全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2016, 52 (5): 669–677 doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2016.0069 669
糯玉米‘沪五彩花糯1号’品系特异性2b-RAD分子标记的开发及应用
李全林1, 王义发2, 韩晴2, 袁政1,*, 沈雪芳2,*
1上海交通大学生命科学技术学院, 上海200240; 2上海市农业科学院, 上海201403
摘要: 应用基于IIB型限制性内切酶的RAD (2b-RAD)技术, 对‘沪五彩花糯1号’及其亲本材料进行了简并基因组测序。利用
RADtyping分型策略, 通过与‘B73’参考基因组比对, 我们在3个玉米样品的共同测序标签内筛选获得了9 726个单核苷酸多
态性(SNP)位点。在此基础上, 利用9 707个位于玉米染色体上的SNP位点对‘沪五彩花糯1号’及其亲本进行了基因型分析,
开发出可用于‘沪五彩花糯1号’品系特异性鉴定的9个SNP分子标记。这些研究结果为‘沪五彩花糯1号’品系特异性鉴定和
优质性状遗传组成的分子机理研究奠定了基础。
关键词: ‘沪五彩花糯1号’; 基因型; 2b-RAD; 品系特异性; SNP
收稿 2016-02-19 修定 2016-04-11
资助 上海市种业发展项目[沪农科种字(2013)第13号和沪农科
推字(2014)第1-3号]和上海市科委基础研究重大重点项目
(14JC1403901)。
* 共同通讯作者(E-mail: zyuan@sjtu.edu.cn; shenxue-
fang68@163.com)。
糯玉米是玉米wx基因发生隐性突变而选育获
得的一个具有丰富营养价值的玉米类型(Fedoroff
等1983), 表现为胚乳中淀粉主要为支链淀粉, 蛋白
质含量比普通玉米高3%~6%, 色氨酸、赖氨酸含
量均较高, 食用消化率高(梁龙金等2002)。我国是
糯玉米的起源地, 地方种质资源丰富; 据统计, 中
国国家种质库收录的糯玉米种质超过900份(聂术
君和陈发波2014)。然而, 目前我国在糯玉米育种
方面存在种质资源遗传基础狭窄、优异基因较
少、遗传多样性不足等问题(姚坚强等2013; 聂术
君和陈发波2014)。因此, 有必要利用分子生物学
技术对糯玉米进行基因型分析, 开发分子标记对
玉米品系的遗传多样性进行研究, 促进玉米种质
资源的高效利用、优异基因的发掘和分子辅助育
种技术的发展。
玉米的基因数量约为3.2万个, 碱基对数量大
约为23亿个, 其中约85%的玉米基因组由数百个转
座因子(transposable elements, TEs)家族组成
(Schnable等2009), 因此玉米是目前已测序植物中
基因组最复杂的品种之一; 同时, 玉米基因组中约
每60.8 bp存在一个单核苷酸多态性(single nucleo-
tide polymorphism, SNP) (Ching等2002), 为开发用
于玉米基因型鉴定、品系鉴定、高密度遗传图谱
构建、群体遗传结构分析及系统发育等领域的
SNP分子标记提供了遗传学基础(Yan等2010; Yang
等2011; 乐素菊等2012; 宋伟等2013; 郑德波等
2013)。然而, 由于测序成本高、分析技术要求高
等原因, 目前人们对地方种质资源进行全基因组
水平分子标记分析的研究仍然较少。近年来兴起
的限制性酶切位点相关DNA (restriction site-asso-
ciated DNA, RAD)测序(RAD-seq)是一种利用限制
性内切酶降低测序物种基因组复杂程度、反映部
分基因组序列结构信息的测序技术(Davey和Blax-
ter2011)。与单酶切RAD测序技术和双酶切RAD
(double digest RAD, ddRAD)测序技术相比, 基于
IIB型限制性内切酶的RAD (type IIB endonucleases
RAD, 2b-RAD)测序技术具有酶切DNA片段大小
一致、文库构建简单快速、标签密度易于调节、
成本低廉、准确性高等优势(Wang等2012)。该技
术已成功用于基因分型、高精度连锁图谱构建、
群体遗传结构分析、动植物重要经济性状的数量
性状基因座(quantitative trait locus, QTL)定位、系
统演化分析和分子流行病学研究等领域(Wang等
2012; Fletcher等2013; Seetharam和Stuart 2013; Guo
等2014; Jiao等2014; Li等2015; Pauletto等2016)。
上海在全国鲜食玉米育种和生产上占有重要
地位, 是我国鲜食玉米的主要消费市场之一。‘沪
五彩花糯1号’是由上海市农业科学院以‘申W48’为
母本、‘申W93’为父本选育而成的五彩花糯鲜食
糯玉米(沈雪芳等2010)。‘沪五彩花糯1号’因其早
熟、高产、籽粒较大、色彩丰富、皮薄糯性好、
适口性好等特点而具有良好的市场推广价值。然
而, 目前关于‘沪五彩花糯1号’品系鉴定、遗传多
样性及优质的分子基础等研究尚未展开。本研究
利用2b-RAD技术对‘沪五彩花糯1号’及其亲本‘申
W48’和‘申W93’基因组进行了简并基因组测序, 通
植物生理学报670
过生物信息学分析方法在3个玉米样品的共同测
序标签上筛选出9 707个位于染色体上的SNP位点,
在此基础上分析了‘沪五彩花糯1号’及其亲本的基
因型组成, 并进一步利用‘沪五彩花糯1号’特异的
SNP位点进行品系特异性验证, 为‘沪五彩花糯1
号’种质资源利用和改良提供理论参考。
材料与方法
1 材料
糯玉米(Zea mays L. var. ceratina Kulesh)品种:
‘沪五彩花糯1号’、‘申W48’、‘申W93’、‘沪紫黑
糯1号’、‘沪彩糯1号’和‘沪玉糯3号’; 材料均种植
于上海市农业科学院庄行综合试验站。
2 方法
2.1 基因组DNA提取和2b-RAD测序
采集‘沪五彩花糯1号’、‘申W93’和‘申W48’
玉米品种的幼叶置于−80°C冰箱保存备用。玉米
基因组DNA提取采用改良的十六烷基三甲基溴化
铵(cetyltrimethylammonium bromide, CTAB)法
(Springer 2010), 通过琼脂糖检测和NanoDrop 2000
紫外可见分光光度计(Thermo Scientific, USA)对抽
提基因组DNA样品的质量和浓度进行检测。
2b-RAD测序由上海欧易生物医学科技有限公司Il-
lumina HiSeq 2500二代测序平台完成, 质量控制参
照Wang等(2012)并略有改动(低质量序列定义: 大
于10个碱基的质量分数小于20)。利用Stacks软件
(Catchen等2011)对高质量reads进行聚类分析, 以
获得各样品的标签数目及测序深度。
2.2 全基因组范围SNP筛查和分型
全基因组标记分型参照RADtyping分型策略
(Fu等2013)。(1)选取包含BsaXI酶切位点标签的玉
米参考基因组序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ge-
nome/?term=Zea+mays+L)作为参考序列。(2)利用
华大基因开发的SOAP软件(Li等2009) (参数设置
为-M4 -v2 -r0)将高质量reads定位到参考序列上。
(3)利用最大似然(maximum likelihood, ML)法进行
SNP位点的标记分型, 分型条件为: 所选取标签内
不超过3个SNP的标签位点; 分型标签深度设置为
500以下。
2.3 ‘沪五彩花糯1号’及其亲本的基因型分析
分析‘沪五彩花糯1号’、‘申W48’、‘申W93’
等样品中染色体SNP位点的杂合率及样品间SNP
位点的差异程度, 设计基于‘沪五彩花糯1号’ SNP
位点的等位竞争PCR (allele-competitive PCR, AC-
PCR)引物(郑艳萍等2006), 进行‘沪五彩花糯1号’
及其亲本基因型的鉴定, 以验证其基因型分析。
所选20个SNP位点分别位于玉米10条染色体着丝
粒区域两侧, 引物信息如表1。
2.4 ‘沪五彩花糯1号’品系基因型特异性鉴定
根据表1所列引物对‘沪五彩花糯1号’、‘申
W93’、‘申W48’、‘沪紫黑糯1号’、‘沪彩糯1号’、
‘沪玉糯3号’等样品进行基因型鉴定 , 以便筛选
用于鉴定‘沪五彩花糯1号’品系特异性的SNP分子
标记。
实验结果
1 2b-RAD测序结果分析
利用2b-RAD测序技术构建玉米‘沪五彩花糯1
号’、‘申W93’和‘申W48’样品的标签测序文库, 测
序后共获得20 695 920条原始reads, ‘沪五彩花糯1
号’、‘申W93’和‘申W48’ 3个样品的平均测序reads
为6 898 640。参照Wang等(2012)的方法对原始
reads进行质量控制, 在3个样品原始reads中筛选出
含有BsaXI酶切位点高质量reads比例均在87%以
上(表2), 说明2b-RAD构建的玉米样品测序文库质
量较好。利用Stacks软件对高质量reads进行聚类
分析(Catchen等2011), 结果表明‘沪五彩花糯1
号’、‘申W93’和‘申W48’ 3个样品文库的平均标签
数为203 092, 平均测序深度为28× (表2)。
2 SNP分子标记在玉米中的分布
参照RADtyping分型策略(Fu等2013), 以玉米
‘B73’基因组为参考基因组, ‘沪五彩花糯1号’、‘申
W93’和‘申W48’ 3个样品中比对到参考基因组上
的平均标签数为150 383, 平均标签密度为7.27×10-2
个·kb-1, 测序标签覆盖度均在55.2%以上, SNP分子
标记密度均在3.78×10-3个·kb-1以上(表2和图1-A),
结果显示‘沪五彩花糯1号’等样品的SNP位点在测
序标签中分布不均匀, 且这种不均匀性并不是由
测序标签的覆盖率引起的。在‘沪五彩花糯1号’、
‘申W93’、‘申W48’等3个样品的65 524个共同测序
标签内筛选出9 726个SNP位点, 包括9 707个位于
玉米染色体上的SNP位点和19个非染色体SNP位
李全林等: 糯玉米‘沪五彩花糯1号’品系特异性2b-RAD分子标记的开发及应用 671
表
1
本
研
究
所
用
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8
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色
体
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: 3
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94
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0
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染
色
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9
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8
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C
C
C
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G
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G
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0
23
9
引
物
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有
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‘ 沪
五
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花
糯
1 号
’
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87
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11
×1
0-
2
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.5
0
4.
69
×1
0-
3
植物生理学报672
点, 其中, 9 707个SNP在玉米样品染色体上分布密
度为3.94×10-3~5.40×10-3个·kb-1, 平均密度约为
4.71×10-3个·kb-1 (表3和图1-B)。所筛选出的9 707
个SNP位点主要分布于基因间、基因上游和下游
序列(图1-C); 而在位于基因上的SNP位点中, 非同
义SNP和同义SNP比例分别为52%和48% (图
1-D)。
3 ‘沪五彩花糯1号’及其亲本的SNP位点基因型分析
在9 707个分布于玉米样品染色体上的SNP位
点中, 3个样品中SNP位点突变相同的为7 569个,
SNP位点突变存在差异的则为2 138个(图2-A)。在
2 138个样品间差异SNP位点中, ‘沪五彩糯1号’与
‘申W48’和‘申W93’的差异SNP位点分别为2 045和
2 123个, 说明‘沪五彩花糯1号’与亲本‘申W48’的基
图1 SNPs在玉米样品中的分布
Fig.1 Distribution of SNPs in maize sample
A: ‘沪五彩花糯1号’样品中测序标签与SNP分子标记的分布, 其中蓝色曲线为标签分布密度(个·Mb-1), 红色曲线为SNP分布密度(个·Mb-1);
B: SNP分子标记在玉米样品中的分布密度; C: SNP分子标记在玉米样品中的分布位置; D: SNP分子标记在玉米样品中的分布类型。
表3 SNPs在玉米染色体上的分布
Table 3 Distribution of SNPs in maize chromosome
染色体
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
总数/平均值
SNP位点数/个 1 560 1 129 1 069 1 306 999 749 794 691 788 622 9 707
SNP位点密度/个·kb-1 5.18×10-3 4.75×10-3 4.60×10-3 5.40×10-3 4.58×10-3 4.42×10-3 4.49×10-3 3.94×10-3 5.02×10-3 4.16×10-3 4.71×10-3
李全林等: 糯玉米‘沪五彩花糯1号’品系特异性2b-RAD分子标记的开发及应用 673
因型具有较高的一致性。此外, 同一条染色体上
不同样品间差异SNP位点占样品间无差异SNP位
点数的比例为25.25%~32.12%, 平均比例为28.25%
(图2-B); 在9 707个SNP位点中, ‘沪五彩花糯1号’、
‘申W48’和 ‘申W93’样品的SNP杂合率分别为
80.47%、99.82%和99.05%, 表明‘沪五彩花糯1号’
及其亲本的遗传多样性较好。
根据表1所示引物对‘沪五彩花糯1号’及其亲
本进行基因型分析验证。在20个引物对组合中, 19
个引物对组合(除9-2引物对组合外)特异性扩增出
图2 ‘沪五彩花糯1号’及其亲本的基因型分析
Fig.2 Genotyping analysis of ‘Huwucaihuanuo 1’ and its parent lines
A: SNP分子标记在玉米样品染色体上的分布; B: 不同类型SNP分子标记在玉米样品染色体上的分布。
植物生理学报674
图3 ‘沪五彩花糯1号’的品系特异性鉴定
Fig.3 Event-specific identification of ‘Huwucaihuanuo 1’
2-2、3-1、4-2、7-2、8-1、8-2、9-1、10-1和10-2均为引物对组合编号, 每个引物对组合包括2个引物对; 所有泳道1、3、5、7、9和
11中的条带依次为各引物对组合中5′端引物F1与3′端引物R扩增片段的电泳指纹图谱, 即不同引物对组合中的引物对1; 泳道2、4、6、8、
10和12中的条带均为各引物对组合中5′端引物F2与3′端引物R扩增片段的电泳指纹图谱, 即不同引物对组合中的引物对2; 引物对组合扩增
产物电泳指纹图谱中, 泳道1、3、5、7、9和11中条带位置与相应泳道2、4、6、8、10和12中条带位置相比小19 bp。
李全林等: 糯玉米‘沪五彩花糯1号’品系特异性2b-RAD分子标记的开发及应用 675
‘沪五彩花糯1号’样品的SNP位点杂合序列的差异
条带, 18个引物对组合(除4-2和9-2引物对组合外)
特异性扩增出‘申W48’样品的SNP位点杂合序列差
异条带, 15个引物对组合(除2-2、4-2、7-2、8-1和
9-2引物对组合外)特异性扩增出‘申W93’样品的
SNP位点杂合序列差异条带, 结果与样品间SNP差
异程度较一致。
4 ‘沪五彩花糯1号’的品系特异性鉴定
通过利用表1所示20个引物对组合对‘沪五彩
花糯1号’、‘申W48’、‘申W93’、‘沪紫黑糯1号’、
‘沪彩糯1号’、‘沪玉糯3号’等6个样品幼叶基因组
DNA进行AC-PCR, 以获得可以用于进行‘沪五彩
花糯1号’品系特异性分析的SNP分子标记。在20
个引物对组合中, 1-1、1-2、2-1、3-2、4-1、5-1、
5-2、6-1、6-2、7-1等10个引物对组合在6个玉米
样品中均可特异性扩增出SNP位点杂合序列差异
条带; 9-2引物对组合在6个玉米样品中均特异性扩
增出SNP位点条带; 其余9个引物对组合在6个玉米
样品中扩增产物的电泳指纹图谱则用于‘沪五彩花
糯1号’等样品的品系特异性鉴定。以‘沪五彩花糯
1号’样品为例, 2-2、3-1、4-2、7-2、8-1、8-2、
9-1、10-1、10-2等9个引物对组合均能在‘沪五彩
花糯1号’样品不同SNP位点上扩增出产物大小差
异带型, 即泳道1中条带与泳道2中条带的片段差
异为19 bp, 且3-1引物对组合和10-2引物对组合分
别在泳道1和泳道2中存在非特异性扩增片段条
带。重复性AC-PCR扩增实验表明‘沪五彩花糯1
号’的9个SNP位点电泳指纹图谱均一致吻合(图
3)。此外, 图3中所示的9个SNP位点的电泳指纹图
谱还可用于鉴定‘申W48’、‘申W93’、‘沪紫黑糯1
号’、‘沪彩糯1号’、‘沪玉糯3号’等品种。
讨 论
1 2b-RAD在玉米基因型分析中的优势
与RFLP、AFLP、SSR等传统基因分型技术
相比, SNP分子具有分布广泛、代表性强、稳定性
好、易于分析等优势, 但是SNP分子标记的获得依
赖于大规模、高通量的基因组数据分析。在玉米
中, 基因组碱基数较大、基因数量较少, 并表现出
高度的表型和遗传多样性, 因此复杂的玉米基因
组限制了S N P分子标记的开发。本研究利用
2b-RAD测序技术有效降低了‘沪五彩花糯1号’及
其亲本基因组的复杂程度, 获得了3个样品中共同
存在的65 524个基因组片段; 在此基础上, 通过生
物信息学方法快速筛选到9 726个SNP分子标记位
点, 成功开发出用于鉴定‘沪五彩花糯1号’品系特
异性鉴定的9个SNP位点。这些结果表明2b-RAD
测序技术不仅可快速、高效获取用于不同玉米品
系基因型分析的基因组片段, 还可开发用于玉米
品系特异性鉴定的SNP分子标记。
2 ‘沪五彩花糯1号’品系特异性鉴定的应用
近年来, 随着国民经济水平的提高, 鲜食糯玉
米因其丰富的营养价值和良好的适口性已成为深
受广大消费者喜爱的营养保健食品。然而, 目前
市场上的糯玉米品种存在多、乱、杂、优质品种
较少等现状, 同时假冒伪劣种子给农民造成巨大
的经济损失。‘沪五彩花糯1号’因其早熟、高产、
籽粒较大、色彩丰富、皮薄糯性好等特点具有良
好的市场推广价值。本研究利用2b-RAD测序技术
获得的‘沪五彩花糯1号’ SNP位点信息快速开发出
用于其品系特异性鉴定的SNP分子标记, 不仅为
‘沪五彩花糯1号’市场推广过程中的品种鉴定提供
了参考, 也为研究‘沪五彩花糯1号’的种质资源利
用及品种改良奠定了基础。
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李全林等: 糯玉米‘沪五彩花糯1号’品系特异性2b-RAD分子标记的开发及应用 677
Development and application of molecular markers for event-specific identification
of waxy corn ‘Huwucaihuanuo 1’ based on 2b-RAD technique
LI Quan-Lin1, WANG Yi-Fa2, HAN Qing2, YUAN Zheng1,*, SHEN Xue-Fang2,*
1School of Life Sciences and Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China; 2Shanghai Academy of Ag-
ricultural Sciences, Shanghai 201403, China
Abstract: In this study, based on the next-generation sequencing data of ‘Huwucaihuanuo 1’ and its parents ob-
tained by type IIB endonucleases RAD (2b-RAD) technology, we identified 9 726 single nucleotide polymor-
phisms (SNPs) compared to that of ‘B73’ reference genome. Among them, 9 707 SNPs were located to chromo-
somes and were used for genotyping analysis of ‘Huwucaihuanuo 1’ and its parents. Furthermore, we selected 9
SNPs to do molecular identification for ‘Huwucaihuanuo’ 1. These results therefore provide basis for genotyp-
ing, molecular identification and genetic exploiting of ‘Huwucaihuanuo 1’ in the future.
Key words: ‘Huwucaihuanuo 1’; genotyping; 2b-RAD; event specificity; SNP
Received 2016-02-19 Accepted 2016-04-11
This work was supported by the Project on Breeding from Agriculture Commission of Shanghai (Grant Nos. 2013-13 and 2014-1-3), and Key
Project on Basic Research from Science and Technology Commission of Shanghai (Grant No. 14JC1403901).
*Co-corresponding authors (E-mail: zyuan@sjtu.edu.cn; shenxuefang68@163.com).