全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2014, 50 (3): 351~357 351
收稿 2013-11-21　　修定 2014-01-12
资助 国家重点基础研究发展计划(2012CB944803)、浙江省青
年科学基金(LQ13C020002)和浙江省博士后项目择优资助
(Bsh1202082和Bsh1202081)。
* 通讯作者(E-mail: yzhu1974@hotmail.com; Tel: 0571-
86419102)。
一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立
段炼1,2, 钱君2, 郭小雨2, 朱英2,*
1浙江师范大学化学与生命科学学院, 浙江金华321004; 2浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所, 浙江省植物有害生物
防控重点实验室, 省部共建国家重点实验室培育基地, 杭州310021
摘要: 在模式植物拟南芥中, 原生质体瞬时表达技术已被广泛地应用到功能基因组学的研究中, 但水稻原生质体因其制备
过程相对繁琐, 转化效率偏低, 尚未在基因功能研究中获得广泛应用。本研究在拟南芥原生质体制备和转化的基础之上,
对水稻原生质体的制备和转化方法进行改良优化。以水稻幼茎为起始材料, 采用纤维素酶R-10和果胶酶R-10, 对水稻组织
进行消化并利用蔗糖密度梯度自沉降的方法分离原生质体, 获得了高纯度的原生质体。对质粒转化原生质体时的转化方
法、转化时间及质粒浓度进行探索, 在缩短原生质体分离时间的同时, 大大提高了转化效率。用较少量的质粒DNA即可获
得外源基因在原生质体内高效的表达, 且转化效率可达70%。我们建立的这种快速有效的水稻原生质体制备和转化方法,
可为水稻功能基因组学研究提供技术支持。
关键词: 水稻; 原生质体; 自沉降法
A Rapid and Efficient Method for Isolation and Transformation of Rice
Protoplast
DUAN Lian1,2, QIAN Jun2, GUO Xiao-Yu2, ZHU Ying2,*
1College of Chemistry and Life Science, Zhejiang Normal University, Jinhua, Zhejiang 321004, China; 2State Key Laboratory
Breeding Base for Zhejiang Sustainable Pest and Disease Control, Institute of Virology and Biotechnology, Zhejiang Academy of
Agricultural Sciences, Hangzhou 310021, China
Abstract: Transient gene expression in protoplast is a common approach for studying subcelluar localization,
promoter activities and protein complexes in model plant, Arabidopsis. However, protoplast isolation,
transformation and as well as downstream analyses in rice are often hampered by a number of factors such as
time-consuming, cost-intensive and low transformation efficiency. In this study, we reported a rapid and
efficient method for isolation and transformation of rice protoplast, based on the recently published procedure
for Arabidopsis protoplast preparation. 10-to-14-days stem tissues but not leaf tissues were digested by proper
cellulase R-10 and mecerozyme R-10. Pure protoplasts without cell debris were isolated from the interphase of
sucrose gradient after natural sink. This method was also very time-efficient, large amount of protoplasts could
be obtained within one day. The transformation efficiency was pretty high (70%) with little amount of DNA.
The method we presented here should be valuable for the functional genomics research in rice.
Key words: rice (Oryza sativa); protoplast; the self-settlement method
植物原生质体(protoplast)是指通过质壁分离
能够分开的那部分细胞物质。离体的原生质体在
适当的条件下具有繁殖、分化、再生成完整植株
的能力(张红梅和王俊丽2002)。近年来, 原生质体
瞬时表达技术被广泛应用于基因功能研究, 其原
因除了原生质体易于制备外, 还与其本身可以摄
取外源细胞器、病毒、质粒以及DNA等各种大分
子物质有关(An等2005)。在双子叶植物中, 重组质
粒转化原生质体的相关技术已经十分纯熟, PEG法
介导的原生质体转化是实现该技术的重要手段之
一。早在1989年, 就有Damm等(1989)成功将外源
基因转入了模式植物拟南芥的原生质体中。此后,
关于拟南芥的原生质体的相关报道层出不穷。拟
南芥原生质体除了被用于胞内运输机制(Chen和
Halkier 2000; Wolfenstette等2012)的探索、蛋白的
亚细胞定位、蛋白-蛋白互作、DNA与蛋白质的
相互反应(Faraco等2011; Yoo等2007)外, 还被用作
反向遗传学研究的受体(Zhai等2009)。
植物生理学报352
在双子叶植物原生质体技术迅速发展的同时,
关于单子叶植物——水稻的原生质体的相关报道
也越来越多。Tang等(2012)利用原生质体技术定
位了水稻硝酸盐转运蛋白OsNRT2.3a, 发现其主要
位于细胞膜上。Cao等(2011)则采用GFP与目的基
因融合的方法 , 清晰地观察到单糖转运蛋白
OsGMST1位于高尔基体上。尽管如此, 单子叶植
物因其结构特殊, 原生质体的制备相对来说比较
困难, 且原生质体分离及转化的实验条件并不十
分完善。在过去很长一段时间内, 单子叶植物原
生质体是借助植物组织培养技术建立的悬浮细胞
培养体系分离而来的(Thomas等1993)。但这种方
法所需周期较长, 且培养过程中容易染菌, 并不能
做到瞬时、快捷。Zhang等(2011)的研究发现, 以
水稻幼茎、叶和叶鞘等组织为试验材料, 也可以
分离出优质的原生质体。但幼茎、叶及叶鞘的原
生质体形态上还有一定的差别, 这些差别并没有
完全证实。此外, 不管是在拟南芥、水稻还是其
他植物的原生质体分离过程中, 大都参考了与Yoo
等(2007)或Bart等(2006)类似的分离方法, 在获取
原生质体的过程中采用密度梯度离心。但离心获
得的原生质体中容易混有大量的细胞碎片, 干扰
后续过程中的转化及其他酶促反应。本研究采用
蔗糖密度梯度自沉降的方法, 可从水稻的幼茎中
分离到高纯度的原生质体细胞, 且保持细胞大小
较为一致, 为后续的转化和其它分子生物学操作
提供方便。我们进一步通过改变后续转化时的质
粒浓度、转化时间和转化条件等参数, 建立起一
个快速、简便并高效的水稻原生质体瞬时表达系
统, 为今后水稻功能基因组学研究搭建了一个可
靠的技术平台。
材料与方法
1 材料与设备
1.1 设备
Eppendorf抽真空仪、TS-1 (水平摇床)、低速
离心机(Eppendorf 5810R)、荧光显微镜(Nikon
C-HGF1)、荧光体视镜(LEICA M165-Fc)、普通光
学显微镜(Nikon ECLIPSE E100)、100 mL小烧杯
(灭菌)、过滤器、锡箔纸、手术刀片、纱布、血
球计数板等。
1.2 试剂
1/2MS固体培养基、FDA (二乙酸荧光素)、
TVL (0.3 mol∙L-1山梨醇、50 mmol∙L-1 CaCl2)、W5
(154 mmol∙L-1 NaCl、125 mmol∙L-1 CaCl2∙2H2O、5
mmol∙L-1 KCL、2 mmol∙L-1 MES, pH 5.7)、酶液(1
mol∙L-1蔗糖、0.2 mol∙L-1 MES, pH 5.7、1 mol∙L-1
CaCl2∙2H2O、2 mol∙L
-1 KCl、3% cellulase、0.6%
mecerozyme)、MMG (4 mmol∙L-1 MES, pH 5.7、
0.4 mol∙L-1甘露醇、15 mmol∙L-1 MgCl2)、PEG转化
液(40% PEG4000、0.2 mol∙L-1甘露醇、100 mmol∙L-1
CaCl2 )、质粒小提试剂盒(Axyprep
TM plasmid Miniprep
kit 250-prep, AXYGEN)。上述试剂, cellulase和
mecerozyme产自日本YHO KUNITACHI SHI, YAKULI
PHA RMACE UTICAL IND, 山梨醇、蔗糖、MES、
甘露醇和CaCl2出自SIGMA, 其余基本试剂都由生
工生物公司生产。
2 方法
2.1 材料的获取
取适量颗粒饱满的‘日本晴’ (Oryza sativa L.
spp. japonica. cv. Nipponbare)种子去颖壳, 装入50
mL无菌离心管, 用50%的乙醇洗30 s; 无菌水清洗1
次; 加入足量50%的次氯酸钠, 置水平摇床消毒30
min; 用无菌水洗8~10次, 以去除次氯酸钠。将消
毒完的种子铺在装有1/2MS固体培养基的组培瓶
中, 放置于组培室培养10~14 d (培养条件: 25 ℃,
光照时间12 h)。
2.2 原生质体分离
在超净台上用锋利的手术刀片将1~3 g植物组
织切成0.5 mm大小条段(尽量只切一刀, 避免对植
物组织造成过多伤害), 转入装有15 mL TVL溶液
的小烧杯中黑暗静置30 min; 加入酶液15 mL, 摇
匀, 抽真空1 h; 置于水平摇床上, 60 r∙min-1, 摇4 h;
用8层纱布过滤酶解后的混合液到无菌的50 mL离
心管中; 再缓慢滴加20 mL W5溶液至上述50 mL离
心管中; 4 ℃冰箱内放置30 min以上, 使其自动沉
降。原生质体富集到溶液中间层, 因含叶绿体, 呈
现出绿色, 极易区分。
2.3 原生质体纯化
吸取约10 mL原生质体富集层溶液至50 mL离
心管, 加入10 mL W5溶液, 混匀; 100×g离心5 min,
去上清; 加入10 mL W5重悬原生质体, 100×g离心5
段炼等: 一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立 353
min, 去上清; 加入1.5~3 mL W5重新悬浮原生质体,
冰上放置30 min。
2.4 原生质体得率计算
采用血球计数板计数法, 将稀释10~100倍的
原生质体溶液滴到血球计数板上, 在普通光学显
微镜下计算原生质体数目。
原生质体得率即每克鲜重材料所得的原生质
体个数[个∙g-1 (FW)]=血球计数板5个大方格内总原
生质体个数×104×稀释倍数/幼茎质量[g (FW)]。
2.5 原生质体活性检测
取100 µL原生质体溶液, 用等体积的0.01%二
乙酸荧光素(FDA)染色10 min, 加入800 µL W5稀
释到1 mL, 100×g离心5 min, 去上清, 再加入适量
W5, 混匀。用荧光显微镜拍摄白光和绿色荧光下
的原生质体并计数, 计算发荧光的原生质体与总
原生质体数的比值(取3个视野, 计算平均值)。原
生质体活力=(发荧光的原生质体数/原生质体总
数)×100%
2.6 原生质体转化
将冰上处理后的原生质体溶液置于低速离心
机100×g离心5 min, 去除上清液; 加入1.5 mL MMG
溶液重新悬浮; 在2 mL圆底离心管中配制如下反
应液: 表达绿色荧光蛋白EGFP的pSTAN1质粒10
µL和原生质体100 µL, 均匀混合。然后加入等体
积(110 µL)的PEG转化液, 轻拍离心管底部, 使液体
混合均匀, 室温放置5 min以上; 加入W5至1 mL, 终
止反应; 100×g离心10 min, 去上清; 加入1 mL W5
重悬原生质体, 25 ℃暗条件培养过夜。
2.7 转化效率检测
100×g离心2 min收集原生质体, 去上清, 留约
100 µL, 混匀; 荧光显微镜镜检, 挑选3个视野, 计算
平均值。转化效率=荧光下视野内表达绿色荧光的
原生质体数/白光下视野内的原生质体数×100%。
实验结果
1 原生质体的分离
生长12 d的水稻幼苗, 分别取叶和茎进行了同
样的酶处理及原生质体分离操作。用纤维素酶
(CELLULASE ONOZUKA R-10)和果胶酶(MAC-
EROZYME R-10)共同处理4 h, 过滤去除组织碎片,
4 ℃静置30 min后, 离心管中出现分层现象。其中,
幼茎组织酶解效果明显高于叶片, 原生质体层清
晰可见, 而叶片的酶解产物肉眼几乎不见原生质
体层(图1-A和B)。
由于水稻叶片主要由长细胞和短细胞构成,
短细胞可分为硅质细胞和栓质细胞。其中, 硅质
细胞充满硅质, 质地坚硬。此外, 水稻叶片的叶肉
组织均一, 木质部靠近表皮, 维管束鞘和表皮之间
具有厚壁细胞。相较而言 , 水稻幼茎除了韧皮
部、木质部及维管束鞘等较为坚硬的细胞外, 多
图1 叶片和茎组织分离的水稻原生质体的比较
Fig.1 Comparison of protoplast isolated from rice leaves and stem tissues
A: 用水稻叶片分离原生质体, 无可见的原生质体富集层; B: 用水稻幼茎分离原生质体, 可见原生质体富集层; C和D分别从水稻叶片
和幼茎中分离的原生质体细胞, 放大倍数为400倍。
植物生理学报354
由薄壁细胞组成。我们推测这些可能是造成叶片
组织难以被纤维素酶和果胶酶消化而幼茎容易分
离出原生质体的主要原因。
2 从叶片和幼茎分离的原生质体形态比较
用显微镜观察从幼叶和幼茎中分离的原生质
体, 可知水稻幼叶及叶鞘原生质体富含叶绿体, 且
几乎充满了整个细胞(图1-C)。而幼茎原生质体多
数细胞叶绿体含量少, 细胞大。且有的因细胞液
丰富, 细胞器被中央大液泡挤到边缘位置(图1-D)。
根据Pitzschke等(2012)的研究报道, 高含量的叶绿
体和叶绿素可能会妨碍瞬时表达体系的应用及下
游操作。因此, 我们认为相较于水稻叶片, 幼茎是
建立原生质体瞬时表达体系的良好材料。
3 原生质体得率
将3 g鲜重的幼茎组织分离得到的原生质体用
W5稀释10倍后, 用血球计数板计数, 5个大方格内
的总数约为504个。故原生质体得率为504×104×
10/3=1.68×107 个∙g -1 (FW)。
4 密度梯度自沉降法与离心法的比较
4.1 原生质体纯度
目前绝大多数分离原生质体的方法用的是离
心法, 我们的研究中采用4 ℃静置沉降的方法, 依
靠溶液中的蔗糖形成自然的密度梯度沉降原生质
体。为了比较密度梯度自沉降法和离心法的差别,
同样方法获得的酶解液用100 g∙min-1的转速离心,
获得的沉淀用W5溶液悬浮, 并在显微镜下镜检。
结果发现, 离心法获得的原生质体大小不均一, 且
含有大量的细胞碎片(图2-A); 而用自沉降法获得
的原生质体大小相对比较均一, 无杂质(图2-B)。
4.2 原生质体活力
将以上两种方法获得的原生质体分别用FDA
法染色, 并用荧光体视镜观察, 如图3-A和B, 可知
用密度梯度自沉降法分离的原生质体活力高于离
心法分离的原生质体。计算得出两者的活力分别
为88.4%和66.7%。
由离心法获得原生质体容易混有过滤过程中
未去除的细胞碎片, 无论是在纯度上还是活力上
都比自沉降所得的原生质体差, 且原生质体大小
没有自沉降法获得的均一, 叶绿素含量高的原生
质体占的比例多。杂质和高叶绿素含量可能会影
响后续的原生质体转化的效率及对转化子的进行
后续功能基因组学分析的效果。因此, 我们认为
密度梯度自沉降法明显优于传统的离心法。
5 不同质粒浓度与转化效率的关系
许多研究认为, 转化时原生质体的数目、外
源质粒的浓度及构象都会影响原生质体的转化效
率。对拟南芥的研究表明, 取2.0×104个细胞进行
不同质量质粒DNA对转化效率影响的实验, 发现
最佳质粒浓度为2 µg∙µL-1 (梁大伟2009)。据Bart等
(2006)的研究, p35S-GFP质粒转化水稻幼茎及叶鞘
的原生质体, 原生质体数1~5×106个∙mL-1, 质粒浓
度增加到5 µg∙µL-1时, 转化效率可达60%~70%, 再
继续增加质粒浓度 , 转化效率并没有大幅度提
高。而在Pitzschke等(2012)的研究中 , 一品红
(Euphorbia pulcherrima)原生质体的转化, 50 µL体
系中需有30~40 µg质粒及20 000~100 000个原生质
体。可见植物种类不同、转化体系不同, 最佳质
粒浓度也不尽相同。为此, 本实验设定了以下5个
图2 用离心法和自沉降法获得的水稻原生质体的比较
Fig.2 Comparison of the quality of protoplasts isolated via centrifugation and sucrose gradient after natural sink
A: 离心法获得的水稻原生质体; B: 蔗糖密度梯度自沉降法获得的水稻原生质体; 光镜下检测, 放大倍数为120倍。
段炼等: 一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立 355
质粒浓度: 0.1、0.3、0.5、0.7和1 µg∙µL-1; 原生质
体数1×104~5×104个∙mL-1; 取质粒10 µL, 最终转化
体系为220 µL。显微镜下拍摄结果及估算的转化
效率见图4, 统计所得转化效率变化结果见图5 (取
3个视野计算平均值, 过小细胞、聚成团以致辨不
清细胞数的细胞以及转化过程中导致的破损细胞
排除计数)。
本实验结果显示: 转化效率随质粒浓度的增
加而增大, 虽然在1 µg∙µL-1时转化效率最高, 但在
0.7 µg∙µL-1时已能达到很高的转化效率(为60%~
图3 FDA染色法比较离心法和自沉降法获得的水稻原生质体活力
Fig.3 Comparison of the activity of protoplasts isolated via centrifugation and sucrose gradient after natural sink
A和C: 离心法获得的水稻原生质体; B和D: 蔗糖密度梯度自沉降法获得的水稻原生质体。LM: 普通光镜; FM: 荧光镜, 放大倍数为
120倍。
图4 显微检测不同质粒浓度下的转化效率
Fig.4 Transformation efficiency with different concentrations of plasmid DNA by microsocope
LM: 普通光镜; FM: 荧光镜, 放大倍数为120倍。
植物生理学报356
70%), 足够用于下游的显微观察及分子生物学实
验, 比一般的原生质体转化要求的质粒浓度低。
且本实验中的质粒均为普通的小量提取试剂盒所
提质粒, 无需用质粒大量提取试剂盒, 可降低实验
的成本, 简化实验步骤。
6 原生质体转化的转化时间、转化方法探索
拟南芥原生质体转化的反应时间一般设定在
5~30 min以内(Zhai等2009)。而Bart等(2006)则表
明15 min转化水稻原生质体能获得相对较高的转
化效率。我们也对采用本实验条件分离的水稻原
生质体进行了转化时间的摸索。此外, 由于大肠
杆菌质粒转化时常常使用短时热激的方法来提高
转化效率, 我们在原生质体转化过程中也尝试加
入了42 ℃热激处理的步骤, 以研究热激对原生质
体转化效率的影响。
按照上述条件用0.7 µg∙µL-1的质粒作为标准
浓度, 在加入PEG转化液后, 分别对转化体系做了
如下处理: (1)室温5 min; (2)室温10 min; (3)室温15
min; (4)冰上5 min, 42 ℃水浴5 min, 冰上5 min; (5)
室温5 min, 42 ℃水浴5 min, 室温5 min。各种处理
后的转化效率见图5。我们的结果(图6)显示: 转化
时室温放置时间在10 min时, 转化效率明显高于室
温放置5和15 min, 可见转化时放置时间过短或太
长都对转化效率有影响。另外, 根据两个热激结
果, 先经过冰上处理再经过热激处理的转化体系,
最终转化效率明显低于只经过热激处理的转化体
系。我们由此推断, 在转化过程中, 太过剧烈的温
度变化会对原生质体造成一定的伤害, 但在常温
条件下对原生质体进行42 ℃热激对转化效率的提
高有促进作用的。
尽管转化时间和转化条件对转化效率有一定
的影响, 但其影响程度明显小于质粒浓度对转化
效率的影响。我们用不同浓度的质粒做过相同的
处理, 在浓度达到1 µg∙µL-1时, 不同处理所引起的
转化效率的变化没有低浓度时明显。这表明质粒
浓度的高低对转化效率的影响更大。
讨　　论
在拟南芥原生质体的分离过程中有学者用纤
维素酶、果胶酶、离析酶R-10、半纤维素酶等多
种酶类做过酶解效率的探索。许多关于水稻原生
质体瞬时表达体系如何建立的文献中也有关于不
同种类、浓度酶及辅助消化物质的使用。如Bart
等(2006)的研究就用到了1.5%的纤维素酶和0.75%
的果胶酶以及0.1%的BSA。我们发现, 在实验中
用浓度为3%的纤维素酶和0.6%的果胶酶消化水稻
幼茎已经可以分离出足够量的原生质体。此外,
在酶解之前, 我们借助抽真空仪对植物组织及酶
液的混合物进行了真空抽滤。此法既可促使细胞
质壁分离, 加速酶液渗透细胞壁, 扩大酶液的作用
范围, 又可缩短酶解时间, 防止因解离时间过长对
细胞造成过多伤害。采用这种酶解方法, 在酶解4
h后, 解离出的原生质体的数目可达1×107个∙g-1
图6 不同转化方法下所得的转化效率比较
Fig.6 Transformation efficiency test by using
different transformation methods
1: 常温5 min; 2: 常温10 min; 3: 常温15 min; 4: 冰上5 min, 42 ℃
热激5 min, 冰上5 min; 5: 室温5 min, 42 ℃热激5 min, 室温5 min。
图5 不同质粒浓度下转化效率的统计
Fig.5 Transformation efficiency test by using different
concentrations of plasmid DNA
段炼等: 一种快速高效的水稻原生质体制备和转化方法的建立 357
(FW)以上。
在分离原生质体的过程中, 我们参照了Zhai
等(2009)建立的拟南芥原生质体瞬时表达体系中
使用的密度梯度离心法, 并对其做了改进。由于
采用离心沉降的方法, 稍有不慎细胞碎片和杂质
就会和原生质体一起沉降, 即使小量的细胞碎片
和杂质, 也可能会降低后续的转化效率。另外对
离心机和实验过程中试剂体积的要求非常苛刻,
否则在短时间离心过程中很可能不能形成密度梯
度, 最终导致无法得到原生质体富集层。当用密
度梯度自然沉降的方法替代密度梯度离心时, 利
用酶解液中的蔗糖形成自然的密度梯度, 大小均
一, 形态完整的原生质体可处于同一密度梯度, 形
成一个原生质体富集层。比重大的细胞碎片自沉
降到管子底部, 不会混入原生质体层。另外有报
道指出, 原生质体离体的时间越长, 其生理功能、
活性以及转化效率就越低。应用此方法, 可在当
天制备原生质体当天进行转化。在不损耗原生质
体活力的同时减少了细胞碎片对有活力的原生质
体的干扰, 提升了转化效率。既保证了瞬时表达
体系的有效性, 又可节省实验时间。
本实验对原生质体转化时所需的质粒浓度及
转化条件进行了探索, 发现7 µg质粒(0.7 µg∙µL-1,
10 µL)在220 µL转化体系中时已经能够达到
60%~70%的转化效率, 足够用于基因组学的其他
后续实验操作。且0.7 µg∙µL-1的质粒浓度用小量提
取的试剂盒即可获得, 简化了实验步骤, 降低了实
验成本。除了质粒浓度外, 转化的时间、转化时
的温度对转化效率都有一定的影响, 加入PEG后静
置时间过长或过短都不利于转化效率的提高, 42
℃热激能提高转化效率, 但在做热激前后, 温度的
跳跃性不宜太大, 否则非但不能提高转化效率还
会对原生质体造成伤害。此外, 质粒浓度对转化
效率的影响明显强于转化条件。
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