全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (11): 1982~1990　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.04661982
收稿 2015-08-26　　修定 2015-10-30
资助 国家林业公益性行业科研专项重大项目(201204403)、湖
南省研究生科研创新项目(CX2015B292)和中南林业科技
大学研究生科技创新基金(CX2015B11)。
* 通讯作者(E-mail: tanxiaofengcn@126.com; Tel: 0731-
85623416)。
油桐LACS4和LACS8基因克隆及其表达分析
李捷宇, 龙洪旭, 张琳, 王哲, 李泽, 谭晓风*
中南林业科技大学经济林培育与保护省部共建教育部重点实验室, 长沙410004
摘要: 以油桐的近成熟种子为材料, 根据油桐转录组测序结果设计引物, 采用RT-PCR技术克隆了油桐长链脂酰辅酶A合成
酶基因家族的两个成员的全长cDNA序列, 分别命名为VfLACS4 (GenBank登录号: KP996689)和VfLACS8 (GenBank登录号:
KT362743), 通过实时定量PCR的方法检测了不同组织部位和种子不同发育时期该基因的表达水平, 并采用索式提取法测
定了种子发育时期的油脂含量。结果表明: VfLACS4的CDS长度为1 989 bp, 编码662个氨基酸, 与其他物种的LACS4氨基酸
序列具有较高的相似性, 其中与蓖麻的LACS4相似性最高; VfLACS8的CDS长度为2 199 bp, 编码732个氨基酸, 与麻疯树和
蓖麻的LACS8具有较高的相似性; 实时定量RT-PCR结果表明VfLACS4基因在花、茎、叶和根中均有少量表达, 并在种子发
育的10月10日表达量达到最大; VfLACS8基因在种子、花、茎、叶和根中均有一定量的表达, 在雌蕊中的表达量最高; 油桐
种子发育过程中的油脂积累呈现出“S”型, VfLACS8基因的在发育种子中的表达模式与之相一致, 推测VfLACS8基因与种子
发育过程中的油脂积累相关。
关键词: 油桐; LACS4; LACS8; 基因克隆; 基因表达
Isolation and Expression Analysis of LACS4 and LACS8 from Vernicia fordii
LI Jie-Yu, LONG Hong-Xu, ZHANG Lin, WANG Zhe, LI Ze, TAN Xiao-Feng*
The Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees, Ministry of Education, Central South University of
Forestry and Technology, Changsha 410004, China
Abstract: Primers were designed according to the results of the transcriptome sequencing analysis of Vernicia
fordii, two LACS family members named VfLACS4 and VfLACS8 were isolated from nearly ripe seed in Verni-
cia fordii with the method of RT-PCR. Their expression in different tissues and different developmental stages
of seed was checked with qRT-PCR. The oil content of different developmental stages of seed was determined
by soxhlet extraction. The CDS of VfLACS4 is 1 989 bp which codes a predicted protein of 662 amino acids.
The amino acid identity compared with others is highly conserved and showed the highest similarity with the
LACS4 of Ricinus communis. The CDS of VfLACS8 is 2 199 bp which codes a predicted protein of 732 amino
acids. The amino acid identity compared with others is highly conserved and showed the highest similarity with
the LACS8 of Jatropha curcas and Ricinus communis. The real-time RT-PCR result showed that VfLACS4 ex-
pressed not much in flower, stem, leaf and root, but reached the highest level in October 10th in developing
seed; VfLACS8 expressed in seed, flower, stem, leaf and root, and reached the highest level in pistil. The expres-
sion mode of VfLACS8 in developmental seed is as same as the pattern of oil accumulation, VfLACS8 gene was
speculated that it was related to oil accumulation in the process of seed development.
Key words: Vernicia fordii; LACS4; LACS8; gene cloning; gene expression
油桐(Vernicia fordii)属大戟科(Euphorbiaceae)
油桐属(Vernicia), 是我国特有的经济林木, 与油
茶、核桃、乌桕并列为我国四大木本油料植物(谭
晓风2006)。桐油是优质干性油, 是重要的工业油
料(吴传万等2004), 具有干燥快、耐酸耐碱、附着
力强等优良性能(孙颖等2007), 是制造涂料、油
漆、生物柴油和高分子材料的重要生产原料。油
料作物种子中的油脂主要以三酰基甘油(TAG)的
形式贮存(Shen等2006), TAG是由作为底物的甘
油-3-磷酸和脂肪酰辅酶A硫酯在酰基转移酶作用
下通过Kennedy循环途径合成的。在细胞内脂肪
酶催化水解的游离脂肪酸具有毒性, 长链脂酰辅
李捷宇等: 油桐LACS4和LACS8基因克隆及其表达分析 1983
酶A合成酶(long chain acyl-CoA synthetase, LACS)
基因家族能够活化游离的脂肪酸成为无毒的酰基
辅酶A硫酯, 从而参与TAG的合成, 该硫酯还参与多
种代谢途径, 如跨膜转运、信号化、转录调节等,
并且是β-氧化的底物(Shrago 2000; Watkins 1997)。
酰基辅酶A合成酶根据其碳链长度不同有短
链、中链和长链之分, 长链脂酰辅酶A合成酶反应
机制分两部分进行, 首先, 游离的脂肪酸同ATP反
应生成腺苷化的中间体; 然后, 该中间体和辅酶A
的硫酯键结合, 生成酰基辅酶A。具体反应如下:
① Fattyacid+ATP←→ [fatty acyl-AMP]+PPi;
② [fatty acyl-AMP]+CoA-SH→fatty acyl-S-CoA+
AMP
LACS 含有AMP 结合域标签, 为高度保守的
氨基酸序列, 该序列是AMP结合蛋白超家族的标
志(Babbitt等1992)。研究表明, LACS在多种生命
体中均存在并参与有机体代谢, LACS存在于大肠
杆菌、酵母、哺乳动物中并发挥重要的作用。克
隆得到大肠杆菌的LACS命名为fadD基因, 与长链
脂肪酸转运相关(Black等1992); 酵母Faa1P和
Faa4P对长链脂肪酸的进入至关重要, 表明这两个
酶或其中之一是脂肪酸运输系统的组成部分
(Faergeman等2001); 目前已克隆得到5个大鼠ACS
基因 , 其中ACS1、ACS4和ACS5在肝脏中表达
(Lewin等2001)。在高等植物中也发现有LACS参
与细胞反应, 且认为植物较哺乳动物或酵母含有
更多LACS (Fulda等2002), 目前分析找到的拟南芥
基因组中LACS基因家族成员有9个, 命名为LACS1
到LACS9, 它们各自具有不同的表达模式和功能。
LACS1在萌发后3~5 d表达水平最高, 在成熟期主
要表达在花、花序和茎中(谭小力2003), LACS2在
幼嫩的组织叶、根、花芽、花和角果中有大量表
达, 推测与角质的合成有关(Schnurr等2004); 实验
证实LACS6和LACS7定位于过氧化酶体中, 推测可
能参与酰基辅酶A的过氧化物酶体β-氧化途径(Ha-
yashi等2002; Fulda等2002, 2004); LACS9是主要存
在于叶绿体中, 与脂肪酸的合成相关(Schnurr等
2002)。研究表明大豆中GmLACS2定位于过氧化
物酶体, 可能参与种子萌发并且与脂肪酸和脂质
降解有关(于莉莉等2011); 在油菜(Brassica napus)
中也有LACS发现, 它们在胚发生期和花期有强烈
表达(Pongdontri和Hills 2001), 棉花中的GhACS1与
花粉的形成相关(Wang和Li 2009), 在蓖麻、水稻
中也克隆得到了LACS家族的基因(He等2007; Ichi-
hara等2003), 但在林木中鲜少有与LACS相关的研
究。近年来资源过度开发利用, 如何挖掘油桐这
一宝贵资源在生物质能源等领域的重要作用已成
为当前科研的重要任务, 油桐的相关生理研究陆
续开展且已有油桐立体叶片通过间接器官发生途
径获得再生植株的报道(谭晓风等2013), 并成功建
立了油桐叶柄高效可行的再生体系 (林青等
2014)。本研究以油桐的近成熟种子为材料, 从分
子生物学的角度通过对油桐长链脂酰辅酶A合成
酶基因LACS4的分离克隆和该基因的表达情况进
行检测, 为进一步研究油桐脂肪酸的生物合成与
代谢调控从而提高含油率提供理论依据。
材料与方法
1 材料
1.1 植物材料
采用的油桐(Vernicia fordii Hemsl.)近成熟种
子来自于湖南省永顺县青坪镇油桐基地-中南林业
科技大学国家油桐种质资源保存库。2013年8月
底采集油桐近成熟种子为实验材料, 保存于–80 ℃
冰箱中。2014年7月至2014年11月分别采集油桐
不同组织部位和不同时期种子用于荧光定量PCR
分析。
1.2 试剂
PureLinkTM RNA Mini Kit购自Invitrogen公司,
大肠杆菌Trans-T1感受态细胞、pEASY-Blunt Sim-
ple Cloning Kit购自全式金公司, RevertAid First
Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司, 高
保真DNA聚合酶PrimeSTAR HS DNA Poly-
merase、2×ExTaq PCR SuperMix、定量PCR试剂
2×SYBR Green qPCR Mix购自Takara公司, 100 bp
Plus DNA Ladder购自Solarbio公司, 琼脂糖凝胶
DNA回收试剂盒购自博日公司, 引物合成及测序
分别由华大基因和博尚生物公司完成。
1.3 主要仪器设备
PCR仪S1000TM Thermal Cycler, 荧光定量PCR
仪C1000TM Thermal Cycler, 离心机AllegraTM X-22R
Centrifuge。
植物生理学报1984
2 方法
2.1 总RNA的提取
参照Invitrogen公司的PureLinkTM RNA Mini
Kit试剂盒的方法进行, 提取油桐不同组织部位以
及种子不同时期的总RNA。利用1.0%琼脂糖凝胶
电泳检测总RNA的完整性, 用紫外/可见光分光光
度计(Lambda35, Perkin Elmer, USA) 检测核酸的纯
度。采用TaKaRa公司的cDNA合成试剂盒, 方法参
照试剂盒说明书, 得到第一链cDNA。
2.2 油桐LACS4基因和LACS8基因的克隆
从油桐转录组测序结果中获得L A C S 4和
LACS8基因的全长序列, LACS4基因的开放阅读框
为1 989 bp, LACS8的开放阅读框为2 199 bp。利用
Primer Premier 5软件设计引物, 上游引物分别为
L4F1: 5-ATGGCGGCGAGGAAGTATCT-3和
L8F1: 5-ATGGAAGATTGTAAGGGAAGAT-3; 下
游引物分别为L 4 R 1 : 5 - C TA G G C A C T G G -
GCTTGCTCG-3 和L8R1: 5 -TCACTCATA-
GAGCTTTTGAAGC-3, 以油桐近成熟种子反转录
单链cDNA为模板, 进行PCR扩增。PCR反应体系
(20 μL): 5×Prime STAR Buffer (Mg2+) 4 μL, dNTP
Mixture 1.6 μL, 上下游引物各0.4 μL, 模板cDNA
0.4 μL, Prime STAR HS 0.2 μL, dH2O 13 μL。扩增
条件: 94 ℃ 2 min; 94 ℃ 30 s, 65 ℃ 40 s, 72 ℃ 90 s,
30个循环; 72 ℃ 7 min; 4 ℃保持。将PCR产物用琼
脂糖凝胶D N A回收试剂盒回收 , 回收产物与
pEASY-Blunt Simple载体连接, 并转化大肠杆菌
Trans-T1感受态细胞, PCR鉴定后将阳性结果送博
尚生物公司测序。
2.3 序列分析和结构预测
利用NCBI的BLAST功能对测序结果进行检
索, DNAman和GENDOC进行序列分析和氨基酸
翻译, 用在线软件ProtParam (http://web.expasy.org/
protparam/)分析和预测蛋白质的理化性质如分子
量、等电点等; 用Clustalx和MEGA4.0软件进行多
序列比对并计算构建油桐LACS4的聚类分析图;
并运用在线软件(http://www.predictprotein.org/)预
测蛋白质二级结构。
2.4 实时定量RT-PCR
取各试材的总RNA, 以Oligo-d(T)为引物, 反
转录按RevertAid FirstStrand cDNA Synthesis Kit说
明书进行。用反转录后的cDNA做模板, 设计实时
定量PCR引物, 上游引物分别为L4-F1: 5-ATG-
GCTTCAATGGGGACTTCAAATC-3和L8-F1:
5-TGGGAGAATATGAATGGGAAACCT-3; 下游
引物分别为L4-R1: 5-TCACGTTCTATGTCAAAT-
GGCTCAG-3和L8-R1: 5-CATCCCTGGAAG-
GAAATGAACCAC-3, 扩增长度分别为159 bp和
150 bp。
琼脂糖凝胶电泳检测结果表明, 两对引物均
能扩增出特异的目的片段 , 而且没有引物二聚
体。实时定量PCR的反应体积为12 μL, 包括1 μL
cDNA (RNA为2 μg), 6.25 μL 2×SYBR Green qPCR
Mix, 浓度为10 μmol·L-1的正反向引物各0.5 μL, 剩
余体积用超纯水补足至12 μL, 每个反应重复3
次。定量PCR反应程序: 95 ℃ 30 s; 95 ℃ 5 s, 55
℃ 30 s, 39个循环。使用BIO-RAD公司Mini option
定量PCR仪 , 八联排管完成PCR反应。以油桐
GAPDH作为内参基因(Han等2012), 上游引物
GAPDHF: 5-CTGCTAAGGCTGTTGGGAAG-3,
下游引物GAPDHR: 5-TCCCTCTGACTCCT CC-
TT GA-3, 无菌水模板为阴性对照。
2.5 种子成熟过程中油脂含量测定
取种子发育的7月1日到10月20日各时期种子
剥皮风干, 采用索式提取法测定油桐种子各个时
期的油脂含量, 从而得出油桐种子成熟过程中的
含油率。
实验结果
1 油桐LACS4基因克隆与序列分析
以油桐近成熟种子总RNA (图1-A)反转录的
单链cDNA为模板, 用特异性引物(L4F1、L4R1、
L8F1、L8R1)分别进行扩增得到目的片段并回收,
将回收的目的片段连接到pEASY-Blunt Simple上,
转化大肠杆菌Trans-T1感受态细胞, 检测获得阳性
克隆后测序。测序结果显示两个基因的序列与转
录组测序的序列一致性为100%, 最终确认为油桐
LACS4和LACS8基因的全长cDNA序列。LACS4基
因全长1 989 bp (图1-B), 编码662个氨基酸, 长度与
其他物种的LACS4基因相近; LACS8基因全长2 199
bp (图1-C), 编码732个氨基酸, 长度与其他物种的
LACS8基因相近。用在线软件ProtParam对LACS4
李捷宇等: 油桐LACS4和LACS8基因克隆及其表达分析 1985
图1 总RNA电泳和基因CDS扩增结果
Fig.1 Electrophoresis of total RNA and PCR amplification results of CDS of VfLACS4 and VfLACS8
M: 100 bp plus DNA ladder; A: 总RNA; B: VfLACS4 CDS扩增; C: VfLACS8 CDS扩增。
蛋白质的理化性质进行分析, 结果表明, LACS4蛋
白质分子量为73.79 kDa; 理论等电点为6.60; 分子
式为C3338H5222N860O968S28; 该蛋白在大肠杆菌中半
衰期大于10 h; 不稳定系数为34.38, 划分为稳定蛋
白; 脂肪系数为89.20。用在线软件对LACS8蛋白
质的理化性质进行分析, 结果表明, LACS4蛋白质
分子量为80.5 kDa; 理论等电点为7.46; 分子式为
C3605H5699N953O1064S34; 该蛋白在大肠杆菌中半衰期
大于10 h; 不稳定系数为30.96, 划分为稳定蛋白;
脂肪系数为87.65。
将克隆得到的油桐LACS4 cDNA序列和油桐
LACS8 cDNA序列推导出的氨基酸序列与其他物
种的该基因所编码的氨基酸通过软件DNAman和
GENDOC进行同源性分析(图2), 发现油桐LACS4
基因与其他植物的LACS4基因所编码的氨基酸同
源性大多在70%以上, 其中与蓖麻(Ricinus commu-
nis)的相似度最高达89%, 与胡杨(Populous euphra-
tica)的相似度为84%, 与大豆(Glycine max)、芝麻
(Sesamum indicum)、番茄(Solanum lywpersicum)的
相似度为81%, 与葡萄(Vitis vinifera)相似度为80%,
与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、油菜(Brassica
napus)的相似度为78%; 油桐LACS8基因与其他植
物的LACS8基因所编码的氨基酸同源性大多在
70%以上, 其中与麻疯树(Jatropha curcas)和蓖麻
(Ricinus communis)的相似度最高, 相似度分别达
86%和81%, 与胡杨(Populous euphratica)相似度为
79%。
2 VfLACS4和VfLACS8蛋白聚类分析
用Clustalx和MEGA4.0软件对22种植物的
LACS氨基酸序列进行聚类分析, 结果显示, 油桐
LACS4蛋白首先与蓖麻(Ricinus communis) LACS4
和ACS1聚在一起(图2), 对21种植物的LACS氨基
酸序列进行聚类分析显示, 油桐LACS8也先与麻
疯树(Jatropha curcas)和蓖麻的LACS8聚在一起(图
3), 油桐与蓖麻和麻疯树同属于大戟科, 相对于上
述其他物种遗传距离也应该是最近的。
进一步分析油桐LACS4和LACS8的结构特
征, 结果显示均含有AMP 绑定域标签(PROSITEPS
00455)的高度保守的氨基酸序列, 分别位于227~
238 aa和291~302 aa, 是LACS起催化反应的功能
域, 油菜LACS4具有以block形式存在的氨基酸序
列(崇保强等2009), 且3个block上分别有一个AMP
绑定基序存在, 该AMP结合结构域在酰基辅酶A形
成反应中起到了很关键的作用(谭小力2003)。
3 不同组织部位和种子不同时期VfLACS4和
VfLACS8的表达分析
3.1 不同组织部位的表达情况
实时荧光定量PCR结果显示, 油桐VfLACS4基
因在所检测的组织包括根、茎、叶、花和种子中
均有表达, 且不同组织部位的表达量存在差异(图
4)。在花和老茎中的表达量相对较高, 特别是在雄
蕊中表达量最高, 其次为老茎、花萼、花瓣; 在幼
根中也有一定量的表达; 在老叶、幼茎和子房中
的表达量相对较低。
植物生理学报1986
图2 油桐LACS4蛋白和其他植物LACS蛋白的聚类分析
Fig.2 Phylogenetic tree of the predicted LACS4 and other homologous proteins from different species
GmLACS4: 大豆Glycine max; GsLACS4: 野生大豆Glycine soja; CaLACS4: 鹰嘴豆Cicer arietinum; MdLACS4: 苹果Malus domestica;
PmLACS4: 梅花Prunus mume; SiLACS4: 芝麻Sesamum indicum; NsLACS4: 美花烟草Nicotiana sylvestris; NtLACS4: 茸毛烟草Nicotiana
tomentosiformis; SlLACS4: 番茄Solanum lywpersicum; StLACS4: 马铃薯Solanum tuberosum; NnLACS4: 莲Nelumbo nucifera; VvLACS4: 葡
萄Vitis vinifera; EgLACS4: 巨桉Eucalyptus grandis; PeLACS4: 胡杨Populous euphratica; PtACS: 毛果杨Populus trichocarpa; RcACS1: 蓖麻
Ricinus communis; RcLACS4: 蓖麻Ricinus communis; GhACS: 陆地棉Gossypium hirsutum; BnLACS4: 油菜Brassica napus; AtLACS4: 拟南芥
Arabidopsis thaliana; CsLACS4: 荠蓝Camelina sativa。
VfLACS4基因在茎中的表达量最低, 而在发育
的种子中(10月10日)表达量最高(图5), 明显高于其
他的组织。VfLACS4基因在不同组织的表达量大
小为: 发育的种子>雄蕊>老茎>花萼>花瓣>幼根>
嫩叶>雌蕊>花托>老叶>子房>幼茎。
油桐VfLACS8基因在根、茎、叶、花和种子
中均有表达, 但是在不同组织部位的表达量存在
差异(图4)。VfLACS8基因在花瓣中的表达量最低,
在雌蕊中的表达量最高, 且明显高于其他的组织
部位 , 其在雌蕊中的表达量是花瓣中62.5倍。
VfLACS8基因在雌蕊中表达量最大, 其次为老茎、
雄蕊以及幼茎, 而在其他部位表达量相对较低。
3.2 种子不同时期的表达情况
实时荧光定量PCR结果显示, VfLACS4基因在
种子的发育过程中的表达在时间上具有一定差异
性(图5), 7月份和8月份VfLACS4基因的表达量基本
李捷宇等: 油桐LACS4和LACS8基因克隆及其表达分析 1987
图3 油桐LACS8蛋白和其他植物LACS蛋白的聚类分析
Fig.3 Phylogenetic tree of the predicted LACS8 and other homologous proteins from different species
NsLACS8: 美花烟草Nicotiana sylvestris; NtLACS8: 茸毛烟草Nicotiana tomentosiformis; StLACS8: 马铃薯Solanum tuberosum; Si-
LACS8: 芝麻Sesamum indicum; CoLACS2: 油茶Camellia oleifera; VvLACS8: 葡萄Vitis vinifera; NnLACS8: 莲Nelumbo nucifera; CsLACS8:
荠蓝Camelina sativa; GrLACS8: 雷蒙德氏棉Gossypium raimondii; PeLACS8: 胡杨Populous euphratica; PtLACS: 毛果杨Populus trichocarpa;
RcLACS: 蓖麻Ricinus communis; JcLACS8: 麻疯树Jatropha curcas; EgLACS8: 巨桉Eucalyptus grandis; CaLACS8: 鹰嘴豆Cicer arietinum;
GmLACS8: 大豆Glycine max; MnLACS8: 川桑Morus notabilis; PmLACS8: 梅花Prunus mume; MxdLACS8: 苹果Malus x domestica; Px-
bLACS8: 白梨Pyrus x bretschneideri。
稳定在同一水平, 无明显的变化, 9月份下旬和10月
份上旬的表达量有所升高, 在10月10日表达量骤
然增高并且达到最大, 出现了表达高峰, 其表达量
约为7月15日表达量最低时的21.3倍, 而后在10月
20日表达量降低到低于9月20日的水平。
VfLACS8基因在油桐种子不同发育时期的表
达量情况也存在较大的差异, 其在发育过程中具
有时间上的特异性(图5)。VfLACS8基因在7月1日
到8月1日表达量较低, 进入8月份后直到9月份表
达量逐渐升高, 后在9月中旬略微有所下降, 从9月
20日到10月20日表达量逐渐升高, 且在10月20日
的表达量达到最大, 此时的表达量为8月1日表达
量的18倍。
4 种子成熟过程中油脂含量分析
采用索式提取法对油桐种子十个时期的油脂
进行提取(图6), 7月份桐油初步形成, 并逐渐开始
积累, 其中7月15日和8月1日的种仁含油率分别为
13.8%和17.1%; 之后油脂在8月份和9月份迅速积
累, 8月15日的含油率为26.9%, 9月份油脂继续积
累, 但与较之前相比积累速度减缓, 9月10日含油率
植物生理学报1988
达到29.3%; 油脂积累在10月份逐渐趋于平缓, 10
月10日和10月20日的含油率分别为34 .3%和
36.1%。由此可以表明桐油的生物合成呈“S”型曲
线, 并在8月份到10月份为桐油油脂合成高峰期。
讨　　论
本试验分别克隆得到油桐LACS4基因和油桐
LACS8基因, LACS4基因CDS长度为1 989 bp, 保守
序列为IMYTSGTTGDPK, LACS8基因CDS长度为
2 199 bp, 保守序列为IMYTSGSTGLPK, 属于AMP
绑定蛋白家族, 与其他物种的LACS基因编码蛋白
具有一致性(Black等1992; 崇保强2008; 顾守来
2012)。对油桐LACS4的氨基酸序列比对分析和聚
类分析表明其与蓖麻的亲缘关系最近 , 而油桐
LACS8的氨基酸序列比对分析和聚类分析表明与
麻疯树和蓖麻的亲缘关系最近。
植物进行生命活动离不开基因的调控作用,
控制植物生长发育的相关基因的表达影响着植物
的生长发育, 所以了解基因表达的时空性和差异
性显得尤为重要; 而通过分析这些基因的表达模
式与油脂积累的联系, 则更有助于了解基因的分
子机制与功能。本实验检测了油桐VfLACS4基因
和VfLACS8基因在油桐各个组织器官中的表达情
况, 并发现它们在所有被检测的组织中均有不同
程度的表达, 说明它们在油桐植株中分布广泛, 且
具有一定的组织特异性。
Shockey (2002)研究表明拟南芥AtLACS1主要
在成年植株中的花序、花、茎及角果中表达, 在
叶、根中无表达; 而拟南芥AtLACS4在根、叶、花
中表达, 在茎中无表达。崇保强(2008)研究表明油
菜BnLACS1在成熟植株的花和茎中的表达量相对
较高, 而在根和叶中的表达量很低; BnLACS4在根
和花中表达水平较高, 而在茎和叶中较低; 这说明
LACS基因在不同物种中的表达既有相似性又有差
异性。本实验通过研究VfLACS4基因在植物不同
组织中的表达情况表明, VfLACS4基因在油桐的
根、茎、叶、花和种子中均有表达, 并且主要成
熟植株的花和茎中表达, 这与崇保强(2008)研究得
出的油菜BnLACS1的表达谱一致, 与油菜BnLACS4
相似, 与拟南芥AtLACS的表达谱存在一定差异。
而VfLACS4基因在种子中的表达量明显高于其他
图4 VfLACS4和VfLACS8在油桐不同组织部位的表达情况
Fig.4 Expression of VfLACS4 and VfLACS8 in different tissue
sites of Vernicia fordii
图5 VfLACS4和VfLACS8在油桐种子发育时期的表达情况
Fig.5 Expression of VfLACS4 and VfLACS8 in different stages
of seed of Vernicia fordii
图6 不同发育时期油桐种子的含油率
Fig.6 Oil content of developmental seed in Vernicia fordii
李捷宇等: 油桐LACS4和LACS8基因克隆及其表达分析 1989
的组织部位, 表明该基因在种子中代谢反应起到
了一定的作用。而VfLACS8基因在植物不同组织
部位的表达情况与V f L A C S 4有一定的差异 ,
VfLACS8基因在雌蕊中的表达量显著高于其他组
织部位, 其次在老茎中的表达量较高, VfLACS8表
达谱与BnLACS1的表达谱一致, 与油菜BnLACS4的
表达谱有一定的相同之处, 与拟南芥AtLACS差异
较大。表达量越高说明其具有较高的转录水平,
高水平的转录出现在茎和花中, 说明该基因与这
些组织的生长发育有密切的联系, VfLACS8基因在
雌蕊中的高表达量表明其与花的发育特别是雌蕊
的发育紧密相关, 花是油脂大量合成的组织, 在花
中的大量表达说明油桐VfLACS4可能参与油脂的
合成代谢。
实验通过对7月1日至10月20日各个时期油桐
种子中VfLACS4基因和VfLACS8基因的表达情况进
行研究表明, VfLACS4基因和VfLACS8基因在种子
不同发育阶段的表达具有时间特异性。LACS4在
发育的油桐种子中的表达整体呈现出先趋于平稳
后上升的趋势, 种子的油脂合成开始于7月份, 基
因在 7月 1日的表达量稍高可能是由于油桐
VfLACS4不只是参与油脂的合成代谢, 可能还和其
他的代谢活动相关。VfLACS4在7月15日表达量最
低, 在9月20日和10月1日的表达量较高, 在10月10
日表达量达到最大且显著高于其他的时期, 总的
来说LACS4基因在发育的种子中的表达明显高于
其他组织部位, 推测该基因在种子10月份时期的
某一代谢活动中起到了至关重要的作用。LACS8
在发育的油桐种子中的表达同样是在7月1日稍高,
后稍有下降并逐渐保持相对稳定上升的状态, 从9
月20日到10月20日表达量逐渐升高直至达到最
大。油桐种籽在成熟过程中, 油分形成和累积的
特点是种籽内含油率在不断增加, 油桐种籽油分
形成、累积、转化最旺盛时期是8~9月上旬(陈炳
章1983), 本文研究同样表明桐油的生物合成呈“S”
型曲线。对油桐种子不同发育时期的含油量测定
结果与VfLACS8基因在种子不同发育时期的表达
量结果对比分析表明, 除7月1日和7月15日基因表
达量较高, 而桐油含量较低以外, 从8月1日到10月
20日基因的表达量与桐油的合成趋势相一致, 随
着时间的推移, VfLACS8基因的表达量升高, 桐油
的积累也逐渐迅速, VfLACS8基因在种子不同发育
阶段表达的时间特异性表明该基因可能在油桐脂
肪酸的合成中发挥着重要的作用。而对蓖麻研究
表明, RcLACS2参与蓖麻油脂合成过程, 该基因与
蓖麻种子中储存油脂的种类和含量相关 (He等
2007), 油桐与蓖麻的亲缘关系最近 , 由此推测
VfLACS4和VfLACS8有可能对游离脂肪酸和油脂种
类积累产生一定的影响。
本研究从油桐种子中克隆得到VfLACS4基因
和VfLACS8基因并对其进行了生物信息学分析和
表达模式分析, 获得了两个基因的表达谱, 通过对
桐油积累与VfLACS8基因表达的相关性分析进而
预测了该基因的功能。但LACS基因家族成员在不
同组织中对脂肪酸的活化存在不同的调控机制(李
庆岗等2012), 油桐LACS基因家族成员的数量以及
各成员的作用和调控方式尚不清楚, 各成员的主
要功能仍有待验证, 下一步需继续克隆LACS基因
家族的其他成员, 弄清基因的结构特征、表达模
式和生理生化特性, 为筛选和培育高含油量油桐
品种以适应生产发展需求提供材料和依据。
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