全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (1): 51~56 51
收稿 2011-09-28　　修定 2011-11-14
资助 国家自然科学基金(30871596和30971866)和农业公益性行
业科研专项(201103005和201103003)。
* 通讯作者(E-mail: w-zhaohui@263.net; Tel: 029-87082234)。
硝酸还原酶抑制剂钨酸钠对油菜硝态氮积累的影响
杨荣, 邱炜红, 王朝辉*, 王小英
西北农林科技大学资源环境学院, 陕西杨凌712100
摘要: 采用溶液培养方法, 选取硝酸盐积累差异明显的两个油菜品种(低硝态氮积累品种‘红油3号’和高硝态氮积累品种‘中
双6号’, 研究苗期根系硝酸还原酶(NR)活性被抑制以后两个油菜品种叶片、叶柄和根系中NR 活性和硝态氮含量的变化。
结果表明: 1.0 mmol·L-1的NR活性抑制剂Na2WO4对两个油菜品种的根系NR活性抑制效果最佳; 根系NR活性被抑制以后, 两
个油菜品种的根系NR活性、硝态氮吸收速率均显著下降, 而硝态氮含量却显著上升; 且Na2WO4对‘中双6号’硝态氮吸收的
抑制程度强于其对‘红油3号’的抑制。叶片和叶柄的NR活性变化不显著, 但叶柄硝态氮含量显著下降, 叶片硝态氮含量稳
定, 且这一趋势在低积累品种‘红油3号’中表现得更为明显。
关键词: 油菜; 硝酸还原酶; 硝态氮; 硝酸还原酶抑制剂(Na2WO4)
Effects of Nitrate Reductase Inhibitor Na2WO4 on Nitrate Accumulation in
Oilseed Rape
YANG Rong, QIU Wei-Hong, WANG Zhao-Hui*, WANG Xiao-Ying
College of Resources and Environmental Science, Northwest Agricultural and Forestry University, Yangling, Shaanxi 712100, China
Abstract: A soilless culture (nutrient solution) experiment was conducted to study the effects of nitrate re-
ductase inhibitor Na2WO4 on nitrate reductase (NR) activity and NO3
--N content in some organs (including root,
leaf, petiole) of two different cultivars (high nitrate-N accumulation type ‘Zhongshuang 6’ and low nitrate-N
accumulation type ‘Hongyou 3’) oilseed rape (Brassica napus L.) at seedling stage. Results showed that the
most appropriate concentration of Na2WO4 was 1.0 mmol·L
-1; Na2WO4 significantly decreased NR activity and
NO3
--N absorption rate in the root of oilseed rape comparing with the control (CK), however, significantly in-
creasing in NO3
--N content. High nitrate accumulation type ‘Zhongshuang 6’ had higher inhibiter efficiency
comparing with low nitrate accumulation type ‘Hongyou 3’. There were no significant difference on NR activi-
ty in leaf and petiole with or without Na2WO4, in contrast, Na2WO4 significantly decreased NO3
--N content in
the petiole of oilseed rape, and NO3
--N content in the leaf was almost stable under it treatment, especially in
‘Hongyou 3’.
Key words: oilseed rape; nitrate reductase; nitrate-N; nitrate reductase inhibitor (Na2WO4)
硝态氮是植物最主要的矿质营养元素, 但在
自然条件下又常成为限制植物生长的主要因素, 高
浓度的硝态氮极易造成植物的奢侈吸收, 蔬菜尤
为如此。大量研究证明, 硝酸盐代谢的许多产物
与癌症有关, 如鼻咽癌、食道癌、胃癌及肝癌等,
此外也会导致婴幼儿致畸、致癌等(Ikemoto等2002;
Kelley和Duggan 2003; Santamaria 2006; Du等
2007)。自20世纪60年代以来, 世界各国都在致力
于蔬菜中硝酸盐污染成因及其控制途径的研究。
油菜(Brassica napus L.)不仅是我国的重要油
料产物, 因为其苗期植株茎叶细嫩, 又常被作为冬
季和早春食用蔬菜。但经相关学者研究, 其体内
硝酸盐含量却远远高出了我国关于蔬菜硝酸盐含
量的标准(GB 18406.1-2001) (王朝辉等2001; 朱飞
飞2009; 都韶婷和章永松2010), 长期食用不利于人
体健康。如何从油菜作物本身出发来探讨不同油
菜品种硝酸盐积累差异的机制, 筛选低硝酸盐积累
的油菜品种, 是解决其体内硝酸盐高积累的关键。
硝酸还原酶(NR)做为硝酸盐还原过程的关键
酶和限速酶, 其活性高低直接反映了植物对硝态
氮还原及转化能力的强弱, 与植物吸收和积累硝
植物生理学报52
态氮的能力密切相关(Crawford 1995; Vidal和
Gutiérrez 2008)。NR为同聚多亚基蛋白, 每个亚基
含有3个辅基: 黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、细胞
色素(Cytc)以及钼辅因子(MoCo), 每个辅基就是一
个氧化还原中心(Redinbaugh和Campbell 1985;
Crawford 1995; Heidari等2011; Anjana等2011)。钼
原子(Mo)是NR的重要组成部分, 直接关系到硝酸
盐还原过程的电子转移, 而钨原子(W)性质与钼原
子相似, 可以直接取代NR复合体中的钼, 从而起到
抑制NR活性的作用(Heimer等1969; Aslam 1982;
Deng等1989; Quy等1991; L’vov等2002; Moura等
2004; Yu等2010), 故Na2WO4常被作为NR活性的抑
制剂。
目前大部分的学者认为, 植物硝酸盐的还原
作用首先发生在绿色叶片中, 然而也有部分学者
认为根系硝酸盐还原能力在氮素利用早期具有不
可比拟的作用(Gojon等1986; Stoimenova等2003)。
虽然植物根系硝酸盐还原能力最大仅占整个植株
还原能力的23%~37% (Scheurwater等2002), 但目
前仍还没有被完全理解, 这主要与研究根系NR的
难度之大有关。此外关于根系NR与地上部各器官
硝态氮含量的关系的研究还鲜见报道, 也鲜见从
抑制根系NR活性角度出发来研究各器官NR、硝
态氮含量变化以及这种变化和叶柄硝态氮高积累
关系的报道。为解决这一问题, 本研究选取了前
期试验筛选所获得的生物量没有显著差异, 但硝
态氮积累能力不同的两个油菜品种(‘红油3号’和
‘中双6号’), 通过添加NR抑制剂Na2WO4, 抑制根系
NR活性, 结合根系吸收速率、各器官NR活性、硝
态氮含量变化, 研究根系NR活性被抑制以后对各
器官硝态氮积累的影响以及探讨根系NR活性与不
同油菜品种叶柄硝态氮积累差异的关系, 从而为
降低蔬菜体内硝酸盐含量, 提高植株氮利用效率
提供理论依据。
材料与方法
1 试验材料
选取前期筛选所得的硝态氮含量差异显著的
两个油菜(Brassica napus L.)品种: ‘红油3号’和‘中
双6号’。水培营养液参考完全大泽营养液和Arnon
营养液，稍作修改。营养液中养分含量如下: NaNO3
12 mmol·L-1; KH2PO4 1 mmol·L
-1; K2SO4 2 mmol·L
-1;
MgSO4·7H2O 2 mmol·L
-1; CaCl2 4 mmol·L
-1; H3BO3
2.86 mg·L-1; MnSO4·H2O 1.54 mg·L
-1; ZnSO4·7H2O
0.22 mg·L-1; CuSO4·5H2O 0.08 mg·L
-1; H2MoO4 0.02
mg·L-1; Fe-EDTA 3.0 mg·L-1。
油菜种子经100 mL的NaClO (1%)消毒20 min
后, 再用100 mL的蒸馏水冲洗6次。将消毒后的种
子放到铺有滤纸的培养皿中, 加入一定量的蒸馏
水使滤纸完全湿润, 之后放到恒温培养箱中, 黑暗
条件下于25 ℃下培养24 h。待种子露白后, 将其
播于已准备好的基质培养穴盘中。待幼苗长至二
叶一心时, 洗去根系基质, 再将幼苗移入装有5.2 L
1/4浓度上述营养液的硬质不透明塑料盆中。每盆
用海绵固定同一品种4株, 每个品种培养16盆。之
后放入植物生长室内培养 , 温度设定为25~30
℃/15~20 ℃(白天/晚上), 光照时间为10 h (8:00~
18:00), 室内相对湿度为60%±5%, 光照强度为180
μmol·m-2·s-1。
用1/4营养液培养2 d后, 换为1/2营养液, 培养
一周以后换为完全营养液培养, 之后每3 d换一次
营养液。营养液每天保持上下午各通气1 h, pH用
0.1 mmol·L-1的NaOH和H2SO4调在6.0~6.5之间。由
于植物对水分的吸收以及蒸腾作用, 需每天定时
(18:00)补充蒸馏水以保持原营养液的体积。继续
培养15 d后, 将营养液更换为无氮营养液, 进行饥
饿处理, 2 d后取油菜幼苗用于试验。
2 试验方法
2.1 对不同油菜品种根系NR活性起最强抑制作用
的Na2WO4浓度筛选试验
将出苗35 d的油菜秧苗取出, 将其根部浸入添
加Na2WO4的营养液中, Na2WO4处理浓度分别为:
0、0.4、0.8、1.0、1.3 mmol·L-1, 吸收3 h后测定各
处理油菜根系NR活性, 筛选出对油菜根系NR活性
抑制最强的Na2WO4浓度。
2.2 根系NR活性受抑条件下不同油菜品种各器官
硝态氮积累的影响试验
每个品种各选长势一致的3株幼苗为一组, 作
为一个处理, 每个处理重复4次。将幼苗根部浸入
到1 000 mL添加Na2WO4 (1.0 mmol·L
-1)的营养液
(实验组: TR)中, 以不添加钨酸钠的营养液为对照
(对照组: CK)，处理与对照溶液中均含1.0 mmol·L-1
杨荣等: 硝酸还原酶抑制剂钨酸钠对油菜硝态氮积累的影响 53
NO3
-。营养液用分析纯Ca(NO3)2、Na2WO4配制,
支持电解质为0.2 mmol·L-1的CaSO4, 各处理的pH
值均为6.0。
试验时将油菜幼苗根系完全浸入到1 000 mL
的上述营养液中, 在温度(25±1) ℃、光照强度180
µmol·m-2·s-1、相对湿度65%~80%条件下培养, 分
别在0、0.5、1.0、2.0、3.0 h吸取5 mL营养液进行
硝态氮含量的测定, 每次取样后随即加入5 mL电
解质(0.2 mmol·L-1 CaSO4)以补充溶液到起始体
积。吸收结束后, 取出幼苗, 将每组油菜根部剪下,
轻轻擦干水分, 称量每组总根重。根系吸收前后
溶液中硝态氮含量用流动分析仪测定, 根据吸收
前后硝态氮含量的变化量计算根单位鲜重在单位
时间内硝态氮的净吸收率。
然后把油菜按器官(叶柄、叶片、根系)分开,
称量各器官的重量, 分别切碎混匀, 分为2个部分:
用于测定硝态氮部分的样品放入冰箱0~4 ℃条件
下冷藏; 另一部分样品用于测定NR活性, 当天完成
测定。
3 测定方法
NR活性采用活体法测定(李合生2000); 硝态
氮含量测定采用研磨浸提法 (王朝辉和李生秀
1996), 浸提液用连续流动分析仪测定; 植株从营养
液中吸收的硝态氮含量由营养液中起始硝态氮含
量与培养后硝态氮含量之差计算。试验所获得的
数据均经过SAS统计分析, SigmaPlot作图, 方差分
析采用Fisher’s LSD test。
实验结果
1 Na2WO4浓度对油菜根系NR活性的影响
Na2WO4处理有效降低了两个油菜品种根系
NR活性(图1)。当Na2WO4浓度由0增加至1 mmol·L
-1
时, 两个油菜品种根系NR活性随着Na2WO4浓度的
增加呈逐渐下降趋势(图1), 当Na2WO4浓度达到1.0
mmol·L-1时, 油菜根系NR活性几乎接近于0 mmol·L-1;
Na2WO4浓度由1.0 mmol·L
-1增加至1.3 mmol·L-1时,
两个油菜品种的根系NR活性则几乎不再发生变
化。由此可见, Na2WO4浓度为1.0 mmol·L
-1时可有
效地抑制油菜根系NR活性。
2 Na2WO4对两个油菜品种各器官NR活性的影响
培养液中添加Na2WO4后, 显著降低了两个油
菜品种根系的NR活性, 但叶片和叶柄中NR活性并
未显著下降(表1)。‘红油3号’未加入Na2WO4时, 根
系NR活性为59.53 μg (NO2
-)·g-1 (FW)·h-1, 当加入
Na2WO4后, 根系NR活性降至5.15 μg (NO2
-)·g-1
(FW)·h-1, 降低了54.38 μg (NO2
-)·g-1 (FW)·h-1; ‘中双6
号’由34.40 μg (NO2
-)·g-1 (FW)·h-1降至0.37 μg (NO2
-)·g-1
(FW)·h-1, 降低了34.03 μg (NO2
-)·g-1 (FW)·h-1; 两个
油菜品种叶片和叶柄中NR活性很低(表1), 均小于
0.7 μg (NO2
-)·g-1 (FW)·h-1, 且两个油菜品种叶片和
叶柄中NR活性受Na2WO4影响较小, 均未产生显著
表1 两个油菜品种各器官NR活性
Table 1 Nitrate reductase activity in different organs of the
two oilseed rape cultivars
器官 处理 NR活性/μg (NO2
-)·g-1 (FW)·h-1
叶片 CK ‘红油3号’ 0.67±0.11a
TR ‘红油3号’ 0.50±0.15a
CK ‘中双6号’ 0.67±0.11a
TR ‘中双6号’ 0.60±0.05a
叶柄 CK ‘红油3号’ 0.03±0.01ab
TR ‘红油3号’ 0.09±0.04a
CK ‘中双6号’ 0.02±0.01b
TR ‘中双6号’ 可略而不计
根系 CK ‘红油3号’ 59.53±3.73a
TR ‘红油3号’ 5.15±1.09c
CK ‘中双6号’ 34.40±6.32b
TR ‘中双6号’ 0.37±0.03d
　　不同小写字母代表两个油菜品种Na2WO4处理前后同一器官
中NR活性差异显著(P<0.05)。
图1 不同Na2WO4浓度对油菜根系NR活性的影响
Fig.1 Effects of different concentrations of Na2WO4 on the
nitrate reductase activity of oilseed rape root
不同小写字母代表同一油菜品种不同Na2WO4浓度处理之间
的根系NR活性差异显著(P<0.05)。
植物生理学报54
性差异。这说明在本试验条件下, 两个油菜品种
根系NR活性被抑条件下, 对其叶片和叶柄中NR活
性并无显著影响, 而低积累品种根系起始NR活性
高, 受抑后降低幅度为91%, 较小于高积累品种的
99%。
3 根系NR活性受抑条件下, 两个油菜品种根系硝
态氮吸收速率的变化
根系NR活性被抑制以后, 两个油菜品种对硝
态氮的吸收速率明显下降(图2), 经差异显著性分
析, 除了在刚开始的0.5 h以及1 h中的‘红油3号’
外, 其余时间里, 两个品种对照组和实验组硝态氮
吸收速率均达到显著性差异。高积累品种‘中双6
号’吸收速率下降的幅度较大, 可达4.03 μmol·g-1
(FW)·h-1, 低积累品种‘红油3号’下降最快时为2.30
μmol·g-1 (FW)·h-1。
讨　　论
本试验结果表明抑制两个油菜品种根系NR
活性的最佳Na2WO4浓度为1.0 mmol·L
-1 (图1), 这与
其他研究者的研究结果并不一致, 如, 梁亮(2008)
研究发现抑制小白菜根系NR活性的最佳Na2WO4
浓度为0.8 mmol·L-1, 而司江英等(2004)研究发现抑
制水稻根系NR活性的最佳浓度为0.15 mmol·L-1,
这说明不同植物根系NR活性对硝酸还原酶抑制剂
Na2WO4的响应不同, 达到最强抑制效果所需浓度
不同。
Deng等(1989)研究发现根系硝酸还原酶活性
被抑制以后, 显著影响NR的还原能力, 会造成根系
硝态氮的大量积累, 本试验发现相同结果。两个
油菜品种根系加入Na2WO4以后, 根系中的硝态氮
含量显著升高, 而根系对硝态氮的吸收能力显著
下降。从品种来看, 根系NR活性被抑以后, 原本根
系NR活性较高的低积累品种‘红油3号’NR活性降
低了91%, 吸收速率4 h内平均下降了66%, 而高积
累品种‘中双6号’根系NR活性的降幅为99%, 吸收
速率平均下降了73%, 这说明根系NR活性不仅决
定了根系的还原能力, 也影响着根系对硝态氮的
吸收速率。根系氮素在正常的还原条件下, 还原
产物会调节整个植物体氮素状况的信息, 而这一
信息又调节氮素同化产物的反馈抑制作用, 反过
来作用于根系中相关基因的表达, 从而影响根系
对氮素的吸收(Tsujimoto等2007; Patterson等2010)。
图2 Na2WO4对两个油菜品种硝态氮吸收速率的影响
Fig.2 Effects of Na2WO4 on NO3
--N uptake rate by two oilseed
rape cultivars
不同小写字母代表同一时间同一油菜品种Na2WO4处理与否
硝态氮吸收速率差异显著(P<0.05)。
4 根系NR活性受抑条件下, 两个油菜品种各器官
硝态氮含量的变化
根系NR活性被抑制后, 根系硝态氮含量显著
升高, 叶柄硝态氮含量显著下降, 而叶片硝态氮含
量则无显著变化(图3)。对照与处理相比, 根系NR
活性被抑制后高积累品种‘中双6号’根系硝态氮含
量提高了108%, 低积累品种‘红油3号’则提高了
71%; 叶柄硝态氮含量, 高积累品种‘中双6号’下降
幅度较小, 降低了5.5%, ‘红油3号’降幅较大, 降低
了11.9%; 叶片硝态氮含量虽然有所升高, 但处理
与对照差异不显著。
图3 Na2WO4对两个油菜品种不同器官硝态氮含量的影响
Fig.3 Effects of Na2WO4 on NO3
--N concentration in different
organs of two oilseed rape cultivars
不同小写字母代表两个油菜品种在Na2WO4处理与否同一器
官中硝态氮含量差异显著(P<0.05)。
杨荣等: 硝酸还原酶抑制剂钨酸钠对油菜硝态氮积累的影响 55
笔者认为, 较高的根系NR活性, 提供了其较强的根
系还原能力和吸收能力, 而根系较高的NR活性、
较低的硝态氮吸收速率以及根系NR活性被抑制以
后存有的NR活性的大小可能是造成低积累油菜品
种根系硝态氮积累较低以及叶柄硝态氮含量低的
重要原因。此外, 根系NR活性的下降引起其中硝
态氮大量积累, 但根系中大量积累的硝态氮并没
有促成叶柄中硝态氮含量的迅速增加, 其含量反
而降低(图3), 说明根系NR活性受抑制条件下, 大
量积累于根系中的硝态氮并没有被运输到地上部
分。这可能的原因是, 一方面, 植物对硝态氮的吸
收和向上运输硝态氮均是主动运输的过程, 需由
跨质膜的质子电化学梯度提供能量, 梁亮(2008)、
Hansch等(2001)发现, NR活性被抑制以后, 根系可
溶性糖也会大量积累。糖类的不正常代谢, , 从而
影响了能量的供应, 进而制约硝态氮的运输; 另一
方面, 在硝态氮为唯一氮源的状态下, 植物根系NR
活性被抑制以后, 硝态氮的还原无法正常进行, 根
系中氮代谢下游的氨基酸无法产生, 阻碍了下游
信号的传递, 使植株无法对氮素进行正常的分配
和转移(Hansch等2001; Flores等2004; Krouk等
2010)。但是否可以在油菜收获前期进行短时间的
NR活性抑制处理以降低其体内硝酸盐含量, 这还
有待进一步试验的验证和肯定, 但此不失为一种
新的思路。
对植物生长而言, 细胞质中硝态氮担任着重
要角色, 故当地上部缺氮时, 叶柄液泡储存的大量
硝态氮会被调动出来运输至叶片细胞质中以补充
被代谢掉的硝态氮, 使叶片中硝态氮含量保持在
相对稳定状态(汪晓丽2010; Fan等2007; 沈其荣等
2003; Granstedt和Huffaker 1982)。本实验也证实
了这一结论, 在根系NR活性被抑制的条件下, 造成
油菜地上部缺氮, 叶柄硝态氮含量显著下降, 然而
叶片硝态氮却保持相对稳定(图3)。此外, 针对不
同品种间硝态氮在根系吸收受抑条件下的再利用
能力而言, ‘红油3号’叶柄硝态氮含量下降11.9%,
‘中双6号’硝态氮下降了5.5%, 叶片增加的硝态氮
含量相对应的分别为5.7%和4.2%, 说明低积累品
种‘红油3号’叶柄中硝态氮被运输出来, 而补充到
叶片中因同化过程所造成的硝酸盐浓度减少的速
度较高积累品种‘中双6号’快。但叶柄是如何将硝
态氮调动出来以维持叶片细胞质中硝态氮的正常
代谢 , 其具体机制还有待于进一步的研究和探
索。
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