全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (7): 699~704 699
收稿 2012-04-01　　修定 2012-05-10
资助 国家自然科学基金(30972352)。
* 通讯作者(E-mail: zhaozhlunwen2010@126.com; Tel: 029-
87082801)。
插壤温度对四倍体刺槐硬枝插条生根过程中生理生化的影响
王小玲1,2, 赵忠2,*, 高柱1
1江西省科学院生物资源研究所, 南昌330029; 2西北农林科技大学, 西部环境与生态教育部重点实验室, 陕西杨凌712100
摘要: 取四倍体刺槐3年生采穗圃中1年生硬枝插条为材料, 研究扦插过程中插壤温度对插穗内源激素含量、酶活性和营养
物质含量的影响, 揭示四倍体刺槐扦插生根机制。结果表明: 四倍体刺槐硬枝扦插过程中, 插壤经加热处理, 插穗内源IAA
含量降低, ABA和ZR含量升高; 根原基诱导期插穗内源IAA含量的变化趋势与未加热插穗相反, ABA和ZR含量的变化趋势
与未加热插穗相同。插壤经加热处理, 插穗IAAO、PPO和POD活性的变化趋势与未加热插穗相同, 两处理间插穗IAAO、
PPO和POD活性差异不显著。插壤经加热处理, 可显著提高插穗可溶性蛋白和可溶性糖含量, 而对淀粉和植物总氮含量的
影响差异不显著。因此, 插壤加热处理, 主要是通过降低四倍体刺槐硬枝插穗内源IAA含量, 提高插穗可溶性蛋白和可溶性
糖含量来促进插条不定根发生。
关键词: 四倍体刺槐; 插壤温度; 内源激素; 酶活性; 营养物质
Effects of Plug Soil Temperature on Physiological and Biochemical in Hard-
wood Cuttings Rooting of Tetraploid Robinia pseudoacacia
WANG Xiao-Ling1,2, ZHAO Zhong2,*, GAO Zhu1
1Institute of Biological Resources, Jiangxi Academy of Sciences, Nanchang 330029, China; 2Key Laboratory of Environment and
Ecology in Western China of Ministry of Education, Northwest A & F University, Yangling, Shaanxi 712100, China
Abstract: Annual hardwood cuttings in 3-year-old cutting orchard of tetraploid Robinia pseudoacacia were
taken as materials in this experiment. Effects of plug soil temperature on endogenous hormones contents, oxi-
dase and antioxidant enzyme activity, nutrient contents of hardwood cuttings were carried out to elucidate the
rooting mechanism of tetraploid R. pseudoacacia. The result showed: endogenous IAA content of hardwood
cuttings decreased with plug soil heating during rooting process, and increased in ABA and ZR contents. Dur-
ing the root primordial initiation phase, contrast trends in IAA content and similar trends in ABA and ZR con-
tents to those observed in the heating-treated and without heating-treated cuttings. In addition, the trends of
IAAO, PPO and POD activity with the heating-treated were similar to the without heating-treated cuttings.
There was no significant difference in IAAO, PPO and POD activity between the two treatments cuttings. Last-
ly, soluble protein and sugar contents with the heating-treated were significantly higher than those without heat-
ing-treated cuttings. However, there were no significant differences in starch and total nitrogen contents be-
tween the heating-treated and without heating-treated cuttings. As a result, the effect of plug soil with heating-
treated on hardwood cutting rooting formation was mainly trough decreasing the content of IAA, increasing the
contents of soluble proteins and soluble sugar.
Key words: tetraploid Robinia pseudoacacia; plug soil temperature; endogenous hormone; enzyme activity;
nutrient
四倍体刺槐是由人工诱导二倍体刺槐体细胞
加倍而育成的刺槐优良无性系。四倍体刺槐属难
生根树种, 生产上主要采用嫁接繁殖。由于嫁接
育苗繁殖系数低、周期长, 严重制约了四倍体刺
槐的繁殖速度。于是, 国内研究人员做了大量扦
插和微体快繁研究, 其中微体快繁技术比较成熟,
为其抗性基因的遗传转化奠定了基础, 但微体快
繁技术要求试验条件较好, 成本高, 用此方法生产
的优质种苗还较少。四倍体刺槐扦插繁殖虽然取
得了一定的成效, 但主要集中在生根解剖学(梁海
荣等2006)、外源生长素种类(杨兴芳等2005)和处
植物生理学报700
理方法(胡兴宜等2004)、母树年龄(姚占春等2007)
和扦插基质(孟丙南等2010)等方面, 繁殖地域性比
较明显, 可重复性差, 大大限制了四倍体刺槐的推
广范围。可见, 四倍体刺槐扦插技术还需要更加
深入、系统的研究, 争取早日完成四倍体刺槐扦
插繁殖的技术规范, 广泛用以指导生产。为此, 本
试验在以往研究的基础上(王小玲等2011; Wang等
2011), 进一步研究了插壤温度对四倍体刺槐硬枝
插条生根过程中内源激素含量、氧化酶活性和营
养物质含量的影响, 为进一步揭示四倍体刺槐扦
插生根困难的机理奠定基础, 从根本上解决四倍
体刺槐扦插生根困难的问题, 也为难生根树种的
扦插繁殖提供借鉴。
材料与方法
1 试验地概况
试验地点设在陕西杨凌的西北农林科技大学
林学院教学试验苗圃 , 该圃地位于108°07 ′E ,
34°12′N。最高海拔530.1 m, 最低海拔403.2 m。年
均积温4 811 ℃, 年均气温12.9 ℃, 极端最低气
温–19.4 ℃, 极端最高气温42 ℃。年均降水量660
mm, 无霜期220 d以上, 年均日照时数2 163.8 h, 年
均辐射总量114.8 kJ·m-2, 属于暖温带半湿润大陆性
季风气候。
2 供试材料
试验材料采自苗圃内3年生四倍体刺槐(Rob-
inia pseudoacacia L., 又名洋槐)嫁接苗上的1年生
硬枝枝条。从母树基部剪取上年平茬切口下方萌
生的直径为0.8~1.2 cm的1年生枝条, 截去基部和
梢部, 留中部约50 cm一段制穗, 插穗长12~15 cm,
上切口平剪, 下端距芽约1 cm处剪成45°切口。
3 试验方法
3.1 苗床处理
修建坐北朝南的阳畦两个, 阳畦长8.5 m, 宽
1.2 m, 南墙高于床面30 cm, 北墙高于床面80 cm。
未加热阳畦床底铺一层15~20 cm厚的大鹅卵石,
上层铺20 cm过筛纯净新鲜河沙。加热阳畦, 先在
鹅卵石上铺5 cm厚干净河沙, 再铺3 cm厚锯末作为
隔热层, 然后将功率为800瓦、长200 m的电热线
间隔10 cm布设于隔热层上, 最后再铺15 cm厚河
沙。电热线外接单独电源和恒温控制仪。按东西
走向将两个阳畦划分为3个小区, 相邻小区间隔0.5
m。扦插前3 d, 每天用50%多菌灵可湿性粉剂800
倍液进行消毒, 并翻动河沙, 扦插当日浇透水。
3.2 试验处理
插壤处理: 设置插壤加热处理和未加热处理
(对照)。用TNHY-4土壤温度监控仪分别监测两个
阳畦插壤8 cm处的温度(图1) (加热苗床8 cm深度
的插壤温度控制在26 ℃±0.5 ℃), 每隔1 h自动记录
温度一次 , 计算出加热和未加热苗床插壤温度
≥10 ℃的有效积温(有效积温按差值法计算, 即以
10 ℃为生物学零度, 大于10 ℃的日温度之总和)。
图1 四倍体刺槐硬枝插穗生根过程中插壤温度和有效积温
Fig.1 Plug soil temperature and effective accumulated tem-
perature of tetraploid Robinia pseudoacacia hardwood cut-
tings during rooting process
插穗处理: 剪好的插穗50根为一捆捆扎, 用5
g·L-1多菌灵溶液浸泡3 min, 晾干。依据笔者前期
的试验结果, 选用吲哚丁酸(indole-3-butyric acid,
IBA) 1 000 mg·L-1溶液浸泡6 h后, 分别扦插在2个
阳畦。每小区随机扦插100根, 扦插深度8 cm, 密度
400根·m-2。
3.3 取样方法
用IBA 1 000 mg·L-1溶液处理插穗之前, 随机
抽取5根插穗, 即为0 d样品; 扦插后在15、20、
25、30、35 d分别从2个阳畦中取样。每个阳畦每
小区随机抽取5根插穗, 清水冲洗干净后, 迅速剥
取插穗基部1 cm范围内的皮层, 混合后分为3组,
液氮冷冻后于超低温冰箱保存。
4 测定方法
4.1 内源激素含量测定
称取冷冻样品0.25 g, 加少量聚乙烯吡咯烷酮
和预冷的80%甲醇提取液2 mL, 冰浴中充分研磨
王小玲等: 插壤温度对四倍体刺槐硬枝插条生根过程中生理生化的影响 701
成匀浆, 转入10 mL离心管, 再用提取液分次冲洗
研钵, 并入离心管, 定容至5 mL。摇匀后在4 ℃条
件下浸提4 h以上, 5 000 r·min-1冷冻离心10 min, 取
上清液。上清液过C-18固相萃取柱。将过柱后的
样品转入5 mL塑料离心管中, 恒温水浴(37 ℃)下
用N2吹干, 除去提取液中的甲醇。按照预试验选
定的倍数用样品稀释液稀释, 即为样品液。
采用间接酶联免疫吸附法(ELISA)测定插穗
内源激素吲哚乙酸(indole-3-acetic acid, IAA)、脱
落酸(abscisic acid, ABA)和玉米素核苷(zeatin ribo-
side, ZR)含量, 试剂盒购自中国农业大学, 测定方
法参考闫绍鹏(2004)方法有所改进。采用美国
BioTek公司生产的ELx800TM通用酶标仪测定试样
中各激素含量, 每个样品重复3次, 取平均值。
4.2 氧化酶活性测定
按王小玲等(2011)方法有所改进测定吲哚乙
酸氧化酶(indoleacetic acid oxidase, IAAO)活性,
530 nm波长测定吸光度, 单位µg·g-1 (FW)·h-1。愈创
木酚染色法测定过氧化物酶(peroxidase, POD)活
性, 470 nm波长测定吸光度, 单位µg·g-1 (FW)·min-1。
邻苯二酚法测定多酚氧化酶(polyphenol oxidase,
PPO)活性, 420 nm波长测定吸光度, 以每克鲜质量
每分钟光密度每变化0.01为一个酶活性单位[U·g-1
(FW)]。
4.3 营养物质含量测定
可溶性蛋白含量测定采用考马斯亮蓝G-250
染色法, 于595 nm测定其吸光值, 单位mg·g-1 (FW)。
可溶性糖和淀粉含量测定采用蒽酮比色法, 于620
nm测定其吸光值, 单位mg·g-1 (FW)。植物总氮测
定采用GB7886-87中的蒸馏法, 全自动凯氏定氮仪
测总氮含量。
5 数据分析
所有数据处理在Sigmaplot 10.0和SPSS16.0软
件下完成, LSD法分析差异显著性。
实验结果
1 插壤温度对四倍体刺槐硬枝插穗内源激素含量
的影响
插壤温度可明显改变四倍体刺槐硬枝插穗内
源IAA含量(图2-A)。插壤加热后插穗内源IAA含
量明显低于未加热插穗; 愈伤组织诱导期(0~20 d),
两处理插穗内源IAA含量同时升高; 根原基诱导期
(20~30 d), 加热插穗內源IAA含量逐渐下降, 未加
热插穗內源IAA含量先下降后升高; 不定根伸长期
(30~35 d), 加热插穗內源IAA含量升高, 未加热插
穗IAA含量下降, 且在扦插后第35天, 两处理插穗
內源IAA含量接近。由此可见, 插壤加热后根原基
诱导期插穗內源IAA含量降低是提高插穗生根的
原因之一。
图2-B显示, 插壤加热后插穗內源ABA含量明
显高于未加热插穗; 两处理插穗內源ABA含量在
扦插过程中变化趋势相同, 愈伤组织诱导期和不
定根伸长期降低, 根原基诱导期升高。插穗內源
ZR含量的变化与內源ABA含量变化相似(图2-C),
插壤加热后插穗內源ZR含量高于未加热插穗; 扦
插过程中, 两处理插穗內源ZR含量在愈伤组织和
根原基诱导期变化趋势相同 , 不定根伸长期相
反。表明插壤加热后插穗內源ABA和ZR含量升高
的趋势与插穗生根率提高的结果相同。
2 插壤温度对四倍体刺槐硬枝插穗酶活性的影响
插壤温度对插穗IAAO活性的影响主要体现
在根原基诱导期, 插壤加热后插穗IAAO活性在根
图2 硬枝插穗内源IAA、ABA和ZR含量变化
Fig.2 Change of endogenous IAA, ABA and ZR contents in hardwood cuttings
植物生理学报702
原基诱导期持续升高, 未加热插穗IAAO活性逐渐
降低(图3-A); 愈伤组织诱导期和不定根伸长期, 两
处理插穗IAAO活性变化趋势相同。
两处理插穗的POD活性(图3-B)和PPO活性
(图3-C)在扦插过程中同时升高, 然而, 插穗POD活
性变化幅度大于PPO活性, 加热插穗POD和PPO活
性升高幅度大于未加热插穗。
扦插过程中2个处理插穗之间的IAAO、POD
和PPO活性的方差分析表明, 两处理插穗之间的
IAAO活性(F=0.318, P=0.5851)、POD活性(F=
0.749, P=0.407)和PPO活性(F=1.376, P=0.268)差异
均不显著。由此推测, 插壤温度虽然可以影响插
穗体内氧化酶和抗氧化酶活性, 使其向着有利于
生根的方向发展, 但插壤温度不能改变插穗氧化
酶和抗氧化酶活性的变化趋势, 插壤温度主要是
改变氧化酶和抗氧化酶活性以外的生理生化因子
来调控插穗不定根的发生。
3 插壤温度对四倍体刺槐硬枝插穗营养物质含量
的影响
图4-A显示, 愈伤组织诱导期, 两处理插穗可
溶性蛋白含量同时下降, 加热插穗可溶性蛋白含
量下降的速度大于未加热插穗; 根原基诱导期和
不定根伸长期, 两处理插穗可溶性蛋白含量变化
趋势相反, 加热插穗可溶性蛋白含量迅速升高, 未
加热插穗可溶性蛋白含量继续下降。方差分析表
明, 扦插过程中, 加热插穗可溶性蛋白含量上升的
趋势显著(F=5.133, P=0.0469)。因此, 插壤温度对
四倍体刺槐硬枝插穗的促根作用与可溶性蛋白含
量升高有关, 且与根原基诱导期可溶性蛋白含量
迅速增加的关系更为密切。
图4-B表明, 两处理插穗可溶性糖含量的变化
趋势相同, 愈伤组织诱导期, 插穗可溶性糖含量升
高; 根原基诱导期, 先升高后降低; 不定根伸长期,
持续降低。扦插过程中, 加热插穗可溶性糖含量
始终大于未加热插穗, 两处理之间可溶性糖含量
差异显著(F=9.129, P=0.0129)。与可溶性糖的变
化不同, 扦插过程中, 两处理插穗的淀粉含量同时
下降, 加热插穗淀粉含量下降的速度虽然大于未
加热插穗, 但差异不显著(图4-C)。由此可见, 插壤
温度对四倍体刺槐硬枝插穗可溶性糖含量的影响
大于淀粉, 即可溶性糖含量升高的趋势对四倍体
刺槐扦插不定根发生的贡献大于淀粉。
同碳水化合物一样, 氮素化合物也是不定根
发育所不可缺少的营养物质。图4-D表明, 扦插过
程中, 两处理插穗植物总氮含量呈现动态变化, 加
热插穗植物总氮含量较未加热插穗略有下降。图
4-E则显示, 两处理插穗的C/N比值变化趋势与可
溶性糖含量的变化趋势相同, 即插穗可溶性糖含
量高, C/N比值就高; 插穗可溶性糖含量呈递增趋
势, C/N比值也表现出递增趋势; 反之亦然。方差
分析表明, 2个处理插穗的可溶性糖含量差异为显
著水平, 而C/N比值之间的差异达到极显著水平
(F=13.26, P=0.0045), 推测这种差异是由插穗总氮
含量的水平变化所致。
讨　　论
植物不定根的发生受多种内外因素的影响,
插穗内源激素水平与不定根发生的关系密切(Tsi-
pouridis等2006)。内源IAA是促进不定根发生的关
键激素。四倍体刺槐硬枝扦插时, 插壤经加热处
图3 硬枝插穗IAAO、POD和PPO活性变化
Fig.3 Change of IAAO, POD and PPO activity in hardwood cuttings
王小玲等: 插壤温度对四倍体刺槐硬枝插条生根过程中生理生化的影响 703
理后插穗内源IAA含量降低, 插穗生根率提高。推
测是由生长素IAA的双重作用所致, 未经加热处理
的插穗IAA含量过高抑制生根; 经加热处理的插穗
內源IAA含量降低, 促进生根。而有关促进四倍体
刺槐硬枝插穗生根的适宜內源IAA含量范围或者
促进四倍体刺槐硬枝插穗生根的IAA临界含量还
有待于进一步研究。ABA是一种生长抑制剂, 抑
制插穗不定根的发生。但也有研究表明, ABA通
过拮抗赤霉素抑制生根的效果来促进不定根的形
成。四倍体刺槐硬枝扦插研究发现, 插壤经加热
处理后插穗內源ABA含量升高, 表明ABA不是抑
制四倍体刺槐硬枝插穗生根的主要原因。细胞分
裂素ZR直接作用在酶上, 控制酶的活性, 和生长素
共同作用来促进细胞分裂、生长, 有利于扦插生
根, 四倍体刺槐硬枝扦插结果也支持了此结论。
IAAO、POD和PPO是与扦插不定根形成和
生长有密切关系的3种酶。IAAO能降解IAA, 调节
插穗体内的IAA水平。四倍体刺槐硬枝插穗不定
根形成过程中, 插壤温度升高, IAAO活性升高, 降
低了內源IAA含量, 诱导不定根的形成, 与Rout
(2006)和Dash等(2011)研究认为难生根树种插穗体
内IAAO活性高, IAA被破坏较多, 向插穗基部输送
的IAA含量减少, 对诱导生根不利的结论相反。
Szecsko等(2006)研究认为, 插壤温度对李树硬枝插
穗POD和PPO活性的影响较大。POD主要参与生
长素的代谢, 并促使细胞壁木质化。本研究中, 插
壤温度升高, 插穗POD活性升高较IAAO活性慢,
说明POD主要参与细胞壁的合成(Sato等1993)。据
报道(Yilmaz等2003; Kose等2011), 易生根树种扦
插后, PPO活性先升高, PPO抑制插穗切口氧化, 加
强插穗內源生长素的氧化应激能力(Sat isha等
2008), 促使根原基的形成和发展; 不定根长出后,
PPO活性降低, 插穗內源生长素的氧化应激能力减
弱, 促进不定根的伸长。四倍体刺槐硬枝插穗PPO
活性持续升高, 催化氧化酚成为邻苯二酚, 进而氧
化成O-苯醌的酶, O-苯醌酶不能及时还原, 聚合生
成黑色素而变成褐色 , 抑制生根 (Cheniany等
2010)。
碳水化合物和氮素化合物既是插穗不定根形
成和生长所不可缺少的, 也是在不定根形成之前
维持其生命活动的重要能源。导致有些植物或未
成熟的枝条生根困难的原因正是插穗组织内碳水
化合物储藏不足(敖红等2002)。可溶性蛋白虽然
只占蛋白质的一部分, 但是植物不定根形成过程
图4 硬枝插穗中可溶性蛋白、可溶性糖、淀粉和总氮含量及C/N比变化
Fig.4 Change of soluble protein, soluble sugar, starch, total nitrogen contents and C/N ratio in hardwood cuttings
植物生理学报704
能吸收利用的主要是可溶性蛋白质; 可溶性糖作
为呼吸基质, 为插穗体内的各种合成过程和生命
活动奠定了物质基础, 两者含量的变化与光合作
用密切相关。四倍体刺槐硬枝扦插研究中, 插壤
经加热处理, 插穗可溶性蛋白和可溶性糖含量显
著增加。淀粉含量属于数量性状, 受遗传基因和
环境多因素控制, 适宜的生长温度, 有利于插穗体
内淀粉酶活力增强, 加快储藏淀粉向可溶性糖的
转化速度。因此, 插壤温度升高后, 四倍体刺槐硬
枝插穗中淀粉向可溶性糖转化的速度加快。姚永
宏等(2006)认为总氮含量与茶树扦插生根关系不
密切, 而含笑扦插生根发现(田如英和丁贵杰2008),
总氮含量与生根密切相关。本研究中, 插壤温度
对四倍体刺槐插穗总氮含量的影响无差异, 但对C/
N比值影响的差异显著, C/N比值高时促进生根。
然而, 氮素化合物也是扦插生根所必须的营养物
质, 它不仅关系着根原基的形成, 也促进地下和地
上部分的生长。因此, 并不是总氮含量无限低, C/
N无限高, 生根力就好。设想是否需要一个最低的
氮素临界水平来满足生根的需要, 或者一个最高
的氮素临界水平来促进生根, 如果低于或高于这
一水平就抑制插条生根。
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