全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 8 期, 2010 年 8 月 803
收稿 2010-04-06 修定 　2010-06-29
资助 国家自然科学基金(30960065 和 30800122)和西北师范
大学知识与科技创新项目(nwnu-kjcxgc-03-76 和 nwnu-
kjcxgc-03 -49 )。
* 通讯作者(E-mail: lizhean@lzu.edu.cn; Tel: 0931-7971722)。
高山离子芥CbMAPK3基因功能分析
张腾国 1, 夏小慧 2, 刘玉冰 3, 杨宁 1, 贾凌云 1, 王娟 1, 安黎哲 4,*
1 西北师范大学生命科学学院, 兰州 730070; 2 兰州城市学院, 兰州 730070; 3 中国科学院寒区旱区环境与工程研究所, 兰州
730000; 4 兰州大学生命科学学院, 兰州 730000
提要: 将高山离子芥丝裂原活化蛋白(MAP)激酶基因CbMAPK3编码区连接到表达载体pET-30a中, 转化大肠杆菌JJ001 (srl::
Tn10), 在 1 mol·L-1山梨醇的渗透胁迫及 IPTG的诱导下, 转化 pET-30a-CbMAPK3的大肠杆菌 JJ001 (srl::Tn10)生长情况比
转化 pET-30a的好。免疫分析表明, 在0 ℃下处理时, 高山离子芥CbMAPK3激酶蛋白质水平没有明显的变化; 在4 ℃处理
下, 高山离子芥CbMAPK3激酶蛋白质水平在处理前 3 h明显增加, 并在 3 h后达到最高值。高山离子芥CbMAPK3在响应
环境胁迫的过程中起作用。
关键词: 高山离子芥; CbMAPK3基因; 功能分析
Functional Analysis of CbMAPK3 Gene in Chorispora bungeana Fisch. et Mey.
ZHANG Teng-Guo1, XIA Xiao-Hui2, LIU Yu-Bing3, YANG Ning1, JIA Ling-Yun1, WANG Juan1, AN Li-Zhe4,*
1School of Life Sciences, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China; 2Lanzhou City University, Lanzhou 730070,
China; 3Cold and Arid Regions Environmental and Engineering Institute, Chinese Academy of Sciences, Lanzhou 730000, China;
4College of Life Sciences, Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
Abstract: Chorispora bungeana is a rare alpine subnival plant species that is highly tolerable to freezing
environment. To investigate whether mitogen-activated protein (MAP) kinase CbMAPK3 of C. bungeana has
the osmo-protection function, the coding region was subcloned into prokaryotic expression vector pET-30a. In
the presence of 1 mol·L-1 sorbitol and induction with IPTG, Escherichia coli strain JJ001 (srl::Tn10) trans-
formed with pET-30a-CbMAPK3 exhibited better growth than the same strain transformed with the empty
vector. Western blot analysis showed that the protein level of CbMAPK3 was not significantly altered by 0 ℃
freezing treatment, but increased significantly at 4 ℃ cold treatment and the maximum level was observed at 3
h after the treatment. These results indicated that the CbMAPK3 might play an role in response to environmental
stresses.
Key words: Chorispora bungeana; CbMAPK3 gene; functional analysis
高等植物在生长和发育过程中不断遭受生物
胁迫和非生物胁迫。大量研究表明, 蛋白激酶在感
受外界信号以调节细胞功能方面起着重要作用。
通过蛋白质的磷酸化和去磷酸化进行信号转导是生
物体中普遍存在的调节机制。蛋白激酶是一类在
胞内信使依赖的在蛋白质磷酸化过程中起中介和放
大作用并帮助完成信号传递过程的酶。蛋白激酶
负责将磷酸基团转移到特定底物蛋白上, 这类酶用
ATP或GTP作为磷酸基团供体, 而蛋白质中的丝氨
酸、苏氨酸和酪氨酸作为磷酸基团的受体。丝裂
原活化蛋白(mitogen-activated protein, MAP)激酶级
联途径是外界刺激信号从细胞表面传到细胞核内部
的重要信号通路。MAP 激酶级联途径包括 3 种蛋
白激酶成分: 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated
protein kinase, MAPK)、丝裂原活化蛋白激酶激酶
(mitogen-activated protein kinase kinase, MAPKK)、
丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated
protein kinase kinase kinase, MAPKKK) (Jonak 等
1999, 2002)。很多植物MAP激酶级联成分在各种
生物胁迫和非生物胁迫下激活(Cowan 和 Storey
2003; Zhang等 2006; Andreasson和Ellis 2009)。苜
蓿在低温和干旱的胁迫下, MMK4激酶被迅速激活
(Jonak等 1996)。Matsuoka 等(2002)用一种特殊的
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抗体研究发现拟南芥 MKK1 可以被触伤、低温、
干旱、高盐胁迫激活, 激活后的 MKK1 可以磷酸
化下游底物 MPK4, 从而使 MPK4 活化。MPK4和
MPK6 激酶可以被低温、渗透胁迫、触伤等激活
(Ichimura 等 2000)。MKK9 在乙烯合成及相应盐
胁迫过程中发挥重要的作用(Xu等2008)。MEKK1-
MKK1/MKK2-MPK4级联途径在抵御病原体过程中
发挥重要作用(Qiu 等 2008)。番茄在热胁迫条件
下, 有一个 50 kDa的MAPK被激活(Link等 2002)。
烟草WIPK和SIPK激酶在植株受到损伤后几分钟
之内被激活(Seo 等 1999)。
目前, 用于 MAP 激酶基因克隆和功能研究的
植物大都是生长在正常生长环境条件下的植物。
高山离子芥是十字花科多年生植物, 分布在海拔
3 600~3 900 m亚高山草甸和草原砾石质山坡上, 经
常受到干旱和极低环境温度的胁迫, 具有较高的适
应寒冷环境的能力, 因此高山离子芥是研究MAP激
酶级联途径的理想材料。我们克隆得到了高山离子
芥中与抗逆境胁迫有关的MAP激酶基因CbMAPK3,
功能分析表明CbMAPK3基因的表达受到盐胁迫诱
导(张腾国等 2009), 说明 CbMAPK3 与植物抵御逆
境胁迫信号转导有关。为了进一步深入研究该基
因的功能, 我们进行了 CbMAPK3 基因全长编码区
的扩增, 并将该编码区与原核表达载体 pET30a 连
接, 转化功能缺陷型大肠杆菌 JJ001 (srl::Tn10), 在
1 mol·L-1 山梨醇的渗透胁迫及 IPTG 的诱导下, 对
转化CbMAPK3和没有转化的大肠杆菌JJ001 (srl::
Tn10)的生长情况进行了测定, 并研究了低温(0 和
4 ℃)胁迫下CbMAPK3激酶蛋白水平的变化, 以期
为进一步探讨 CbMAPK3 酶活性变化建立基础。
材料与方法
1 植物材料
取高山离子芥(Chorispora bungeana Fisch. et
Mey.)叶片进行脱分化组织培养。培养温度为22 ℃,
光照强度为 40~50 μmol·m-2·s-1, 光照时间为 16 h·d-1。
培养基成分为: MS+4 mg·L-1 GA3+2.0 mg·L-1 NAA+
2.0 mg·L-1 2,4-D。选取生长良好的继代培养 10~
14 d 的愈伤组织置于含有 0.2 mg·L-1 2,4-D+0.2
mg·L-1 6-BA+0.2 mg·L-1 KT 和 3% 蔗糖的液体 MS
培养基中进行悬浮培养, 摇床转速为 110 r·min-1。
2 方法
2.1 总RNA提取 选取生长良好的高山离子芥愈伤
组织, 按照Trizol的试剂手册提取总RNA及反转录,
提取的RNA于-70 ℃保存或者直接转录得到相应
的 cDNA 后放置于-20 ℃冰箱中备用。
2.2 CbMAPK3基因转化功能缺陷型大肠杆菌JJ001
及在山梨醇胁迫下生长量的测定 用上游引物 I (5
TCCGAATTCGAGAGAGAGATGAACACCG 3, 下
划线序列为 EcoRI 酶切位点)和下游引物 II (5
GGCGTCGACCTAACCATACGTTGGATTGAGT 3,
下划线序列为SalI酶切位点)扩增含有CbMAPK3全
长编码区(CDS)序列的片段。扩增产物及表达载
体 pET30a 分别用 EcoRI 和 SalI 双酶切, 将酶切后
的扩增产物和pET30a载体用T4连接酶连接, 转化
大肠杆菌 DH5α。通过蓝白斑筛选, 鉴定阳性克
隆。提取阳性质粒, 转化功能缺陷型大肠杆菌JJ001
(pyrE41、entA403、argHI、rspsL109、supE44、
ΔuncBEFH、recA56、srl::Tn10)。该菌种由美国
Robert H. Fillingame教授(Department of Biomolecular
Chemistry, University of Wisconsin Medical School)惠
赠。通过酶切和 PCR 的方法鉴定阳性克隆, 送上
海博亚公司测序。同时转化空质粒pET30a于大肠
杆菌 JJ001 (srl::Tn10)中作为阴性对照。带有阳性
质粒 pET30a- CbMAPK3 的大肠杆菌 JJ001 (srl::
Tn10)分别接种于 LB 培养基和附加 1 mmol·mL-1
MgSO4·7H2O、0.2% 甘油、0.1% 维生素B、0.0348
mg·mL-1 L- 精氨酸、0.0022 mg·mL-1 尿嘧啶的 M9
培养基, 37 ℃摇床培养至 OD600 约为 0.5, 加入 0.2
mmol·L-1 的 IPTG 诱导表达, 2 h后向培养液中加入
4 mol·L-1 的山梨醇至终浓度 1 mol·L-1, 开始渗透胁
迫。在加入山梨醇以后每隔一定时间取样 2 mL,
测定 OD600 吸收值, 检测细菌生长量。同时以带有
空质粒pET30a的大肠杆菌JJ001 (srl::Tn10)作为
阴性对照。
2.3 高山离子芥总蛋白的提取及Western blot分析
将高山离子芥悬浮细胞分别置于4和0 ℃条件下处
理不同时间, 分别取大约 0.3 g经过处理的材料, 加
入 2 倍体积的提取缓冲液[pH 7.5 的 10 mmol·L-1
Hepes、5 mmol·L-1 EDTA、5 mmol·L-1 EGTA、
10 mmol·L-1 DTT、10 mmol·L-1 Na 3VO4、10
mmol·L-1 NaF、50 mmol·L-1 β- 甘油磷酸、1 mmol·L-1
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PMSF、5 μg·mL-1 抗蛋白酶、5 μg·mL-1 抑酶肽、
5 μg·mL-1 亮抑蛋白酶肽、10% 甘油、7.5% 聚乙
烯聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone)]。充分研
磨后, 转入 2 mL 离心管中, 4 000×g 离心 20 min,
上清液转入新的离心管, 用液氮快速冷冻, 放入
-80 ℃冰箱保存。总蛋白含量按 Bradford 染色法
测定。Western blot 分析时, 总蛋白通过 10% 的
SDS-PAGE 分离胶电泳分离, 转移至 NC 膜上进行
免疫学反应。所用一抗为抗 MAP3 的 α-C-MPK3
抗体, 由 Daniel F. Klessig 教授(Boyce Thompson
Institute for Plant Research, Ithaca, New York)惠赠,
二抗为羊抗兔 IgG。
实验结果
1 重组表达质粒酶切及 PCR鉴定
构建好的重组表达质粒pET30a-CbMAPK3转
化大肠杆菌 JJ001 (srl::Tn10), 从过夜培养的LB培
养基中挑选菌落, 提取质粒 DNA, 用 EcoRI 和 SalI
双酶切切出1 119 bp左右的片段(图1-A), 与预期的
片段相符。以酶切鉴定为阳性的质粒DNA作1:10
稀释后, 用上游引物 I 和下游引物 II扩增出 1 119 bp
左右的片段(图 1-B)。测序结果表明, 所测序列含
CbMAPK3 基因 1 110 bp 的正确阅读框架, 没有移
码突变, 证明目的基因 CbMAPK3 已定向插入表达
载体pET-30a中, 并成功转化到大肠杆菌JJ001 (srl::
Tn10 )。
2 转化CbMAPK3基因的大肠杆菌JJ001在山梨醇
胁迫下的生长量变化
带有重组表达质粒pET-30a-CbMAPK3的阳性
大肠杆菌 JJ001 (srl::Tn10), 接种于 M9 培养基, 生
长到OD600 约为 0.5时, 加入 IPTG诱导表达, 2 h后
加入山梨醇至终浓度为1 mol·L-1开始渗透胁迫, 每
隔一定时间取样测定细菌生长情况。结果显示, 转
化重组表达质粒pET-30a-CbMAPK3的阳性大肠杆
菌 JJ001 (srl::Tn10)和转化空质粒 pET-30a 的对照,
在加入山梨醇后 2 h 之内, 由于山梨醇溶液的稀释
作用, 测得的OD600值低于加入山梨醇之前的水平;
2 h后OD600开始上升, 10 h后转化重组表达质粒的
阳性大肠杆菌的生长量高于对照(图 2-A)。同样,
检测大肠杆菌 JJ001 (srl::Tn10)在含有 1 mol·L-1 山
梨醇的LB培养基上生长情况的结果表明, 在加入山
梨醇2 h后, 转化重组表达质粒pET-30a-CbMAPK3
的阳性大肠杆菌JJ001 (srl::Tn10)的生长量明显高于
转化空质粒 pET-30a 的对照(图 2-B)。由此可见,
CbMAPK3 在抗渗透胁迫过程中发挥作用。
3 低温胁迫下CbMAPK3蛋白水平的变化
高山离子芥悬浮细胞分别在 0 和 4 ℃处理后,
提取的总蛋白经SDS-PAGE电泳后转移至NC膜上
进行 Western-blot 的结果表明, 悬浮细胞在 0 ℃下
处理时, CbMAPK3 激酶蛋白质水平没有明显的变
化(图 3-A和 B); 在 4 ℃下, CbMAPK3 激酶蛋白质
水平在处理前 3 h 有所增加, 并在 3 h 达到最高值,
然后逐渐降低, 处理 24 h 后, 降低到基础水平(图
3-C 和 D)。说明 CbMAPK3 基因在响应环境胁迫
中发挥作用。
讨　　论
植物具有的感受外界环境变化的能力是植物
赖以生存的基本条件。为了适应外界生存条件, 植
物在进化过程中逐渐产生了各种机制来抵御各种胁
迫, 例如合成与胁迫有关的激素如 ABA, 以及发动
一些特殊基因的表达, 从而改变细胞主要组成成分
(Munnik和 Meijer 2001)。在各种生物胁迫和非生
物胁迫下, 有些植物MAP激酶的蛋白质水平会发生
变化。如水稻MAP激酶OsMAPK5蛋白质水平在
图 1 重组表达质粒 pET-30a-CbMAPK3 的酶切及PCR 分析
Fig.1 Analysis of recombinant plasmid pET-30a-CbMAPK3
by digesting with EcoRI/SalI and PCR
A: 酶切分析。M: 分子量标准; 1: 重组表达质粒的酶切鉴
定; 2 : 重组表达质粒。B: PCR 分析。M: 分子量标准; 1: 重组
表达质粒的 P C R 鉴定。
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干旱和高盐处理下明显增加, 在低温处理下也有微
弱的增加(Xiong 和 Yang 2003)。我们的研究表明,
CbMAPK3 基因的转录受低温胁迫的诱导(张腾国
等 2010); CbMAPK3 蛋白质水平在 4 ℃处理前 3 h
有所增加, 并在 3 h 达到最高值, 然后逐渐降低, 处
理 24 h 后, 降低到基础水平。另外, 我们还研究
了 CbMAPK3 激酶蛋白质水平在高盐胁迫下的变
化, 结果表明, CbMAPK 蛋白质水平在处理 3~12 h
内明显高于基础水平, 在处理24 h后又降低到基础
水平(张腾国等 2009)。可以认为, 蛋白水平的提高
相应地增加了可供激活的蛋白激酶的量。
大肠杆菌(srl::Tn10)突变体缺少山梨醇转运系
统, 不能代谢山梨醇, 因此不能在以山梨醇为唯一
碳源的最小培养基中生长(Csonka 和 Clark 1979)。
Garwe等(2003)为了研究胁迫响应基因XVSAP1的
渗透保护功能, 将 XVSAP1 与表达载体相连, 转化
大肠杆菌(srl::Tn10), 转化菌株可以在含有1 mol·L-1
山梨醇的 M9 培养基上稳定生长, 而野生型大肠杆
菌(srl::Tn10)却不能生长, 证明XVSAP1具有抗山梨
醇渗透胁迫的能力。Mundree等(2000)通过功能互
补的方法克隆得到抗山梨醇渗透胁迫基因ALDRXV4,
转化有 ALDRXV4 基因的大肠杆菌(srl::Tn10)在
IPTG 的诱导下, 在含有 1.25 mol·L-1 山梨醇的 M9
培养基上生长良好, 而未转化的大肠杆菌(srl::Tn10)
不能生长。高山离子芥在高盐以及低温胁迫下,
CbMAPK3 基因的转录水平和蛋白质水平增加; 转
化有CbMAPK3的大肠杆菌JJ001 (srl::Tn10)的生长
量高于没有转化CbMAPK3的对照。说明CbMAPK3
图 2 山梨醇(1 mol·L-1)胁迫下转化 pET-30a 或 pET-30a-CbMAPK3 的大肠杆菌 JJ001 (srl::Tn10)
在 M9 (A)和 LB (B)培养基中的生长检测
Fig.2 Growth analysis of E. coli strain JJ001 (srl::Tn10) cells transformed with pET-30a or pET-30a-CbMAPK3
in M9 (A) and LB (B) minimal media supplemented with 1 mol·L-1 sorbitol
图 3 Western blot 分析 0 和 4 ℃低温胁迫下 CbMAPK3 蛋白质水平
Fig.3 Western blot analysis of CbMAPK3 protein levels in cold stress (0 and 4 ℃)
A: 0 ℃下总蛋白杂交; B: 0 ℃下总蛋白 SDS-PAGE; C: 4 ℃下总蛋白杂交; D: 4 ℃下总蛋白 SDS-PAGE。
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在抗渗透胁迫中起作用。至于 CbMAPK3 是作为
信号分子在抗渗透胁迫中发挥作用, 还是本身具有
抗渗透能力, 还需要进一步研究。
参考文献
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