全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期, 2010 年 4 月 335
收稿 2009-11-16 修定 　2010-03-02
资助 国家自然科学基金(30960065 和 90302010)和西北师范
大学知识与科技创新项目(nwnu-kjcxgc-03-76 和 nwnu-
kjcxgc-03 -49 )。
* 通讯作者(E-mail: lizhean@lzu.edu.cn; Tel: 0931-7971722)。
高山离子芥MAP激酶基因CbMAPK3的克隆
张腾国 1, 张艳 1, 王娟 1, 杨宁 1, 安黎哲 2,*
1 西北师范大学生命科学学院, 兰州 730070; 2 兰州大学生命科学学院, 兰州 730000
提要: 从高山离子芥中克隆得到了一种新的MAPK基因的 cDNA CbMAPK3, 全长 1 419 bp, 其中包括 1 110 bp的开放阅读
框、91 bp的 5非翻译区(5UTR)和 218 bp的 3非翻译区(3UTR)。CbMAPK3基因编码 369个氨基酸的蛋白质, 分子量为
42.5 kDa, 等电点为 5.79, 含有MAP激酶所具有的 11个保守序列区以及MAP激酶的磷酸化位点 TEY基序。CbMAPK3
蛋白与响应环境胁迫有关的植物MAPK亚类有很高的同源性。半定量分析表明, 该基因表达受低温胁迫诱导。
关键词: 高山离子芥; MAPK基因; 分子克隆
Molecular Cloning of a Novel MAP Kinase Gene CbMAPK3 in Chorispora
bungeana
ZHANG Teng-Guo1, ZHANG Yan1, WANG Juan1, YANG Ning1, AN Li-Zhe2,*
1School of Life Sciences, Northwest Normal University, Lanzhou 730070, China; 2College of Life Sciences, Lanzhou University,
Lanzhou 730000, China
Abstract: A new MAPK cDNA CbMAPK3 was isolated from Chorispora bungeana. The cloned full-length
cDNA was 1 419 bp, contained a 1 110-bp ORF, a 5-untranslated region (UTR) of 91 bp, and a 3-untranslated
region (UTR) of 218 bp. CbMAPK3 encoded a protein of 369 amino acids with a deduced molecular weight of
about 42.5 kDa and with a PI of 5.79. The protein contained all 11 conserved subdomains and the phosphory-
lation TEY motif of MAPK. The CbMAPK3 protein exhibited closest homology to the subgroup of plant MAPKs
which were involved in environmental response. Analysis by semi-quantitative RT-PCR indicated that the ex-
pression of CbMAPK3 was increased in response to cold stress.
Key words: Chorispora bungeana; MAPK gene; molecular cloning
植物为了维持正常的生长和发育, 需要不断的
感知和适应外界环境的变化。在长期的进化过程
中, 植物拥有完整的信号网络用以调节各种环境胁
迫引起的响应。蛋白质磷酸化和去磷酸化是调控
细胞响应各种外源信号的重要机制, MAP激酶级联
途径在内外源信号传导过程中发挥着重要的作用。
MAP激酶级联途径包括3种蛋白激酶: MAPKK激
酶(MAPKKKs), MAPK激酶(MAPKKs), MAP激酶
(MAPKs), 构成三级激酶模式。通过该级联途径将
上游信号和下游的应答分子联系起来( J onak 等
2002)。MAPKKK位于级联系统的上游, 通过信号
分子的受体或其本身直接感受胞外刺激而磷酸化激
活。MAPKKKs 通过磷酸化 MAPK 激酶 S/T-X3-5-
S/T基序中的丝氨酸或丝氨酸/苏氨酸残基, 从而激
活MAPK激酶, 被激活的MAPKKs可以通过磷酸化
MAP激酶TXY (X代表任意氨基酸)基序中的酪氨
酸和苏氨酸残基, 从而激活MAP激酶, MAPK被激
活后进入细胞核, 通过激活特定转录因子引起功能
基因的表达, 或停留在细胞质中激活其他蛋白激酶,
最终引起植物细胞对内外刺激的生理生化反应
( Z ha n g 等 2 0 0 6 )。在植物、动物和微生物中,
MAPK 级联均是进化中相对保守的信号转导模式
(Tena 等 2001)。
MAPK 最早发现于受促分裂原(mitogen)刺激
的动物细胞中, 起初认为它只是动物促细胞分裂原
的传递体。后来发现 MAPK 还参与激素、环境胁
迫以及细胞分化等相关的多种细胞传递途径。酵
母基因组总共编码6种MAP激酶, 哺乳动物细胞中
已鉴定出 13 种不同的 MAPK 基因(Chang 2003)。
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自 1993 年植物 MAPK 激酶基因分离鉴定之后, 到
目前已经从拟南芥、水稻、苜蓿、烟草、玉米
多种植物中分离得到 MAPK 级联成分(Zhang 等
2006; MAPK group 2002; Yang等2001; Ichimura等
2000; Xiong 和 Yang 2003; Zhang 和 Liu 2001;
Kandoth等2007; Pedley和Martin 2004)。植物MAP
激酶与动物和酵母的MAP激酶非常相似, 它们的共
同特点是: 分子量在 38~55 kDa 之间, 都含有 11 个
保守的蛋白激酶亚区, 有一个非常保守的 TXY 基
序。许多实验表明, 植物MAP激酶及MAP激酶级
联途径在病原反应, 机械损伤, 水分胁迫, 低温, 激
素及细胞周期等多种信号的传递中起作用。植物
中存在多种MAP级联途径, 这些途径相互交织构成
信号传递网络, 有些信号如干旱、高盐和低温信号
可通过同一条MAP级联途径进行传递, 而有些激酶
如 SIPK、WIPK 等可作为多种信号的传递体(Kim
等 2003; Lee 等 2001; Yap 等 2005)。
目前, 用于 MAP 激酶基因克隆和功能研究的
植物, 大都是生长在正常生长环境条件下的植物。
本文中我们选择了生长在极端环境条件下的高山离
子芥作为研究对象。高山离子芥是十字花科多年
生植物, 分布在海拔 3 600~3 900 m亚高山草甸和
草原砾石质山坡上。其生长环境的特点是气候寒
冷, 空气稀薄, 辐射强, 劲风。高山离子芥经常受
到干旱和极低环境温度的胁迫(An等2000), 因此高
山离子芥是研究 MAP 激酶级联途径的理想材料。
研究高山离子芥MAP激酶在信号转导途径中的作
用具有一定的理论意义和应用前景。
材料与方法
夏季八月份从天山采集野生高山离子芥(Chori-
spora bungeana Fisch. et Mey.)植株后, 连同泥土一
起在纸箱中运回实验室, 途中喷水保持湿润。取回
来的高山离子芥叶片进行脱分化组织培养。培养
温度为 22 ℃, 光照强度为 40~50 μmol·m-2·s-1, 光照
时间为 16 h·d-1。培养基成分为: MS+4 mg·L- 1
GA3+2.0 mg·L-1 NAA+2.0 mg·L-1 2,4-D。选取生长
良好的愈伤组织, 用于高山离子芥总 RNA 提取。
提取高山离子芥总RNA及反转录, 按照Trizol
试剂的试剂手册方法进行总 RNA 提取, 提取的
RNA于-70 ℃保存或者直接转录得到相应的cDNA,
放置于-20 ℃冰箱中备用。
克隆MAPK基因cDNA片段, 从GenBank下载
已经克隆得到的植物MAP激酶 40余条, 进行序列
比对, 根据比对结果, 在最保守的区域设计简并引
物 I: 5-ATYGGYMRIGGHGCITAYGG-3; 引物 II:
5-ATRCARCCIACDGACCAIACRTC-3 (其中:
Y=T+C; M=A+C; R=A+G; H=A+C+T; D=A+G+T;
I=deoxyinosine)。以高山离子芥反转录 cDNA为模
板, 用引物 I 和 II 进行扩增。扩增产物用中科开瑞
公司的 CASpure Gel Extraction Kit 回收, 连入
Promega pGEM-T载体, 反应体系与反应条件为: 2×
缓冲液 5 μL, pGEM-T 载体 1 μL, T4 连接酶 1 μL,
模板 3 μL, 16 ℃ 1 h, 4 ℃过夜。连接后的质粒转
化大肠杆菌 DH5α感受态细胞, 过夜培养, 蓝白斑
筛选后挑取白斑提取质粒, 经PCR与酶切验证为阳
性克隆后, 送上海博亚公司测序。
根据上面克隆片段的测序结果和序列比对结
果, 设计第 2 对简并引物 III: 5-TYTTCGGTART
YTWTTYG-3; 引物 IV: 5-TAYKYWGGATTG
AGTGCWA-3 (其中: Y=T+C; R=A+G; W=A+T;
K=G+T), 进行第2次扩增, 反应体系及反应条件同
上。预期大小的片段切胶纯化回收, 连接 pGEM-
T载体, 转化大肠杆菌 DH5α, 37 ℃培养箱过夜培
养, 筛选阳性克隆, 测序。
按照大连宝生物工程公司试剂盒操作方法进
行 3RACE和5RACE扩增。3`RACE用TaKaRa公
司的 3-Full RACE Core Set, 根据前面扩增得到的
MAP激酶基因中间片段序列设计上游基因特异性
引物, 与下游引物 5-CTGATCTAGAGGTACC-
GGATCC-3进行RT-PCR扩增, 预期大小的片段切
胶纯化回收, 连接 pUCM-T 载体, 转化大肠杆菌
DH5α, 筛选阳性克隆, 测序。5RACE 用 TaKaRa
公司的5-Full RACE Core Set, 将高山离子芥总RNA
用基因特异性反转录引物CbRACE5 [5-(P)AGTG-
CTCCTCTGACA-3]进行反转录后, cDNA 用 T4
RNA连接酶环化以后进行一扩PCR (上游引物: 5-
AGCTCCTTCGCCATCTA-3; 下游引物: 5-AGGC-
GTTCGCTATCTTCT-3), 以一扩 PCR 产物作为模
板, 进行二扩PCR (上游引物: 5-TTGCGACTGAA-
CTAATGGACACTG-3, 下游引物: 5-CCGCGGCC-
GATTGGTATGAT-3), 扩增得到的与预期大小相符
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的片段切胶纯化回收, 连接 pUCM-T 载体, 转化大
肠杆菌 DH5α, 筛选阳性克隆, 测序。
半定量分析MAPK基因表达, 选取生长良好的
愈伤组织, 在 0 ℃冰箱做低温处理, 分别于处理 2、
4 和 6 h 后提取总 RNA, 反转录后作为半定量 PCR
的模板, 根据 MAPK 基因测序结果设计上游引物
VII: 5-TTGGTCGTGGAGCTTATGGAATC-3和引
物VIII: 5-CTAGCAAGACCGAAATCACAAATC-3
进行半定量 PCR 扩增。扩增程序如下: 94 ℃预变
性 4 min; 94 ℃变性 40 s, 53.5 ℃退火 40 s, 72 ℃延
伸 60 s, 共进行 25 个循环; 最后 72 ℃延伸 7 min。
取 5 μL PCR 产物用 1% 的琼脂糖凝胶 EB 染色后
电泳检测。同时在同一条件下以actin基因(GenBank
accession No. AY825362)的扩增(上游引物: 5-
GCTCCGTGTTGCCCCTGAAGA-3; 下游引物: 5-
CTCGGCGGTGGTGGTGAACA-3)来检测每个样品
中的 RNA 含量是否相同。
结果与讨论
1 MAPK基因片段的克隆
GenBank上登录的40多条植物MAP激酶基因
序列以软件转变为氨基酸序列进行序列比对, 在靠
近 5端和 3端各有一个保守区域: IGRGAYGIV和
DVWSVGCIF, 根据这 2个保守区域设计的简并引
物 I 和 II, 以从高山离子芥愈伤组织中提取得到的
总RNA反转录产物为模板, 扩增得到了一条530 bp
左右大小的单一条带(图1-a), 和预期的大小相符, 测
序结果与其他植物的MAP激酶进行序列比对发现,
与拟南芥 AtMPK3 的同源性达到 97.3%, 与苜蓿
MMK4 的同源性为 88.1%, 与豌豆 PsMAPK3 的同
源性为88.6%, 并包含有MAP激酶磷酸化位点TEY
基序。因此可以初步判断, 扩增产物为高山离子芥
MAP 激酶基因片段。
由于扩增得到的第1个基因片段太短, 紧接着
应用 RACE 方法进行全长基因的扩增有一定的困
难。因此, 设计第 2 对简并引物 III 和 IV进行 PCR
扩增, 得到了一条大约 1 000 bp 大小的单一条带
(图 1-b), 测序结果表明, 该片段为 1 030 bp, 与前
面扩增得到的 530 bp 的片段重复部分的核苷酸序
列完全相同。序列比对发现, 这 1 030 bp 的基因
片段与植物MAP激酶中与抗逆境胁迫有关的基因
同源性都在 85% 以上, 并且具有植物 MAP激酶基
因所具有的 11 个保守区域。因此, 该片段所在的
基因有可能是高山离子芥与抗逆境胁迫有关的
MAP 激酶基因。
2 3RACE分析
用TaKaRa公司的 3-Full RACE Core Set扩增
得到了 300 bp 左右大小的片段(图 2-a), 测序结果
经过核苷酸序列比对, 其与前面扩增得到的高山离
子芥基因部分片段的重叠部分的核苷酸序列完全相
同, 说明 3RACE 获得的片段与前面克隆得到的
图 1 RT-PCR 扩增高山离子芥 MAP 激酶基因片段
Fig.1 RT-PCR amplication of MAPK fragment in
C. bungeana
M: 分子量标准; MAPK: MAP 激酶基因片段。a: 引物 I 和
II 扩增产物; b: 引物 III 和 IV 扩增产物。
图 2 3RACE 和 5RACE PCR 结果电泳图
Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR product of
3RACE and 5RACE
M: 分子量标准; 1: RACE 结果。a: 3RACE PCR 结果; b:
5 RACE PCR 结果。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期, 2010 年 4 月338
1 030 bp 部分片段属于同一条基因。同时在终止
密码子 TAG 后面还有 218 bp 的 3 非翻译区序列
(3UTR), 以及 15 bp 的 poly A 序列。
3 5RACE检测
将高山离子芥总RNA用基因特异性反转录引
物反转录, cDNA 用 T4 RNA 连接酶环化后进行一
扩PCR, 以一扩PCR产物作为模板, 进行二扩PCR,
但没有得到预期的 PCR 产物。因此, 对实验作了
调整, 增加反转录反应体系中的总RNA的浓度, 并
增加了 T4 RNA 连接酶连接环化的反应时间。将
连接环化产物用 TE 缓冲液稀释 10×、100× 和
1 000× 作为模板, 用一扩引物进行扩增, 电泳结果
显示没有得到扩增条带。将一扩 PCR 产物作为模
板, 用二扩引物进行扩增, 电泳结果显示以 10× 稀
释连接环化产物为模板的1stPCR产物为二扩模板,
扩增得到了一条 330 bp 左右大小的条带(图 2-b)。
测序结果经序列比对, 与前面扩增得到的高山离子
芥1 030 bp基因部分片段的重叠部分核苷酸序列完
全相同, 说明5RACE获得的片段与前面克隆得到的
中间片段属于同一条基因。同时在起始密码子
TAG 前面还有 91 bp 的 5 非翻译区序列(5UTR)。
4 含完整编码区的MAPK基因cDNA克隆和测序
将扩增得到的1 030 bp的片段以及5RACE和
3RACE 获得的片段进行序列拼接, 得到了一条
1 419 bp的序列(图 3), 包含一个 1 110 bp的开放阅
读框(ORF), 编码 369 个氨基酸的蛋白质。起始密
码子ATG前面有一段91 bp的5非翻译区(5UTR),
终止密码子TAG后面有一段218 bp的3非翻译区
(3UTR), 包括 15 bp 的 poly A。为了进一步确证
以上高山离子芥MAPK基因拼接序列的正确与否,
根据3RACE和5RACE扩增序列设计引物V和VI
进行 PCR 扩增, 获得了 1 270 bp 的片段, 测序结果
与拼接序列的核苷酸组成完全相同。由于该基因
与拟南芥 AtMPK3 同源性最高, 达到 90% 以上, 因
图 3 高山离子芥 MAP 激酶基因 CbMAPK3 cDNA序列
Fig.3 The cDNA sequence of C. bungeana CbMAPK3 gene (GenBank accession No. AY805424)
此命名为 CbMAPK3。
5 CbMAPK3与部分植物MAP激酶基因预测氨基
酸序列比对
利用DNAstar软件, 将CbMAPK3与其他植物
中克隆得到的与响应环境胁迫有关的MAP激酶基
因编码区(CDS)序列输入 Megalign软件, 用 Clustal
方法进行预测氨基酸序列的序列同源性(图 4)。结
果发现: 高山离子芥 CbMAPK3 与拟南芥AtMPK3
同源性最高, 达到了 95.4%, 与烟草 NtWIPK 同源
性为 82.2%, 与辣椒 CaMPK1 同源性为 81.1%。
植物生理学通讯 第 46 卷 第 4 期, 2010 年 4 月 339
6 半定量 PCR结果
半定量RT-PCR实验结果(图5)表明, CbMAPK3
基因的表达受低温(0 ℃)胁迫的诱导。说明MAPK
信号转导机制在高山离子芥的抗寒中有作用。
总之, 本实验从高山离子芥愈伤组织中克隆得
到了含完整编码区序列的 MAPK 基因 CbMAPK3,
预测的氨基酸序列包含MAP激酶所具有的11个保
守区, 并且在 195~197 个氨基酸的位置有 MAP 激
酶所具有的 T E Y 基序( 图 4 ) 。序列分析表明
CbMAPK3 激酶和其他植物中与抗逆有关的 MAP
激酶同源性很高, CbMAPK3 基因的表达受低温胁
迫的诱导, 因此可以推测CbMAPK3也是在抗逆胁
迫中起作用, 为进一步研究CbMAPK3的功能提供
了方向。关于 CbMAPK3 激酶在高山离子芥抗逆
信号传递过程中的的功能还有待后续研究。
参考文献
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图 4 高山离子芥 CbMAPK3 与其他植物 MAP 激酶序列比对
Fig.4 Alignment of the C. bungeana CbMAPK3 with MAPKs from other plant species
图 5 低温(0℃)胁迫下 CbMAPK3 基因的表达
Fig.5 Expression profiles of CbMAPK3 under cold (0 ℃)
stress treatment
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