但对这一特定波长认定目前仍不统一。本试验利用分光光度计法测
定了偶氮化合物的特定吸收峰。结果表明: NO2
-、对氨基苯磺酸(或磺胺)及α-萘胺在酸性条件下形成偶氮化合物特定吸收
峰在A520 nm处, 并非A510 nm、A530 nm或A540 nm。
关键词: 偶氮化合物; 吸光度; 磺胺; 对氨基苯磺酸; α-萘胺
Detection of a Kind of Azo Compound in Plant Physiology Experiment by Spectro-
photometer
LIU Shao-Xia1, CHEN Gui1, QIN Ping1, YAO Yuan2,*
1College of Biological Sciences and Biotechnology, 2Company of Sciences Technique and Development, Shenyang Agricultural
University, Shenyang 110866, China
Abstract: It has been known that the absorption peak of azo compound will be observed under specified
wavelength of visible light. However, the specified wavelength is inconsistent in different references to data.
The visible absorption peak of azo compound was determined by spectrophotometry in this paper. The azo
compound was generated by using the combination of naphthylamine with aminobenzene sulfonic acid, or
sulfanilamide. The result shows that the absorption peak of azo compound is in A520 nm, rather than in A510 nm, A530 nm or
A540 nm which are often used in the references.
Key words: azo compound; absorption; sulfanilamide; aminobenzene sulfonic acid; naphthylamine
当研究植物氮素代谢时, 通常要测定硝酸还
原酶活性。硝酸还原酶在植物体内催化NO3
-使其
还原成NO2
-, NO2
-可从植物体内渗透到体外。然后
根据NO2
-与对氨基苯磺酸(或磺胺)在酸性条件下
生成重氮化合物, 重氮化合物和α-萘胺反应, 形成
稳定的红色偶氮化合物(对-苯磺酸-偶氮-α-萘胺)
(图1)。
偶氮化合物在可见光特定波长下有最大吸收
峰, 可用分光光度计来检测, 进而计算出硝酸还原
酶活性。李合生(2004)书中指出在540 nm处有最
大吸收峰 ; 而张志良和瞿伟菁(2004)、赵亚华
(2005)实验指导书中则为520 nm; 另在萧浪涛和王
三根(2005)书中用上述原理同样试剂测定植物根
系活力和植物体内氧自由基的测定和清除时, 分
别指出510 nm和530 nm为吸收峰。我们集几种对
图1 偶氮化合物生成反应式
Fig.1 The reaction equation of azo compounds
本实验有关试剂配制方法, 在同等条件下进行了
吸光度(A)的检验。
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学报522
材料与方法
1 试剂配制
本试验所用试剂及其配制方法见表1。
2 反应体系
对氨基苯磺酸与α-萘胺以及磺胺与α-萘胺组
合的反应体系见表2、3。在表2、3的8种体系组
合中, 分别取表1中的10 mg·mL-1对氨基苯磺酸(或
10 mg·mL-1磺胺) 4 mL、2 mg·mL-1 α-萘胺4 mL、5
µg·mL-1 NaNO2 0.4 mL, 蒸馏水1.6 mL, 使总反应体
系为10 mL。此时反应体系内的对氨基苯磺酸(或
磺胺 )浓度为 4 m g · m L - 1、α -萘胺浓度为 0 . 8
mg·mL-1、NaNO2浓度为0.2 µg·mL
-1。
为一测点, 以作吸收峰精细检测。
结果与讨论
1 对氨基苯磺酸与α-萘胺组合反应体系生成偶氮
化合物的吸光度检测
在表2体系组合中, 使用上海尤尼柯仪器有限
公司生产的分光光度计(UV-2000)测定, 在相同条
表1 试剂配制
Table 1 The mixtures of reagent
试剂 配制法 配制过程
10 mg·mL-1对氨基苯磺酸溶液 盐酸溶解法 取1 g对氨基苯磺酸加25 mL浓盐酸溶解后加水定容至100 mL。
乙酸溶解法 取1 g对氨基苯磺酸加30%乙酸25 mL溶解后加水定容至100 mL。
10 mg·mL-1磺胺溶液 盐酸溶解法 取1 g磺胺加25 mL浓盐酸溶解后加水定容至100 mL。
乙酸溶解法 取1 g磺胺加30%乙酸25 mL溶解后加水定容至100 mL。
2 mg·mL-1 α-萘胺溶液 盐酸溶解法 取0.2 g α-萘胺加25 mL浓盐酸溶解后加水定容至100 mL。
乙酸溶解法 取0.2 g α-萘胺加30%乙酸25 mL溶解后加水定容至100 mL。
乙醇溶解法 取0.2 g α-萘胺用95%乙醇2 mL溶解后加水定容至100 mL。
5 µg·mL-1 NaNO2水溶液 取1 g NaNO2溶于1 L蒸馏水, 然后取5 mL加水稀释至1 L。
100 mmol·L-1对氨基苯磺酸溶液 盐酸溶解法 取1 730 mg对氨基苯磺酸加25 mL浓盐酸溶解后加水定容至100 mL。
乙酸溶解法 取1 730 mg对氨基苯磺酸加30%乙酸25 mL溶解后加水定容至100 mL。
100 mmol·L-1磺胺溶液 盐酸溶解法 取1 720 mg磺胺加25 mL浓盐酸溶解后加水定容至100 mL。
乙酸溶解法 取1 720 mg磺胺加30%乙酸25 mL溶解后加水定容至100 mL。
10 mmol·L-1 α-萘胺溶液 盐酸溶解法 取0.143 g的α-萘胺用25 mL浓盐酸溶解后加水定容至100 mL。
乙酸溶解法 取0.143 g的α-萘胺用30%乙酸25 mL溶解后加水定容至100 mL。
10 mg·mL-1对氨基苯磺酸溶液、10 mg·mL-1磺胺溶液、2 mg·mL-1 α-萘胺溶液和5 µg·mL-1 NaNO2水溶液用于继续配制反应体系中各组
分。100 mmol·L-1对氨基苯磺酸溶液、100 mmol·L-1磺胺溶液和10 mmol·L-1 α-萘胺溶液用于进一步配制不同浓度的处理。
表2 对氨基苯磺酸与α-萘胺组合的反应体系
Table 2 Combination composition of aminobenzene sulfonic
acid and naphthylamine
体系组合
编号 4 mg·mL-1对氨基苯磺酸 0.8 mg·mL-1 α-萘胺
浓盐酸 乙酸 乙酸 浓盐酸 乙醇
1 + – + – –
2 – + + – –
3 + – – + –
4 – + – – +
“+”表示此试剂参与反应, “-”表示此试剂未参与反应, 下表同。
表3 磺胺与α-萘胺组合的反应体系
Table 3 Combination composition of sulfanilamide
and naphthylamine
体系组合
编号 4 mg·mL-1磺胺 0.8 mg·mL-1 α-萘胺
浓盐酸 乙酸 乙酸 浓盐酸
1 + – – +
2 + – + –
3 – + – +
4 – + + –
3 反应条件
上述反应体系在30 ℃水浴30 min后, 用上海
尤尼柯仪器有限公司生产的分光光度计(UV-2000)
和山东高密采虹分析仪器有限公司生产的紫外光
栅分光光度计(752)比较检测吸光度(A500~560 nm), 每
隔10 nm为一测点, 并在特殊吸收峰附近每隔2 nm
刘少霞等: 植物生理学实验中一类偶氮化合物的分光光度检测 523
件下生成偶氮化合物的特殊吸收峰在520 nm处(表
4)。如用山东高密采虹分析仪器有限公司生产的
紫外光栅分光光度计(752)测定结果趋势相似(数
值略)。
2 对氨基苯磺酸与α-萘胺组合反应体系生成偶氮
化合物的吸光度精细性检测
在表4结果的基础上 , 用同种反应体系从
514~528 nm每隔2 nm进行吸光度检测, 以确定偶
氮化合物吸收峰的幅度, 测定数值见表5。结果表
明偶氮化合物的特殊吸收峰值在518~522 nm处数
值差异不明显。
3 磺胺与α-萘胺组合反应体系生成的偶氮化合物
的吸光度检测
表3体系组合中, 在与表4结果相同条件下生
成偶氮化合物的特殊吸收峰在520 nm处(表6)。
表4 对氨基苯磺酸与α-萘胺组合反应体系生成的偶氮化合物的吸光度
Table 4 Absorption of azo compound generated by reaction combination of aminobenzene sulfonic acid with naphthylamine
编号
吸光度(A500~560 nm)
500 510 520 530 540 550 560
1 0.188 0.207 0.210 0.198 0.177 0.141 0.108
2 0.222 0.236 0.242 0.230 0.218 0.175 0.135
3 0.187 0.189 0.203 0.195 0.189 0.181 0.172
4 0.245 0.259 0.264 0.254 0.242 0.199 0.157
表5 对氨基苯磺酸与α-萘胺组合反应体系生成的偶氮化合物在514~528 nm吸光度
Table 5 Absorption in 514-528 nm of azo compound generated by reaction combination of aminobenzene sulfonic acid
with naphthylamine
编号
吸光度(A514~528 nm)
514 516 518 520 522 524 526 528
1 0.207 0.208 0.210 0.210 0.209 0.207 0.207 0.200
2 0.237 0.239 0.242 0.242 0.241 0.239 0.235 0.233
3 0.190 0.193 0.202 0.203 0.203 0.200 0.198 0.197
4 0.261 0.263 0.263 0.264 0.264 0.260 0.257 0.255
表6 磺胺与α-萘胺组合反应体系生成的偶氮化合物的吸光度
Table 6 Absorption of azo compound generated by reaction combination of sulfanilamide with naphthylamine
编号
吸光度(A500~560 nm)
500 510 520 530 540 550 560
1 0.141 0.160 0.169 0.164 0.143 0.109 0.075
2 0.140 0.161 0.168 0.163 0.147 0.108 0.074
3 0.207 0.226 0.234 0.223 0.200 0.147 0.098
4 0.330 0.371 0.386 0.366 0.314 0.253 0.168
用两种分光光度计, 在波长为500~560 nm范围
中每隔10 nm和514~528 nm范围中每隔2 nm为一测
点, 分别测定磺胺与α-萘胺生成偶氮化合物特殊吸
收峰和对氨基苯磺酸与α-萘胺生成偶氮化合物特
殊吸收峰, 其结果相比较二者趋势一致(数值略)。
4 不同浓度磺胺与α-萘胺反应生成的偶氮化合物
的吸光度
为了探讨不同浓度磺胺(或对氨基苯磺酸)与
α-萘胺反应对生成偶氮化合物特殊吸收峰的影响,
本文设定浓度为1 mmol·L-1的α-萘胺(乙酸溶解法)
与不同浓度磺胺(盐酸溶解法)反应生成偶氮化合
物, 测定结果表明: 特殊吸收峰在520 nm处, 但随
着磺胺浓度增加, 吸收峰值逐渐下降(表7)。α-萘
胺(盐酸溶解法)与磺胺(乙酸溶解法)反应结果趋势
相同(数值略)。
植物生理学报524
5 不同浓度α-萘胺与磺胺反应生成的偶氮化合物
的吸光度
为了探讨不同浓度α-萘胺与磺胺(或对氨基苯
磺酸)反应对生成偶氮化合物特殊吸收峰的影响,
本文设定浓度为0.1 mmol·L-1的磺胺(盐酸溶解法)
表7 不同浓度磺胺与α-萘胺反应生成的偶氮化合物的吸光度
Table 7 Absorption of azo compound generated by reaction combination of naphthylamine with different
concentrations of sulfanilamide
磺胺/ α-萘胺/ 吸光度(A500~560 nm)
mmol·L-1 mmol·L-1 500 510 520 530 540 550 560
0.1 1 0.122 0.134 0.136 0.126 0.117 0.109 0.053
0.2 1 0.121 0.132 0.135 0.125 0.113 0.108 0.048
0.4 1 0.117 0.128 0.129 0.120 0.109 0.105 0.041
0.6 1 0.115 0.127 0.127 0.117 0.103 0.102 0.037
0.8 1 0.114 0.126 0.124 0.114 0.007 0.003 0.031
如把磺胺换成对氨基苯磺酸其反应结果趋势相同(数值略)。
与不同浓度α-萘胺(乙酸溶解法)反应生成偶氮化
合物, 测定结果表明: 特殊吸收峰在520 nm处, 但
随着α-萘胺浓度增加, 吸收峰值逐渐增高(表8)。
磺胺(乙酸溶解法)与α-萘胺(盐酸溶解法)的反应结
果趋势相同(数值略)。
本试验结果表明: 对氨基苯磺酸(或磺胺)与α-
萘胺在酸性条件下生成的偶氮化合物的特定吸收
峰为A520 nm, 与张志良和瞿伟菁(2004)和赵亚华
(2005)结果相一致。在518~522 nm处吸光度数值
差异不明显。无论是在浓盐酸还是乙酸所处的酸
性条件下, 都不会改变偶氮化合物的特定吸收峰,
但对氨基苯磺酸(或磺胺)和α-萘胺都在乙酸溶解
条件下, 所生成的偶氮化合物的特定吸收峰值高
于其他酸溶解; 用乙酸溶解对氨基苯磺酸、用乙
醇溶解α-萘胺所生成的偶氮化合物特定吸收峰值
较高, 至于乙酸和乙醇在本试验中使偶氮化合物
特定吸收峰值增高的机理不详？当磺胺(或对氨基
苯磺酸)浓度固定时, 逐渐增加α-萘胺浓度, 对偶氮
化合物特定吸收峰没有影响, 但吸收峰值逐渐增
高, 可能与α-萘胺浓度增加有关; 如果α-萘胺浓度
固定, 逐渐增加磺胺(或对氨基苯磺酸)浓度, 对偶
氮化合物特定吸收峰没有影响, 但吸收峰值逐渐
降低。至于萧浪涛和王三根(2005)书中指出特定
吸收峰为510 nm和530 nm, 而李合生(2004)书中在
540 nm处有特定吸收峰, 两者差异所在, 有望同行
做进一步检验, 以确定偶氮化合物特殊吸收峰是
520 nm, 还是510 nm、530 nm或540 nm。
参考文献
李合生(2004). 植物生理生化实验原理和技术. 北京: 高等教育出
版社, 125~127
萧浪涛, 王三根(2005). 植物生理学实验技术. 北京: 中国农业出版
社, 86~88, 68, 219
张志良, 瞿伟菁(2004). 植物生理学实验指导. 北京: 高等教育出版
社, 41~43
赵亚华(2005). 生物化学与分子生物学实验技术教程. 北京: 高等
教育出版社, 110~112
表8 不同浓度α-萘胺与磺胺反应生成的偶氮化合物的吸光度
Table 8 Absorption of azo compound generated by reaction combination of sulfanilamide with different
concentrations of naphthylamine0/
磺胺/ α-萘胺/ 吸光度(A500~560 nm)
mmol·L-1 mmol·L-1 500 510 520 530 540 550 560
0.1 1 0.160 0.175 0.177 0.166 0.144 0.109 0.078
0.1 2 0.174 0.191 0.193 0.182 0.160 0.125 0.093
0.1 3 0.188 0.207 0.210 0.198 0.177 0.141 0.108
0.1 4 0.222 0.236 0.242 0.230 0.218 0.175 0.135
0.1 5 0.245 0.259 0.264 0.254 0.242 0.199 0.159
如把磺胺换成对氨基苯磺酸其反应结果趋势相同(数值略)。