全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (10): 993~996 993
收稿 2012-07-19　　修定 2012-08-07
资助 国家自然科学基金(30670202)。
* 通讯作者(E-mail: chenfj616@163.com; Tel: 0717-6397188)。
领春木体细胞胚胎发生及植株再生
冉佳鑫, 王玉宇, 宋丹, 陈发菊*
三峡大学生物技术研究中心, 湖北宜昌443002
摘要: 以领春木(Euptelea pleiospermum Hook. f. et Thoms.)种子幼胚为试验材料, 对领春木体细胞胚胎发生进行了研究。结
果表明: 在附加1.0 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂的MS培养基上可诱导出愈伤组织。愈伤组织在附加
0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA的培养基上可形成体细胞胚; 体胚在附加0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA+0.1% PVP的
1/2MS培养基上能大量增殖; 将成熟体胚转移到不添加任何植物生长调节剂的MS培养基上, 培养60 d, 形成正常植株。
关键词: 领春木; 组织培养; 体细胞胚胎发生
Somatic Embryogenesis and Plant Regeneration of Euptelea pleiospermum
Hook. f. et Thoms.
RAN Jia-Xin, WANG Yu-Yu, SONG Dan, CHEN Fa-Ju*
Biotechnology Research Center, China Three Gorges University, Yichang, Hubei 443002, China
Abstract: Study on somatic embryogenesis from immature embryos in rare endangered plant Euptelea pleio-
spermum Hook. f. et Thoms. was achieved. The results showed that the best medium to induce the callus was
MS+1.0 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA+3% sucrose +0.8% agar. The callus could transform to somatic embryo
on the medium with 0.5 mg·L-1 NAA+0.5 mg·L-1 6-BA. A great quantity of somatic embryos could proliferate
on 1/2MS+0.5 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 NAA+0.1% PVP medium. The somatic embryos could develop to
seedlings after 60 days on the medium of MS without plant growth regulator.
Key words: Euptelea pleiospermum Hook. f. et Thoms.; tissue culture; somatic embryogenesis
领春木(Euptelea pleiospermum Hook. f. et
Thoms.)属领春木科(Eupteleaceae), 单属(杨得坡等
1999), 少种落叶乔木, 是第三纪古老孑遗植物(薛
达元等1991)和稀有珍贵的古老树种, 为典型的东
亚植物区系成分的特征种, 在植物形态结构方面
表现出很多原始性状(如: 雌、雄蕊多数, 轮生), 对
研究植物系统演化发育、古植物区系和古代地理
气候方面有重要的学术价值。该树种花果成簇,
红艳夺目, 是观赏价值很高的园林绿化树种(陈坤
浩等2007)。然而在自然环境中, 领春木更新能力
弱(杨得坡等1999), 生境胁迫较大, 在群落竞争中
处于劣势地位, 属衰退种, 被列为国家三级重点保
护植物(傅立国和金鉴明1992)。目前领春木在世
界许多地方已灭绝, 保护该物种和自然生态系统
的多样性已迫在眉睫。
目前国内外对于领春木的研究主要集中于对
领春木生态及遗传多样性(王芳2008; Wei和Jiang
2012)、形态解剖学(李红芳2005)、生长发育规律
(贺超锋等2009)等方面, 而对于领春木再生体系的
建立极少见报道, 国内仅见邢世海和陈娜(2005)以
茎段为外植体诱导出愈伤组织的报道。植物体细
胞胚发生与发育的研究不仅对揭示细胞分化、形
态发生和胚发生等具有重要意义, 而且胚性细胞
还是外源基因的良好受体。本实验研究领春木体
细胞胚的发生, 为领春木原生质体培养、优良无
性系的繁殖、保护珍贵种质资源、基因工程和突
变体筛选等研究奠定基础。
材料与方法
1 材料
领春木(Euptelea pleiospermum Hook. f. et
Thoms.)未成熟种子(处于幼胚阶段)采自神农架自
然保护区关门山。
植物生理学报994
2 方法
2.1 外植体处理
将采集的领春木未成熟种子在自来水下冲洗
10~12 h, 然后用75%酒精表面灭菌30 s, 接着用
30%的NaClO灭菌6~8 min, 无菌水洗5次, 将未成
熟种子切开, 挑出幼胚接种到培养基上。
2.2 培养条件
以MS为基本培养基, 加蔗糖30 g·L-1和琼脂8
g·L-1, pH调至6.0, 培养温度为(25±2) ℃。采用光照
和黑暗两种光照处理, 光照强度40 µmol·m-2·s-1, 光
照时间16 h·d-1。
2.3 愈伤组织的诱导
将灭菌的外植体接种到MS添加1.0 mg·L-1
2,4-D和6-BA (0.1、0.5、1.0、2.0 mg·L-1)不同组合
的培养基上诱导愈伤组织, 30 d后统计愈伤组织诱
导率。
2.4 体胚分化和增殖
将诱导的愈伤组织转接到MS添加0.5 mg·L-1
NAA和0.5 mg·L-1 6-BA的培养基上, 继代2次后将
体细胞胚转到附加NAA (0、0.5、0.05 mg·L-1)和
6-BA (0、0.5 mg·L-1)不同组合的1/2MS (即MS中的
大量元素减半, 其他元素不变)培养基上, 观察体细
胞胚增殖情况。在领春木体细胞胚的继代过程中,
为防止培养过程中的褐化现象 , 培养基中加入
0.1%的聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。
2.5 体胚萌发与植株再生
将增殖后的体细胞胚转接到不添加任何植物
生长调节剂的MS培养基中, 观察体胚萌发情况。
实验结果
1 愈伤组织的诱导
1.1 不同光照条件对领春木愈伤组织诱导的影响
将幼胚置于光照和黑暗两种光照条件下进行
培养, 结果表明, 领春木幼胚无论是在光照还是在
黑暗条件下均能诱导出愈伤组织, 但在光照条件
下诱导产生愈伤组织的时间早于黑暗条件, 可提
前15 d, 光照可以刺激领春木愈伤组织的诱导。
1.2 不同植物生长调节剂组合对领春木愈伤组织
诱导的影响
将幼胚接种到不同组合的诱导培养基上。30
d后观察发现, 在MS附加1.0 mg·L-1 2,4-D+0.1、
0.5、1.0 mg·L-1 6-BA的培养基上均能诱导出愈伤
组织(表1), 愈伤组织呈黄色, 粘稠状, 表面较光滑
(图1-A), 以1.0 mg·L-1 2,4-D+0.5 mg·L-1 6-BA组合最
佳, 诱导率100%, 而1.0 mg·L-1 2,4-D+2.0 mg·L-1
6-BA组合未能诱导出愈伤组织, 可能高浓度的细
胞分裂素抑制了低浓度生长素的作用, 而难以诱
导出愈伤组织。
2 体胚分化和增殖
将愈伤组织转接到MS附加0.5 mg·L-1 NAA和
0.5 mg·L-1 6-BA的培养基上, 继代培养2次, 40 d后
开始产生黄色颗粒状、表面较光滑的体细胞胚,
可以观察到球形胚、心形胚、鱼雷胚、子叶胚等
不同时期的体细胞胚(图1-B~E), 在同一个愈伤组
织团块中也可观察到不同时期的体细胞胚 (图
1-F、H)。
将产生的体细胞胚转到以1/2MS为基本培养
基附加不同浓度NAA和6-BA组合的培养基中进行
增殖培养(表2)。观察发现, 在不添加任何植物生
长调节剂的1/2MS培养基中, 体细胞胚增殖很少,
增值倍数只有1.18, 生长缓慢, 极易褐化且褐化程
度极其严重。在添加0.1% PVP后, 褐化程度有一
定的减轻。添加0.1% PVP和0.5 mg·L-1 6-BA时, 体
细胞胚大量增殖, 褐化程度相对减轻, 而在添加
0.1% PVP和0.5 mg·L-1 NAA、0.5 mg·L-1 6-BA的组
合培养基上, 胚性愈伤组织分化产生不同时期的
体细胞胚, 体细胞胚大量增殖, 褐化极少, 但如果
长期在此条件下培养, 体细胞胚容易再次愈伤化。
在添加0.1% PVP和0.05 mg·L-1 NAA、0.5 mg·L-1
6-BA的培养基上, 不但产生黄色颗粒状、表面较
光滑的体细胞胚, 而且增殖多, 增殖倍数达到21,
褐化极少。本实验发现一旦愈伤组织分化出体胚
后, 在适当条件下会大量增殖。
3 体胚萌发与植株再生
将增殖后的体细胞胚, 转移到不加任何激素
的MS培养基上, 在光照条件下, 体细胞胚开始呈现
绿色(图1-G)。40 d后, 体胚萌发产生再生植株(图
1-I)。
讨　　论
本实验以领春木幼胚为外植体, 以MS为基本
培养基, 添加1.0 mg·L-1 2,4-D和0.5 mg·L-1 6-BA, 接
冉佳鑫等: 领春木体细胞胚胎发生及植株再生 995
种30 d诱导产生胚性愈伤组织, 在去除2,4-D, 添加
NAA与6-BA组合的情况下, 产生体细胞胚。在预
实验中, 我们选择了不同浓度的2,4-D诱导愈伤组
织, 发现高浓度的2,4-D效果没有较低浓度的2,4-D
效果好, 甚至抑制愈伤组织的产生, 这一现象在其
他研究中也有报道(陈金慧等2003), 2,4-D浓度过
低也不利于愈伤组织的诱导。可能是因为外植体
为幼嫩的种胚, 较高浓度的2,4-D对种子本身产生
了损害作用, 抑制了愈伤组织的发生, 而太低浓度
的2,4-D不能够引起种子脱分化而产生愈伤组织,
图1 领春木的体细胞胚胎发生
Fig.1 Somatic embryogenesis of E. pleiospermum
A: 培养30 d产生的愈伤组织; B: 球形胚; C: 心形胚; D: 鱼雷胚; E: 子叶胚; F: 不同发育阶段的体细胞胚胎; G: 转绿的体细胞胚; H: 萌
发的体胚; I: 再生植株。
表2 领春木体细胞胚在不同成分的培养基上的增殖情况
Table 2 The proliferation conditions of somatic embryos of E.
pleiospermum on different medium
NAA/mg·L-1 6-BA/mg·L-1 PVP/% 褐化程度 增殖倍数
0 0 0 ++++ 1.18
0 0 0.1 +++ 1.2
0 0.5 0.1 ++ 4
0.5 0.5 0.1 + 10
0.05 0.5 0.1 + 21
　　++++表示褐化极其严重, +++表示褐化很严重, ++表示褐化较
少, +表示褐化极少。
表1 不同植物生长调节剂组合对领春木愈伤组织诱导的影响
Table 1 Effects of different plant growth regulator combinations on callus induction of E. pleiospermum
2,4-D/mg·L-1 6-BA/mg·L-1 愈伤组织诱导率/% 愈伤组织颜色 愈伤组织质地
1.0 0.1 60 米黄 粘稠光滑
1.0 0.5 100 浅黄 粘稠光滑
1.0 1.0 50 浅黄 粘稠光滑
1.0 2.0 0 — —
植物生理学报996
所以本实验选择1.0 mg·L-1浓度的2,4-D。
在植物体细胞胚的诱导过程中, 存在各个方
面的影响因素 , 包括外植体基因型及其生理状
态、外源植物生长调节剂、培养基、培养条件等,
其中外源植物生长调节剂是非常重要的影响因素
(Gallego等2001; 赖钟雄和桑庆亮2003), 特别是
2,4-D对胚性愈伤组织诱导和胚性能力的维持有着
至关重要的作用(von Arnold等2002; Fehér等2003)。
在本实验领春木体细胞胚的诱导中, 添加2,4-D的
培养基能诱导出胚性愈伤组织, 去除2,4-D的情况
下, 结合6-BA与NAA的使用才能够形成体细胞
胚。有研究指出胚性愈伤组织形成后, 如不及时
转入去除2,4-D的培养基中, 则胚性细胞就不能进
入体细胞胚胎发育阶段(崔凯荣等2000)。
根据愈伤组织生长发育的细胞学特点, 可将
其分为诱导期、分裂期(增殖期)和分化期(器官和
体细胞胚形成期) (杨和平和程井辰1991)。本实验
中, 非胚性愈伤组织经过40 d的诱导才形成胚性愈
伤组织, 胚性愈伤组织经过40 d左右诱导分化出不
同发育时期的体胚, 并进一步发育形成正常植株,
说明非胚性愈伤组织转变成胚性愈伤组织以及分
化形成体胚是一个非常复杂的过程, 受多方面因
素的影响。在本实验中, 胚性愈伤组织诱导率不
高, 从愈伤组织诱导到形成完整植株所需时间较
长, 还有待进一步探求更为有效的方法以提高胚
性愈伤组织诱导率和出愈时间。
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