全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (11): 1245~1249 1245
收稿 2013-07-21　　修定 2013-09-23
资助 国家林业公益性行业科研专项(200904023)。
* 通讯作者(E-mail: tanxiaofengcn@126.com; Tel: 0731-
85623416)。
油桐叶片愈伤组织诱导及植株再生
谭晓风*, 李泽, 张琳, 龙洪旭, 袁军, 曾艳玲, 林青
经济林培育与保护教育部重点实验室(中南林业科技大学), 长沙410004
摘要: 以油桐无菌苗叶片为试材, 研究不同种类及浓度的植物生长调节剂对愈伤组织诱导、分化、增殖及生根的影响。结
果表明: 叶片愈伤组织的最佳诱导培养基为1/2MS+2.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D, 诱导率达100%; 最佳分化培养基为
1/2MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA+0.05 mg·L-1 IAA, 分化率为86.36%; 最佳继代增殖培养基为MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.05
mg·L-1 IBA; 最佳生根培养基为1/2MS+0.1 mg·L-1 IBA, 生根率93.83%。炼苗后移栽到泥炭土:珍珠岩:蛭石=2:1:1的基质中,
成活率达92%以上。
关键词: 油桐; 愈伤组织; 不定芽; 植株再生
Callus Induction from Leaves and Plant Regeneration of Tung Tree (Vernicia
fordii Hemsley)
TAN Xiao-Feng*, LI Ze, ZHANG Lin, LONG Hong-Xu, YUAN Jun, ZENG Yan-Ling, LIN Qing
Key Laboratory of Cultivation and Protection for Non-Wood Forest Trees, Ministry of Education, Central South University of
Forestry and Technology, Changsha 410004, China
Abstract: The effects of different concentrations and combinations of plant growth regulators on callus
induction, shoot differentiation, proliferation and root formation were studied using germ-free leaves of tung
tree (Vernicia fordii) as plant materials. The results showed that the fittest medium for callus induction from
leaves were 1/2MS+2.0 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D, with a 100% callus induction rate; the fittest medium
for shoot differentiation were 1/2MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.1 mg·L-1 IBA+0.05 mg·L-1 IAA, with a 86.36%
differentiation rate; the best medium for shoot multiplication was MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IBA; the best
rooting medium was 1/2MS+0.1 mg·L-1 IBA, with a 93.83% rooting rate. After the culture-bottle seedlings were
transplanted into the matrix composed of peat soil, perlite and vermiculite (2:1:1), the survival rate was up to 92%.
Key words: Vernicia fordii; callus; adventitious shoots; plant regeneration
油桐为大戟科(Euphorbiaceae)油桐属落叶乔
木, 是中国特有的经济树种, 与油茶、核桃和乌桕
并称我国四大木本油料树种(胡芳名等2006; 何方
2004)。油桐种子含油率达50%~70%, 其中约94%
为不饱和脂肪酸, 是一种可替代石化柴油的优质
干性油, 在原油日趋减少和环保压力加重的今天,
油桐成为优良的生物能源树种。此外, 桐油还是
一种优良涂料, 是合成新型复合材料的基本原料,
具有广泛的用途(谭晓风等2011)。近年来, 随着能
源缺乏的加剧及桐油综合利用的增加, 发展油桐
产业已迫在眉睫。作为最具潜力的工业原料树种,
油桐的种质资源保护、良种选育以及高产栽培技
术受到了关注。
目前, 油桐种苗繁育主要采用播种育苗及嫁接
育苗, 关于油桐组织培养的研究很少, 仅见于利用
油桐成熟胚获得无菌苗(李泽等2012; 张珊珊等
2009)和愈伤组织的诱导(卢彰显等2010), 而由愈伤
组织分化出不定芽及植株再生在国内外迄今尚未见
报道。本文研究油桐叶片诱导愈伤组织分化不定
芽, 继代增殖, 试管苗生根及炼苗移栽等过程, 不仅
为快速繁殖优良油桐植株提供了一条新的途径, 而
且为利用基因工程进行种质资源改良打下基础。
材料与方法
1 材料来源及处理
供试材料油桐(Vernicia fordii Hemsley)采自湖
南湘西永顺县青坪镇国家油桐种质资源保存库,
植物生理学报1246
地处云贵高原东部平原的过渡区域。位于110°29E,
28°32N, 海拔530~600 m, 属中亚热带季风气候, 四
季分明, 雨量充沛, 年平均降水量1 400 mm, 年日照
1 306 h, 年均气温16.0 ℃, 无霜期276 d。采集三年
生‘葡萄桐’成熟种子, 室内阴干后去除种皮, 在超
净工作台上用0.1%的HgCl2消毒3 min, 无菌水冲洗
4~5次, 然后将种胚接种在1/2MS基本培养基中培
养以获得油桐无菌苗备用(李泽等2012)。
2 愈伤组织诱导
愈伤组织诱导培养基为: 1/2MS+6-BA+2,4-D,
其中6-BA的浓度为1.0、2.0、3.0 mg·L-1, 2,4-D的
浓度为0.5、1.0、2.0 mg·L-1, 每个处理接种10个培
养瓶, 每个培养瓶接种3~4个叶片, 各试验处理重
复3次。以上培养基中添加30 g·L-1蔗糖和7 g·L-1琼
脂, pH为5.4, 121 ℃高温灭菌20 min。黑暗培养
2~3 d后再转到正常光照条件下培养。培养温度
(26±1) ℃, 光照强度15 μmol·m-2·s-1, 光照时长14
h·d-1。各处理均在20 d后观察愈伤组织生长情况,
统计其诱导率并拍照(下同)。
3 愈伤组织的继代和分化
愈伤组织的继代和分化用1/2MS培养基, 以正
交设计L9(3
4), 加入植物生长调节剂(表1)。每个处
理接种10瓶, 每瓶接种3~4块愈伤组织, 重复3次。
接种20瓶, 每瓶接种1株, 重复3次。其他培养条件
同上, 20 d后统计生根情况。
将生根20 d左右的试管苗打开瓶盖炼苗2~3 d,
用自来水洗净根部的培养基, 用0.1%的多菌灵消
毒5~10 min, 然后移栽到泥炭土、珍珠岩、蛭石按
不同比例(3:1:1、2:1:1、1:1:1)混合的基质中, 喷水
以保持小环境相对湿度在80%以上, 20 d后统计移
栽成活率。
6 数据分析
愈伤组织诱导率=(形成愈伤组织数/接种叶片
数)×100%; 愈伤组织分化率=(分化出再生芽的愈
伤组织块数/愈伤组织总块数)×100%; 生根率=(生
根的苗数/接种苗数)×100%。数据采用SPSS软件
进行方差分析和多重比较分析(Duncan’s法)。
实验结果
1 6-BA和2,4-D组合对油桐叶片愈伤组织诱导的
影响
叶片在光照条件下培养1周后, 愈伤组织逐渐
分化并生长。表2显示, 2,4-D浓度对油桐愈伤组织
诱导的影响较大。当6-BA浓度为1.0 mg·L-1、2,4-D
浓度为0.5 mg·L-1时, 油桐愈伤组织诱导率较低; 当
6-BA浓度为2.0 mg·L-1、2,4-D浓度为1.0 mg·L-1时,
愈伤组织诱导率可达100%, 而且愈伤组织生长较
快, 色泽较好, 愈伤组织疏松; 随着2,4-D浓度的增
大, 愈伤组织的诱导率仍较高, 但是愈伤组织颜色
和质地较差, 后期对不定芽的分化较难。因此, 诱
导愈伤组织较适宜的培养基为: 1/2MS+2.0 mg·L-1
6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D, 诱导率可达100% (图1-A)。
2 不同植物生长调节剂对油桐愈伤组织分化的影响
将油桐愈伤组织接种在附加不同浓度6-BA、
IAA和IBA的1/2MS培养基中分化不定芽, 30 d后统
计不定芽分化率。由表3可知, 9个不同植物生长调
节剂配比的分化培养基都可分化出不定芽(图1-B和
C), 随着6-BA浓度的增加, 愈伤组织的分化率呈先
升高后降低的趋势; 随着IBA、IAA浓度的增加,
愈伤组织的分化率呈整体下降的趋势; 当6-BA浓
度为2.0 mg·L-1、IAA和IBA的浓度为0.05和0.1
mg·L-1时, 不定芽的分化率可达86.36%, 而且不定芽
长势较好, 颜色较绿, 有利于后期的继代增殖培养。
3 6-BA和IBA组合对不定芽继代增殖的影响
由表4可知, 不同浓度的植物生长调节剂对油
表1 正交设计因素水平
Table 1 Factors and levels by using orthogonal design
水平
因素
6-BA浓度/mg·L-1 IBA浓度/mg·L-1 IAA浓度/mg·L-1
1 1.0 0.05 0.05
2 2.0 0.1 0.1
3 3.0 0.2 0.2
4 不定芽的继代增殖
将以上诱导的不定芽转入继代增殖培养基
(MS+6-BA+IBA)中, 其中6-BA的浓度为2.0、3.0、
4.0 mg·L-1, IBA的浓度为0.01、0.05、0.1 mg·L-1, 培
养30 d左右统计增殖系数。每个处理接种10瓶, 每
瓶接种1~2个不定芽, 重复3次。
5 试管苗生根及移栽
试管苗的生根培养采用1/2MS为基本培养基,
添加不同浓度的IBA或NAA, 设置浓度为0.05、
0.1、0.5、1.0 mg·L-1, 附加蔗糖20 g·L-1。每个处理
谭晓风等: 油桐叶片愈伤组织诱导及植株再生 1247
桐不定芽的增殖有较大影响, 增殖系数随其浓度
的增大先升后降。适合油桐不定芽增殖的培养基
为: MS+3.0 mg·L-1 6-BA+0.05 mg·L-1 IBA, 增殖系
数可达6.5, 而低浓度的细胞分裂和高浓度的生长
素不利于不定芽的增殖。
4 IBA及NAA对油桐生根的影响
将增殖培养基中2 cm以上的不定芽分成单株
后接种到添加不同浓度生长素的1/2MS培养基中,
7 d后可见白色的根尖长出, 20 d后统计生根率及根
系生长情况。由表5可知, 8种生根配方均可使油桐
生根, 但生根率及根系生长情况相差很大, IBA对
油桐的生根效果明显好于NAA。随着IBA浓度的
表2 6-BA和2,4-D对油桐愈伤组织诱导的影响
Table 2 Effects of 6-BA and 2,4-D on callus induction of tung tree
编号 6-BA浓度/mg·L-1 2,4-D浓度/mg·L-1 诱导率/% 生长情况
1 1.0 0.5 35.34±2.17d 愈伤组织较少, 颜色较黄
2 2.0 0.5 37.90±1.78cd 愈伤组织较少, 颜色米黄色
3 3.0 0.5 38.49±0.96c 愈伤组织较密
4 1.0 1.0 95.91±1.31b 愈伤组织较多, 较脆
5 2.0 1.0 100.00±0a 愈伤组织较绿, 疏松, 有红色斑点
6 3.0 1.0 96.31±1.98b 愈伤组织较密, 有少量红色斑点
7 1.0 2.0 97.30±1.82b 愈伤组织较多, 颜色紫红
8 2.0 2.0 100.00±0a 愈伤组织较多, 后期发黄
9 3.0 2.0 100.00±0a 愈伤组织较多, 较密, 深绿色
　　表中数据为平均值, 同一列中不同字母表示数据差异显著(P<0.05); 表2~5同。
表3 不同植物生长调节剂对愈伤组织分化率的影响
Table 3 Effects of different plant growth regulators on
differentiation rate of callus
编号 6-BA浓度/mg·L-1 IAA浓度/mg·L-1 IBA浓度/mg·L-1 分化率/%
1 1.0 0.05 0.05 58.63±1.56b
2 1.0 0.1 0.1 33.56±2.25e
3 1.0 0.2 0.2 22.04±1.50f
4 2.0 0.05 0.1 86.36±1.86a
5 2.0 0.1 0.2 54.21±1.56c
6 2.0 0.2 0.05 50.73±2.46c
7 3.0 0.05 0.2 63.36±2.29b
8 3.0 0.1 0.05 76.02±2.28a
9 3.0 0.2 0.1 45.75±2.13d
图1 油桐叶片愈伤组织诱导与植株再生
Fig.1 Callus induction from leaves and plant regeneration of tung tree
A: 愈伤组织诱导; B和C: 不定芽分化; D: 不定芽继代; E: 不定芽增殖; F: 生根的试管苗; G: 试管苗驯化移栽; H: 移栽成活的试管苗。
植物生理学报1248
表6 不同基质对移栽苗成活的影响
Table 6 Effects of different substrates on the survival of
transplanted seedlings
编号 基质成分 成活率/%
1 泥炭土:珍珠岩:蛭石=1:1:1 81.41
2 泥炭土:珍珠岩:蛭石=2:1:1 92.56
3 泥炭土:珍珠岩:蛭石=3:1:1 76.80
表5 IBA和NAA对油桐诱导生根的影响
Table 5 Effects of IBA and NAA on rooting of tung tree
编号 IBA浓度/mg·L-1 NAA浓度/mg·L-1 接种数/个 生根数/个 生根率/% 根系生长情况
1 0.05 0 15 14 93.26±1.95a 生根4~7条, 根系较好, 无愈伤组织产生
2 0.1 0 16 15 93.83±1.87a 生根5~8条, 根系较粗, 较长
3 0.5 0 15 11 73.33±3.25b 生根3~6条, 基部长愈伤组织
4 1.0 0 14 4 27.70±2.76e 生根2~4条, 基部长出大量的愈伤组织
5 0 0.05 16 11 67.50±2.62c 生根2~5条, 较细, 基部无愈伤组织
6 0 0.1 16 12 72.07±4.09bc 生根1~5条, 基部无愈伤组织
7 0 0.5 15 6 40.56±2.43d 生根2~3条, 基部有愈伤组织产生
8 0 1.0 14 3 21.70±3.00f 很少部分生根, 根系较短, 愈伤组织较多
表4 6-BA和IBA对不定芽增殖的影响
Table 4 Effects of 6-BA and IBA on proliferation of
adventitious shoots
编号 6-BA浓度/mg·L-1 IBA浓度/mg·L-1 增殖系数
1 2.0 0.01 1.5±0.3e
2 3.0 0.01 3.7±0.3c
3 4.0 0.01 2.7±0.2d
4 2.0 0.05 3.2±0.2c
5 3.0 0.05 6.5±0.2a
6 4.0 0.05 3.1±0.1c
7 2.0 0.1 1.3±0.1e
8 3.0 0.1 5.3±0.4b
9 4.0 0.1 2.4±0.2d
升高, 生根率降低, 这主要是由于不定芽苗基部长
出大量的愈伤组织从而抑制了根系的生长所致。
IBA的浓度为0.05~0.1 mg·L-1时, 油桐生根率可达
93%以上, 而且根系比较发达(图1-F)。
5 炼苗与移栽
由表6可知, 油桐试管苗在泥炭土:珍珠岩:蛭
石=2:1:1的基质中移栽成活率最高, 达到92%以上
(图1-H), 在其他2种基质中的成活率在76%~81%。
讨　　论
在愈伤组织诱导过程中, 不同浓度的植物生
长调节剂组合对愈伤组织的诱导效果不同, 尤其
是在色泽、结构和质地等方面有很大差异, 而这
些特性在愈伤组织分化不定芽的过程中起着决定
性的作用。本研究结果表明, 质地较密、色泽深
绿的愈伤组织很难分化出不定芽, 而愈伤组织的
质量主要是由细胞分裂素与生长素的配比决定
的。本文研究了6-BA与2,4-D不同浓度配比对油
桐叶片愈伤组织生长和分化的影响, 发现2,4-D对
愈伤组织的诱导起关键性的作用, 当2,4-D浓度过
高, 愈伤组织质地较密, 颜色深绿, 在分化培养过
程中不易诱导出不定芽, 可能是高浓度的2,4-D使
愈伤组织老化, 从而降低分化能力所致, 这与袁云
香(2012)在木本植物中的研究结果一致。
愈伤组织分化不定芽是木本植物组织培养中
较难的一个环节, 愈伤组织分化率的高低不仅与
愈伤组织的质量有关, 而且与植物生长调节剂的
成分和配比有关。本研究在筛选出质量较好的愈
伤组织的基础上, 通过6-BA、IBA、IAA正交设计
对不定芽进行诱导试验, 结果表明高浓度的6-BA
和低浓度的生长素有利于不定芽分化, 而高浓度
的生长素不利于不定芽分化。这可能是由于在愈
伤组织诱导过程中愈伤组织中含有大量的生长素,
在分化培养中减少生长素浓度而增大细胞分裂素
浓度更有利于不定芽的分化。
本试验发现苗高、叶片数量、大小及茎的粗
度对油桐生根有很大的影响, 生根率与这些因素
呈正相关关系, 长势较弱的不定芽不利于生根。
这主要是因为地上部分与地下部分生长是相互依
赖的, 它们之间不断地进行着物质、能量和信息
的交流, 根系生长所必需的糖类、维生素等由地
谭晓风等: 油桐叶片愈伤组织诱导及植株再生 1249
上部分供给(萧浪涛和王三根2004), 因此, 在生根
前培养健壮的不定芽是生根的前提。
总之, 本实验通过对叶片进行愈伤组织诱导,
为以后通过基因工程的方法改良油桐抗性、提高
油桐产量及油脂质量等性状, 以及为油桐遗传体
系的建立打下基础。这为油桐从传统的育种方式
向分子育种方向迈进提供了技术支撑, 对将来缓
解生物能源短缺有重要意义。
参考文献
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