全 文 ：植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月 757
收稿 2009-03-02 修定 　2009-06-03
资助 廊坊师范学院重点研究项目(LSAZ20 0703)。
* 通讯作者(E-mail: konghong64@163.com; Tel: 0316-
2 1 8 8 3 8 4 )。
** 廊坊师范学院生命科学学院 0 6 级学生。
鹰嘴紫云英根尖细胞有丝分裂同步化诱导
孔红 *, 连利叶 **, 马建军
廊坊师范学院生命科学学院, 河北廊坊 065000
提要: 采用羟基脲和氟乐灵结合的双阻断方法处理鹰嘴紫云英根尖, 以诱导根尖细胞有丝分裂中期同步化。结果表明, 用
1.25 mmol·L-1羟基脲处理18 h和1 μmol·L-1氟乐灵处理6 h的细胞有丝分裂中期指数可达80%, 且有丝分裂正常, 染色体形
态良好, 未见到染色体畸变的现象。
关键词: 鹰嘴紫云英; 有丝分裂同步化; 羟基脲; 氟乐灵
Induction of Mitotic Synchronization from Root Tip Cells of Astragalus cicer L.
KONG Hong*, LIAN Li-Ye**, MA Jian-Jun
College of Life Sciences, Langfang Normal University, Langfang, Hebei 065000, China
Abstract: In order to induce cell mitotic synchronization, root tip cells of Astragalus cicer were induced with
combined hydroxyurea and trifluralin treatments. The results showed that the metaphase index was 80% with
1.25 mmol·L-1 hydroxyurea treatments for 18 h and 1 μmol·L-1 trifluralin treatments for 6 h, and mitosis was
normal, mutation of chromosomes was not observed.
Key words: Astragalus cicer; mitotic synchronization; hydroxyurea; trifluralin
植物细胞的同步化诱导, 是以药物或低温处理
方法打乱细胞的分裂周期, 致使多数细胞同时停留
在分裂周期的某一阶段(一般为中期), 从而简易迅
速地获得特定时期的DNA材料, 有目的地进行专门
研究的一项技术。由于同步化诱导可得到大量一
致的细胞群, 便于研究细胞的周期调控、染色体的
形态构成、染色体的显微切割、原位杂交等问题,
人们曾进行了许多研究, 尤其是在小麦、大麦、
大蒜、玉米、蚕豆等植物根尖细胞的有丝分裂中
期同步化诱导研究中已取得了一些进展(彭永康等
1998 ,1999; 陈成彬和宋文芹 1999; 王晓娜等
2006)。
鹰嘴紫云英为豆科黄芪属多年生草本植物, 原
产欧洲, 1973年我国从加拿大引进, 适宜于华北、
西北和西南等地种植, 是一种营养丰富、草质和适
口性都极好的饲料作物。迄今, 鹰嘴紫云英的研究
并不多, 王建华(1990)曾做过鹰嘴紫云英生长第一
年根系发育动态的研究, 王瑛华等(2006)对鹰嘴紫
云英抗甲硫氨酸变异系离体筛选和鉴定做过报道,
张改娜等(2006)对鹰嘴紫云英甲硫氨酸抗性系原生
质体培养及其植株再生做过研究, 但鹰嘴紫云英的
细胞学研究尚未见报道。本文采用羟基脲和氟乐
灵双阻断法诱导鹰嘴紫云英根尖细胞有丝分裂同步
化, 并对影响其有丝分裂同步化的因素作了初步探
讨。
材料与方法
鹰嘴紫云英(Astragalus cicer L.)种子由兰州畜
牧所提供。种子萌发长出约 1 cm根后置于浸过
1.00、1.25、1.50 mmol·L-1羟基脲的滤纸上培养
18 h, 蒸馏水冲洗3次, 移到浸过蒸馏水的滤纸上培
养3~5 h, 然后再移到浸过1 μmol·L-1氟乐灵的滤纸
上继续培养 6 h (上述各处理均在室温下避光进
行)。经上述处理的材料用蒸馏水冲洗 3次后放入
冰水中, 在 4 ℃中保存 24 h。以蒸馏水培养的种
子作对照。切取的根尖, 以卡诺固定液固定 2 h,
蒸馏水冲洗 3次, 再转入 1 mol·L-1 HCl中于室温下
处理 20 min。将材料放在载玻片上用卡宝品红染
色后压片, 显微镜观察、统计并拍照。
有丝分裂中期指数(%)=(中期分裂细胞数 /细
胞总数)×100。
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结果与讨论
在以往的植物根尖的同步化诱导研究中一般
采用低温、秋水仙素、8 - 羟基喹啉、饱和对二
氯苯等处理, 后来用8-羟基喹啉与秋水仙素结合的
方法, 用这些方法处理的有丝分裂中期指数往往偏
低 (赵吉平等 1991; 周爱文等 2001; 齐志广等
2003)。现在, 常采用羟基脲和甲基氨草磷或氟乐
灵双阻断法来诱导细胞同步化。羟基脲是一种
DNA合成抑制剂, 它通过抑制核糖核酸还原酶的活
性来阻断DNA的合成, 对处于 S期的细胞起作用,
而对其它各期细胞不起作用, 因此用羟基脲处理时,
首先是S期细胞DNA合成受阻, 其它各期细胞仍然
继续运转, 当G1期进入 S期开始合成DNA时即受
阻断, 再过适当时间, 大部分细胞都集中于前S期。
一旦去除羟基脲作用后, 细胞就进入下一个时期。
而甲基氨草磷或氟乐灵是一种干扰细胞微管蛋白合
成的特异性药物, 能阻止中期细胞纺锤丝的产生使
细胞停留在中期, 起收集中期染色体的作用。彭永
康等(1998, 1999)在小麦和大蒜根尖分生组织中用
羟基脲-甲基氨草磷双阻断法分别得到50%和35%
的分裂中期同步化细胞; 陈成彬和宋文芹(1999) 用
此种方法诱导小麦、大麦、黑麦、蚕豆、玉米、
水稻等植物根尖细胞同步化, 有丝分裂中期指数分
别为 65%、51%、50%、60%、33%、50%; 王
晓娜等(2006)用羟基脲 -氟乐灵双阻断法诱导小麦
根尖细胞同步化, 有丝分裂中期指数达到 70%~
80%。与低温和其它药物处理效果相比, 羟基脲 -
甲基氨草磷或羟基脲-氟乐灵双阻断法对中期分裂
指数的提高很明显, 可获得较高的有丝分裂中期指
数(彭永康等 1998, 1999; 陈成彬和宋文芹 1999; 王
晓娜等 2006)。
本文用 1.00、1.25、1.50 mmol·L-1三种浓度
的羟基脲分别对鹰嘴紫云英根尖处理18 h, 室温水
培恢复生长 4 h, 1 μmol·L-1氟乐灵处理 6 h, 冰水处
理 24 h, 常规压片观察。结果表明, 随着羟基脲浓
度的提高, 有丝分裂中期指数也在增大。在这 3种
浓度中, 1.25和 1.50 mmol·L-1羟基脲处理的有丝分
裂中期指数明显提高, 分别可达 80%和 90% (表
1)。用羟基脲和氟乐灵双阻断后, 在鹰嘴紫云英根
尖细胞有丝分裂中可清楚地看到, 细胞分裂基本上
被阻断在中期, 除可见到部分间期细胞以外, 未见
到前期、后期和末期细胞(图 1-a、b), 表明用羟
基脲和氟乐灵双阻断法可有效地将鹰嘴紫云英根尖
有丝分裂阻断在中期。
进一步放大的结果表明, 以 1.25 mmol·L-1的
表 1 不同处理条件下的有丝分裂中期指数
Table 1 Exposure condition and metaphase index
处理时间 /h
羟基脲浓度 /mmol·L-1 有丝分裂中期指数 /%
羟基脲 室温水培 氟乐灵 冰水
1.00 1 8 4 6 2 4 4 0
1.25 1 8 4 6 2 4 8 0
1.50 1 8 4 6 2 4 9 0
羟基脲处理时, 有丝分裂正常, 染色体形态良好, 未
见到染色体畸变现象, 且姊妹染色单体清晰可辨(图
1-c), 而 1.50 mmol·L-1处理的染色体明显出现畸变
(图 1-d)。由此可见, 高浓度的羟基脲对染色体有
毒害作用, 表明鹰嘴紫云英的最适羟基脲浓度为
1.25 mmol·L-1。
据报道, 不同植物有丝分裂中期同步化诱导时,
以羟基脲处理后再以室温水培恢复生长所用的时间
相差很大, 这可能有两方面的原因: (1)不同植物由
S期到中期的时间不同; (2)不同植物对羟基脲的敏
感性不同, 所以去除羟基脲后恢复分裂的速度就不
同(陈成彬和宋文芹 1999)。鹰嘴紫云英经羟基脲
处理后, 大部分细胞有丝分裂同步在前 S期, 此时
再经水培, 细胞周期可以继续前进。为了促使更多
的细胞有丝分裂同步在中期, 我们以水培方法将鹰
嘴紫云英根尖在 1.25 mmol·L-1羟基脲中处理 18 h
和在 1 μmol·L-1氟乐灵中处理 6 h, 结果表明 4 h为
最佳水培时间(图 2)。
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图 1 羟基脲和氟乐灵双阻断的有丝分裂中期同步化细胞
Fig.1 Mitotic metaphase synchrony cells with the treatments of hydroxyurea and trifluralin
a: 1.25 mmol·L-1羟基脲, 1 μmol·L-1氟乐灵, 400×; b: 1.50 mmol·L-1羟基脲, 1 μmol·L-1氟乐灵, 400×; c: 1.25 mmol·L-1羟基脲, 1
μmol·L-1氟乐灵, 1 000×; d: 1.50 mmol·L-1羟基脲, 1 μmol·L-1氟乐灵, 1 000×。
总之, 在植物有丝分裂同步化过程中, 可以获
得大量的中期染色体, 但由于染色体易粘连在一起,
给以后的工作带来了很大的困难, 陈成彬和宋文芹
(1999)认为冰水处理对减少染色体粘连有一定效
果。我们的实验也表明, 鹰嘴紫云英根尖用氟乐灵
处理后, 再放入冰水中处理24 h, 染色体分散较好。
植物生理学通讯 第 45卷 第 8期，2009年 8月760
但冰水处理时间要适度, 时间太短, 染色体不易分
散; 时间太长, 则会造成染色体过短而降低分辨率。
参考文献
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图 2 水培对根尖细胞有丝分裂中期指数的影响
Fig.2 Effect of water on metaphase index of root tip cells
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