全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (11): 1250~12541250
收稿 2013-07-01　　修定 2013-08-01
资助 贵州省科技厅项目[黔科合SY字(2012) 3030号]和贵州省
教育厅项目[2011 (278)号]。
* 通讯作者(E-mail: zhoulizxx@aliyun.com; Tel: 189085-
99226)。
‘金州报春’兜兰的非共生萌发与快速繁殖
周丽1,*, 邓克云2, 徐正海2
1兴义民族师范学院, 贵州兴义562400; 2黔西南州绿缘动植物科技开发有限公司, 贵州兴义562400
摘要: 收集授粉后不同时期报春兜兰栽培品种‘金州报春’的种子, 观察种子形态特征和萌发过程, 建立了高效快繁体系。试
验结果表明种子萌发的最佳培养基为RE+0.3 mg·L-1 NAA +0.1mg·L-1 6-BA +100 mL·L-1 椰子乳(体积比); 授粉162 d后的种子
萌发率较高并且无白化现象, 授粉203 d的种子播种后萌发率可达94.33%; 分化后的原球茎在壮苗培养基上培养4个月后可
得到有5~6片叶、高3~5 cm的健壮试管苗。
关键词: 种子; 非共生萌发; 培养基; 白化苗
In vitro Asymbiotic Germination and Propagation of Paphiopedilum primu-
linum ‘Jinzhoubaochun’
ZHOU Li1,*, DENG Ke-Yun2, XU Zheng-Hai2
1Xingyi Normal University for Nationalities, Xingyi, Guizhou 562400, China; 2Southwest Guizhou Luyuan Animal and Plant
Technologies Company Limited, Xingyi, Guizhou 562400, China
Abstract: In this experiment, we collected different embryo-aged-seeds of Paphiopedilum primulinum
‘Jinzhoubaochun’, observed the structure and the process of seed germination, and established an effective
regeneration system. The results showed that the better medium for germination was Robert Ernest (RE)-based
media containing 100 mL·L-1coconut water, 0.3 mg·L-1 NAA and 0.1 mg·L-1 6-BA. 162 DAP (day after
pollination) seeds had higher germination rate and without albino seedling, germination rate of 203 DAP seeds
were 94.33%. Transferred differentiation protocorns on optimum rooting medium, after 4 months, the
healthy robust seedlings were 3–5 cm tall and had 5–6 leaves.
Key words: seed; asymbiotic germination; medium; albino seedling
兜兰又称拖鞋兰, 是兰科兜兰属(Paphiope-
dilum)植物, 中国野生兜兰有18种(刘仲健等2009),
其中有不少是优良的杂交亲本, 但是多数为单花
类, 多花系列仅发现长瓣兜兰和飘带兜兰两种, 缺
少继花类。兜兰花型、花色变化多端, 是奇特美
丽的名贵观赏花卉, 野生条件下许多种类濒临灭
绝。在对我国兜兰进行繁育、保育的同时引进国
外优良品种与国内优良兜兰原生种进行人工杂交,
进行种质新资源创新, 有利于野生资源的有效保
护和合理开发利用。
报春兜兰(Paphiopedilum primulinum)为地生
兜兰, 产于印度尼西亚海拔100~400 m的石灰岩山
石上, 植株丛生, 叶4~7枚, 狭矩圆状椭圆形, 叶绿
色无斑纹; 花序直立, 花7~10朵相继开放, 花绿黄
色, 花期春夏季(刘仲健等2009)。报春兜兰是继花
类绿叶种兜兰, 其花绿黄色相对其有色型变种浅
紫兜兰(Paphiopedilum primulinum var.purpurascens)
来说属于白变种(Koopowitz 2008)。
材料与方法
1 实验材料
报春兜兰栽培品种‘金州报春’ (Paphiopedilum
primulinum ‘Jinzhoubaochun’)种植于绿缘公司大
棚, 盆栽植株叶生长、小苗分化、开花情况均良
好(图1-O), 人工授粉后产生可育种子。
2 播种方法和培养条件
兰科植物在授粉后至胚形成所需时间有较大
差异(伍成厚等2004; 张毓等2010), 在文中对种子
成熟度的表示以从授粉时间算起到采收时所经历
的天数来算(day after pollination, 简称DAP)。蒴果
用75%酒精表面擦拭后全部浸入95%酒精中2 s, 取
周丽等: ‘金州报春’兜兰的非共生萌发与快速繁殖 1251
出后于酒精灯上点燃, 待表面酒精烧尽后切开果
实将种子均匀撒于培养基表面。培养条件: 光照
强度25 μmol·m-2·s-1, 光照周期16 h·d-1, 培养温度
(25±2) ℃。
3 种子萌发培养基的筛选
用授粉180 d种子, 以Robert Ernst (简称RE)为
基本培养基, 加入20 g·L-1蔗糖、7 g·L-1琼脂粉, 100
mL·L-1 CM (椰子乳), 不同浓度生长调节剂, 制成萌
发培养基, pH调到5.8。接种后观察种子萌发及生
长情况, 筛选萌发适宜培养基。启动萌发时间以
肉眼可见种子中有明显膨大的原球20个左右为
准。萌发率的统计, 播种100 d后在超净工作台上,
随机挑取种子置于载玻片上, 于显微镜下观察不
同视野, 统计100粒种子情况, 萌发以胚突破种皮
形成原球茎为准, 若有启动萌发后原球茎褐化或
死亡的视为褐化原球茎。实验结果录入Excel中,
用SAS v8软件进行方差分析。
4 胚龄对种子萌发的影响
取授粉后不同时期的种子于显微镜下观察种
子结构和胚发育情况并接种于最佳萌发培养基M7
上, 对萌发情况进行定期观察统计。
5 分化与壮苗
播种后200 d原球茎开始分化小芽后, 将带芽原
球茎接种在壮苗生根培养上培养, 壮苗培养基为
基本培养基RE, 添加7 g·L-1琼脂粉、30 g·L-1蔗糖和
80 g·L-1香蕉泥, 生长调节剂配比为0.8 mg·L-1 NAA+
0.2 mg·L-1 6-BA, 壮苗培养时已分化的带有较大小芽
的可直接定苗, 每630 mL的培养瓶内接种20苗。
图1 ‘金州报春’兜兰不同成熟期种子及萌发过程
Fig.1 Seed of different maturation periods and germination process of Paph. primulinum ‘Jinzhoubaochun’
A: 134 DAP的种子; B: 134 DAP 的种子播种84 d; C: 134 DAP的种子播种107 d, 明显可见白化原球茎(箭头所示); D: 134 DAP的种子
分化小苗, 白化原球茎死亡(箭头所示); E: 148 DAP的种子; F: 148 DAP 种子播种84 d; G: 148 DAP的种子播种107 d, 可见白化原球茎(箭头
所示); H: 148 DAP的种子分化小苗, 白化原球茎分化出白化小苗(箭头所示); I: 162 DAP的种子; J: 162 DAP的种子播种84 d萌发状况; K:
162 DAP的种子播种107 d, 萌发分化好无白化现象; L: 162 DAP的种子分化小苗, 无白化苗产生; M: 健壮的试管苗; N: 试管苗移栽; O: 报
春兜兰开花; P: 文山兜兰白化苗(箭头所示)。(A, E, I图中标尺=0.1 mm; 其余为1 cm)。
植物生理学报1252
实验结果
1 种子萌发培养基的筛选
授粉后180 d的种子种皮浅褐色, 胚长椭圆形
较饱满, 种子全长约1 mm, 胚长约0.4 mm, 单侧翅
长约0.3 mm。从表1可以看出在不同的培养基中
报春兜兰启动萌发所需要的时间差异不大, 基本
培养基为RE和1/2RE的两大类培养基的萌发率和
褐化率的差异不显著。方差分析结果表明, 不同
生长调节剂组合对萌发率和褐化率影响显著, M7
为0.3 mg·L-1 NAA +0.1 mg·L-1 6-BA组合, 萌发率最
高, 达到93.2%, 褐化率为0; M5中萌发率最低, 仅为
17.4%, 且萌发后原球茎褐化率高达7.4%。在不添
加任何生长调节剂的M1和M6两种培养基中种子的
萌发率也比较高, 可见报春兜兰种子萌发对植物
生长调节剂的要求不高, 较高浓度的生长调节剂
不仅会降低萌发率, 而且会导致萌发后约7%的原
球茎褐变甚至死亡。
2 胚龄对萌发的影响
兰科植物的胚, 是一个卵形的未分化的细胞
团, 不具子叶和胚乳, 缺乏营养物质, 在自然条件
下极难萌发(胡适宜2005)。兰科植物种子在自然
条件下, 需要有共生菌的感染才能萌发, 且萌发率
很低, 在组织培养条件下可进行非共生萌发, 萌发
率与种子的成熟度有密切关系。所以种子成熟度
对种子的萌发、分化、成苗等有着重要的影响。
120 DAP的种子, 蒴果剖开后可见种子白色、
细小密生在胎座上, 在显微镜下可见种子两侧具
翅、呈梭形, 种皮膜质、无色透明且有许多皱折,
看不到有明显存在的胚, 罕有1~2个种子内有直径
约0.1 mm的圆形胚, 位于种子中部, 说明种子极度
表1 不同培养基对种子萌发的影响
Table 1 Effect of different medium on seed germination
培养基 基本培养基
激素组合/mg·L-1
接种瓶数/瓶 启动萌发时间/d 萌发率/% 褐化率/%
6-BA NAA
M1 RE - - 5 63 67.4
C 0.4D
M2 RE 0.1 0.3 5 70 90.8
AB 0D
M3 RE 0.2 0.6 5 56 58.8
C 1CD
M4 RE 0.3 0.8 5 63 29.8
DE 2C
M5 RE 0.4 1.0 5 77 17.4
F 7.4A
M6 1/2RE - - 5 56 85.6
B 0D
M7 1/2RE 0.1 0.3 5 56 93.2
A 0D
M8 1/2RE 0.2 0.6 5 56 58.6
C 1.2CD
M9 1/2RE 0.3 0.8 5 56 38.6
D 3.4BC
M10 1/2RE 0.4 1.0 5 70 24.8
EF 6.2AB
　　同列数字旁不同的大写字母表示差异极显著(P<0.01)。
表2 不同胚龄对报春兜兰‘金州报春’种子萌发的影响
Table 2 Effect of different embryo ages on the embryo
sprouting of Paph. primulinum ‘Jinzhoubaochun’
胚龄/d 启始萌发时间/d
萌发率/%
播种84 d 播种107 d 播种121 d
120 - 0d 0f 0e
134 35 31.83b 44.33d 46.33c
148 49 54.50a 72.33b 83.83b
162 77 6.17c 84.00a 94.17a
203 91 0d 63.67c 94.33a
237 98 0d 22.00e 36.33d
　　同列数字旁不同的小写字母表示差异极显著(P<0.05)。
不成熟, 播种后一直没有萌发现象, 萌发率始终为
0; 134 DAP的种子, 蒴果剖开可见有种子有两种颜
色, 一部分为浅土黄色种子, 大部分仍为白色, 种
子仍然密生于胎座上, 显微镜下见种皮略带浅土
黄色, 65%左右的种子内具有长0.35 mm, 宽0.16
mm的长椭圆形胚, 胚不能完全充满种皮的长边两
侧(图1-A), 种子还不完全成熟, 种皮透水性好, 种
子启动萌发快, 但是萌发低(图1-B), 萌发形成的原
球茎产生白化现象(图1-C), 未白化的原球茎可正
常成苗, 大部分白化原球茎在分化时期死亡(图
1-D); 148 DAP的种子, 种皮完全变为浅土黄色, 胚
周丽等: ‘金州报春’兜兰的非共生萌发与快速繁殖 1253
大小梢有增加(图1-E), 种子着生在胎座上, 用刀片
轻轻刮下后, 在培养基中能很好分散开, 种子趋于
成熟 , 播种后启动萌发较快(图1-F), 萌发率达
83.33%, 存在大量的白化原球茎(图1-G), 白化原球
茎可以分化成小苗, 小苗也可以生长一段时间, 但
在后期培养中不会转绿、不能长大也不易生根(图
1-H), 所以为无效苗, 只有没白化的小苗能正常成
苗; 162 DAP的种子, 种皮黄褐色, 剖开果皮后种子
易于自动散落下来, 显微镜下可见种皮为均匀的
浅黄褐色, 胚为长约0.51 mm, 宽约0.29 mm的椭圆
形, 充满种皮中部位置, 种子成熟(图1-I); 203 DAP
的种子, 种皮黄褐色, 胚饱满, 种子充分成熟, 162
DAP至203 DAP的种子成熟, 启动萌发所需要时间
较长(图1-J), 但萌发率高达94.33%, 萌发后原球茎
生长、分化正常(图1-K), 无白化现象(图1-L), 是种
子离体繁殖取材的最佳时期; 237 DAP的种子, 种
皮褐色、胚饱满成熟, 种子过于成熟, 萌发所需时
间加长, 萌发率仅为36.33%。
3 壮苗生根及移栽
原球茎在萌发培养基可很好地分化, 若不是
接种太密可等第一对小叶长出再转入壮苗培养基
中, 120 d后可得到健壮试管苗(图1-M)。小苗移栽
用直径2~3 mm的细树皮颗粒, 栽植于2寸育苗杯
中, 加强水分管理, 成活率在90%以上(图1-N)。
讨　　论
本实验表明, 报春兜兰‘金州报春’种子适宜在
较低的植物生长调节剂配比中萌发, 其中以0.3
mg·L-1 NAA +0.1 mg·L-1 6-BA萌发率最高, 在NAA
大于0.6 mg·L-1, 6-BA大于0.3 mg·L-1的配比下萌发
率下降, 且形成的原球茎会产生膨大、难分化、
褐化、死亡等现象。
种子成熟度对种子萌发的影响很大, 120 DAP
的种子内无正常胚, 不能萌发, 随着胚龄的增加,
134~203 DAP这段时间的种子渐渐成熟, 胚也不断
饱满充实, 种子萌发率逐渐增加, 授粉203 d后的种
子过度成熟, 萌发所需时间增加, 萌发率下降, 这
主要是由于种子成熟后, 种皮和胚内累积萌发抑
制物质以及种皮透水性降低所致。所以播种的时
间应该是种子成熟, 但种皮及胚内萌发抑制物质
未大量积累前。授粉后生长期少于162 d的种子虽
然启动萌发所需时间短, 但是萌发后会大量产生
白化原球茎, 导致后来出现白化苗, 而授粉162 d后
的种子播种后无白化现象产生。早期有研究人员
对不同兜兰进行快速繁殖研究, 如带叶兜兰(曾宋
君等2006)、亨利兜兰(曾宋君等2010)、文山兜兰
白变种(黄玮婷和曾宋君2010)、白花兜兰(王莲辉
等2010a)、小叶兜兰(王莲辉等2010b), 均未报道有
白化现象, 在本研究中发现的幼龄种子萌发白化
现象对进一步研究兰科植物叶艺的形成和退艺有
所启示。
白化是植物叶色突变的常见类型之一, 白化
现象广泛存在于植物界中, 引起研究人员的重视
和深入研究, 如大豆(刘昭军等2005)、矮牵牛(张
汉尧等2005)、油菜(赵云等2001)、蝴蝶兰(顾德峰
等2007)等。白化最典型的特征是叶绿体不能正常
发育, 进而表现出芽黄、子叶浅绿、迟绿、叶色
呈条纹、花斑甚至整株失绿等现象。报春兜兰‘金
州报春’在授粉134~148 d这段时间, 胚成熟度不够,
产生50%以上的白化原球茎和白化小苗。白化原
球茎的分化能力弱, 或者分化后可形成全株白色
的小苗, 但小苗不易长大, 白化的形成在培养过程
中仅表现为不可逆现象, 白化原球茎和小苗最终
都玻璃化死亡, 成为无效萌发(图1-D、H); 而未发
生褐化的原球茎的分化和生长均正常, 这说明在
同一蒴果内的种子成熟度存在差异。采用授粉162
d以后的种子播种可完全消除白化现象的产生(图
1-L), 所以在易产生白化的兜兰播种繁育中一定要
选用成熟度适宜的种子, 如果产生白化小苗, 应该
完全弃之。作者在石斛、兜兰的播种繁育中发现
在生长繁茂的培养瓶内偶尔会产生极少量的叶片
缺绿导致的花叶现象, 但是这种花叶, 在转入新的
培养基上后, 新长叶可转绿, 可见这种花叶现象是
营养元素缺乏导致的可逆变化, 在文山兜兰(Paph.
wenshanense)的瓶播试验中也发现存在相似的未
成熟胚萌发后形成不可逆白化幼苗现象(图1-P),
其产生原因有待进一步从叶绿体突变的分子机理
方面加以研究。
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