全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (7): 1061~1066　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2014.0610 1061
收稿 2015-01-04　　修定 2015-07-06
资助 国家自然科学基金(31200236)和中国博士后科学基金面上
资助(2013M541683)。
* 通讯作者(E-mail: tanxiaoyun@njau.edu.cn; Tel: 025-
84395044)。
拟南芥果胶甲酯化酶基因PME17在抵御丁香假单胞杆菌番茄致病变种
DC3000株中的功能
张倩, 鲍依群, 谭小云*
南京农业大学生命科学学院, 南京210095
摘要: 细胞壁是植物抵御病原菌入侵的第一道屏障, 果胶是细胞壁初生壁的主要组分。果胶甲酯化酶(PME)是修饰果胶的
主要酶之一, 它在合成细胞壁、调节其弹性和通透性等过程中发挥重要作用。拟南芥基因表达数据库显示, PME17等多个
果胶甲酯化酶基因在病原菌侵染情况下强烈表达。本文研究了PME17的组织表达及其在丁香假单胞杆菌番茄致病变种
DC3000株(Pst DC3000)侵染过程中的功能。结果表明, 在未受Pst DC3000侵染的条件下, PME17基因在主根、根毛、子
叶、叶毛、花粉等部位表达; 在受Pst DC3000感染时, PME17表达显著增强。和野生型相比, pme17突变体对Pst DC3000侵
染更加敏感, 说明拟南芥PME17基因的表达受Pst DC3000的诱导, 并在防御Pst DC3000侵染中起积极作用。
关键词: 植物抗病; 细胞壁; 果胶甲酯化酶; 丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株
Functional Analysis of Arabidopsis thaliana Pectin Methylesterase Gene
PME17 in Immunity against Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000
ZHANG Qian, BAO Yi-Qun, TAN Xiao-Yun*
College of Life Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
Abstract: In plants, cell walls act as structural barriers against pathogen entry. Pectin, a major component of
plant cell wall, is critical for cell wall integrity. Pectin methylesterases (PMEs), which deesterify newly synthe-
sized pectins, is important for cell wall rigidity and elasticity. In Arabidopsis thaliana, published microarray
data indicated that expression of some pectin methylesterase genes (include PME17 gene) was up-regulated
during infection with various pathogens, suggesting that PMEs play important roles during pathogens infection.
In this study, we investigated expression pattern of PME17 gene and its function during infection by Pseudomo-
nas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000). We found that in normal conditions, PME17 gene was highly
expressed in root hairs, trichomes, and floral organs. Its expression level was obviously up-regulated under in-
fection of pathogen Pst DC3000. Furthermore, compared to wild type plants, pme17-2 mutant was more sensi-
tive to Pst DC3000 infection, indicating that PME17 gene plays a positive role in immunity against Pst DC3000
infection.
Key words: plant immunity; cell wall; pectin methylesterase; Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000
病原菌侵害是植物经常遭受的生物胁迫之一,
细胞壁是植物抵御病原菌侵害的第一道屏障。高
等植物初生细胞壁主要由多糖组成 , 包括纤维
素、半纤维素和果胶等(Caffall和Mohnen 2009)。
果胶是一种重要的起粘合作用的复杂多糖, 重量
占细胞壁干重的30%~35% (Smith和Harris 1999;
Novoselskaya等2000), 主要由同型半乳糖醛酸聚
糖(homogalacturonan, HG)、鼠李半乳糖醛酸聚糖I
(rhamngalacturonan I, RGI)、鼠李半乳糖醛酸聚糖
II (rhamngalacturonan II, RGII)和木糖半乳糖醛酸
聚糖(xylogalacturonan, XG)几种成分构成(Smith和
Harris 1999; Novoselskaya等2000)。其中, 最重要
的是HG, 它影响着细胞间的粘连和组织的硬度, 也
参与细胞间的信号传递, 并且与RGI、RGII等其他
多糖通过共价键交联来维持细胞壁结构的稳定
(Moustacas等1991; Pelloux等2007)。
果胶最初在高尔基体中合成, 其中初合成的
HG中70%~80%的半乳糖醛酸残基的C6是甲酯化
的(Moustacas等1991; Caffall和Mohnen 2009)。当
植物生理学报1062
HG运输到细胞壁后, 半乳糖醛酸残基C6的甲酯基
团将在果胶甲酯化酶(pectin methylesterase, PME;
EC 3.1.1.11)的催化下去甲酯化。HG去甲酯化的
方式至少有两种: 一种是连续、线性的, 通过这种
方式去甲酯化的HG结合环境中的钙离子, 形成钙
桥互相联结, 使得细胞壁更加坚硬; 另一种是不连
续、随机的, 通过这种方式去甲酯化的HG不会通
过钙桥互相联结, 而是导致细胞壁酸化, 激活多种
果胶降解酶来降解部分果胶, 使得细胞壁变软, 有
利于细胞生长(Pelloux等2007; Shen等2005)。因此,
PME在合成细胞壁及调节其通透性和弹性等方面
起着灵活而重要的作用。
模式植物拟南芥含有66个PME, 根据其蛋白
结构分为I和II两大类。I类只含一个PME结构域,
II类除了含一个PME结构域之外, 还有一个PMEI
(pectin methylesterase inhibitor)结构域(Bosch和He-
pler 2005)。不同的PME在拟南芥的不同器官、组
织或不同的生长阶段表达, 调节细胞壁的强度、
弹性和通透性, 以满足植物在不同条件下的生长
需要(Micheli 2007)。
前人的研究表明, 在病原菌侵染下, 拟南芥
PME的活性显著增强(Bethke等2014)。拟南芥基
因芯片数据库也表明多个PME基因(如PME3、
PME17、PME41)在病原菌侵染下加强表达(Zim-
mermann等2004), 暗示PME可能在植物抗病过程
中发挥重要功能。为了了解PME在植物抗病中的
功能, 我们选择了PME17基因(At2g45220)作为研
究对象。PME17基因编码了一个II类的PME, 基因
表达数据库显示, 它的表达在多种病原菌侵染的
条件下都显著增强, 但它在抗病中的功能并不清
楚。因此, 本文从PME17基因及pme17-2突变体入
手, 研究PME17的组织表达情况以及其在丁香假
单胞杆菌番茄致病变种DC3000株侵染过程中的功
能, 旨在探索果胶甲酯化酶在植物抗病过程中发
挥的作用。
材料与方法
1 实验材料
拟南芥(Arabidopsis thaliana)野生型Col-0和
T-DNA插入突变体pme17-2 (SALK_059908)种子购
买自Arabidopsis Resource Center。
丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株
(Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000, Pst
DC3000)来自中国科学院遗传与发育生物学研究
所谢旗研究员实验室。
2 实验方法
2.1 克隆构建以及拟南芥转化
将PCR扩增的PME17基因启动子序列(引物见
表1)连接到pCAMBIA1300221载体的GUS报告基
因前, 构建PPME17::GUS克隆, 用农杆菌转化法转化
拟南芥野生型Col-0植株。利用含有潮霉素的固体
MS培养基来筛选转基因阳性植株。
2.2 GUS染色
按照Tan等(2010)的配方配制GUS染液, 将植
物材料放入GUS染液中, 于37 ℃下染色4 h, 然后吸
出GUS染液, 用脱色液(无水乙醇:冰醋酸=3:1)进行
脱色, 待材料脱色充分后进行观察照相。
2.3 RT-PCR
提取不同组织的RNA, 利用反转录酶(TaKa-
Ra)反转录出cDNA第一链。选取PME17基因外显
子上两段序列为引物P1和P2 (表1), TUB8基因为内
参。以野生型和pme17-2突变体的cDNA为模板,
扩增出相应的基因片段。
2.4 Pst DC3000侵染拟南芥
将Pst DC3000接种在10 mL含有60 mg·L-1利
福平的液体KB培养基中, 28 ℃下培养过夜; 菌液
于1 800×g离心5 min, 弃上清; 用10 mmol·L-1 MgCl2
洗涤菌体沉淀一次, 之后用10 mmol·L-1 MgCl2再次
重悬菌体; 用10 mmol·L-1 MgCl2分别稀释菌液至
OD600值为0.002和0.0002, 备用。
选择萌发后生长5周植株中健康成熟的叶片,
用1 mL的不带针头的针管向叶片中接种菌液, 直
到菌液覆盖整个叶片为止, 每个植株接种3~4个叶
片, 每个基因型选取5~8个植株。
2.5 Pst DC3000侵染诱导PME17基因表达检测以
及pme17-2的致病表型观察
为检测Pst DC3000侵染对PME17基因表达的
影响, 将OD600值为0.002的Pst DC3000菌液侵染
PPME17::GUS转基因植株叶片, 24 h后进行GUS染色
实验并拍照; 以未经处理的叶片作为对照。另外, 将
同样浓度的菌液侵染野生型植株叶片, 24 h后提取
RNA并进行RT-PCR; 以未经处理的叶片作为对照。
张倩等: 拟南芥果胶甲酯化酶基因PME17在抵御丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株中的功能 1063
为观察Pst DC3000侵染植株后的致病表型,
将OD600值为0.002的Pst DC3000菌液侵染野生型和
pme17-2植株叶片, 4 d后观察叶片致病表型并记录。
2.6 接种部位Pst DC3000菌落密度分析
将OD600值为0.0002的Pst DC3000菌液侵染野
生型和pme17-2植株叶片, 使用直径为0.4 cm的打
孔器从接种0和4 d的叶片上取圆片, 每个叶片上取
1片, 每个植株取3~4片; 将收集好的圆片放入2 mL
的离心管中, 每管加入1 mL的10 mmol·L-1 MgCl2
进行破碎; 破碎后, 用10 mmol·L-1 MgCl2稀释至原
浓度的10-5倍。从稀释的菌液中吸取200 μL, 涂布
在含有60 mg·L-1利福平的KB培养基上, 25 ℃培养
箱培养1~2 d; 至培养皿上的菌落清晰可见时记录
菌落数目。根据菌落数目和叶片面积, 计算出单
位面积(cm2)叶片上Pst DC3000菌落形成单位(colo-
ny-forming units, CFU)的数量。实验独立重复3次,
用t检验来验证野生型和突变体CFU密度差异的显
著性。
实验结果
1 正常生长条件下PME17基因的组织表达分析
扩增PME17基因起始密码子前1 500 bp片段,
连接于GUS报告基因前, 构建PPME17::GUS克隆并转
化野生型植株, 获得31株转基因植株, 其中21株的
染色情况高度一致, 选取具有代表性的植株进行
进一步观察。
观察PME17基因在萌发后7 d幼苗中的表达,
结果显示, PME17在根中表达较强(图1-A), 主要表
达在根的伸长区、成熟区和根毛细胞中(图1-B),
在分生区几乎没有表达。在幼苗的下胚轴部位,
PME17基因几乎没有表达, 而在子叶边缘表达较
强。在萌发后3周植株中, PME17基因在叶肉细胞
中表达很弱, 但在叶毛中有较强的表达(图1-C和
D), 在茎中基本检测不到PME17基因的表达(图
1-E)。另外, PME17在花药、花粉、柱头上表达强
烈(图1-F~H), 在角果的顶端和底部与果柄连接处
表达强烈 , 在其他部位表达很弱(图1-I)。表明
PME17在一些极性生长的细胞(如根毛、叶毛)和
细胞快速生长的组织(如根的伸长区、花药等)中
强烈表达, 暗示在正常的生长发育过程中, PME17
基因可能在细胞快速生长过程中大量表达, 参与
新生细胞壁的合成过程。
2 Pst DC3000侵染诱导PME17基因表达
用Pst DC3000侵染PPME17::GUS转基因植株,
然后进行GUS染色观察。图2-A显示, 在未经处理
的叶片中, 叶肉细胞基本无染色, 只有叶毛部位能
够染上蓝色; 而经Pst DC3000侵染的叶片中, 在叶
片的大片面积能够染上蓝色, 其颜色明显深于未
经处理的叶片, 说明PPME17::GUS的表达确实是受
Pst DC3000侵染的诱导。同时用Pst DC3000侵染
野生型植株后进行RT-PCR, 结果表明, PME17基因
表达确实显著增强 (图2 - B ) , 说明病原菌P s t
DC3000侵染能够诱导PME17基因的表达, 暗示
PME17在病原菌Pst DC3000侵染过程中发挥一定
的功能。
3 pme17-2突变体的鉴定
PME17基因的T-DNA插入突变体SALK_059908
中, T-DNA插入在PME17基因的唯一内含子上, 位
于起始密码子ATG下游1 195碱基处(图3-A), 此前,
Senechal等(2014)已经将其命名为pme17-2, 本文即
沿用这个名称。基因组PCR确认这是一个纯合突
变体(图3-B)。RT-PCR确定这个突变体中PME17
基因还有微弱表达, 但是其表达量和野生型相比
显著下降, 因此它是一个PME17 因表达下调突变
表1 PCR引物列表
Table 1 PCR primers used in this study
　　　用途 引物名称 　　　　　引物序列(5→3)
扩增PME17基因启动子 Promoter P1 GCTGCAGCTAGTATTACGTTAATTAGTTATGA
Promoter P2 GCTCTAGAGCAAGCCATCATAAGACCAAATG
验证pme17-2纯合体 P1 ATGATGGCTTTTCGAGCTTAT
P2 GGGTTTTATTCAGAAACACC
P3 CAGAGACCAGAAGTGAACGG
扩增TUB8基因 TUB8 P1 CTTCGTATTTGGTCAATCCGGTGC
TUB8 P2 GAACATGGCTGAGGCTGTCAAGTA
植物生理学报1064
体(图3-C)。在正常生长条件下, pme17-2突变体并
未表现出明显的发育缺陷表型。
4 pme17-2突变体对Pst DC3000侵染更敏感
将P s t D C 3 0 0 0菌液分别侵染野生型和
pme17-2突变体真叶, 侵染后4 d观察叶片致病表型,
发现pme17-2的叶片几乎全部变成黄色, 且比野生
型更严重 (图 4 - A )。另外 , 我们还检测了 p s t
DC3000侵染后野生型和pme17-2突变体真叶菌落
生长情况, 统计结果显示: 在接种后0 d, 野生型和
p m e 1 7 - 2叶片的菌落密度分别是1 0 ( 2 . 8 3 ± 0 . 0 8 )和
10(2.75±0.06) CFU·cm-2, 二者并没有显著差异(t检验,
P<0.01); 而在接种后4 d, 野生型和pme17-2叶片的
菌落密度分别是10(6.71±0.09)和10(7.23±0.12) CFU·cm-2, 后
者显著高于前者(t检验, P<0.01)。可见, pme17-2突
变体对病原菌Pst DC3000侵染更加敏感, 也说明
PME17基因在防御病原菌Pst DC3000侵染过程中
发挥了积极作用。
讨　　论
植物细胞壁在抗病和抗其他逆境胁迫中发挥
屏障作用(刘清泉等2014)。PME在细胞壁合成以
及调节其弹性、通透性等方面发挥重要作用。本
图1 PME17基因的组织表达情况
Fig.1 PME17 gene expression pattern
A: 幼苗; B: 主根成熟区; C: 真叶; D: 叶毛; E: 茎; F: 花序; G: 花药; H: 柱头; I: 角果。标尺=1 mm。
图2 病原菌Pst DC3000诱导PME17基因表达
Fig.2 Expression of PME17 gene was induced by pathogen Pst DC3000 infection
A: Pst DC3000未处理的和处理24 h的PPME17::GUS转基因植株叶片的GUS染色照片; 标尺=5 mm。B: Pst DC3000未处理的和处理24 h
的野生型植株叶片中PME17基因的RT-PCR结果。
张倩等: 拟南芥果胶甲酯化酶基因PME17在抵御丁香假单胞杆菌番茄致病变种DC3000株中的功能 1065
生长条件下, PME17基因在一些极性生长的细胞如
根毛、叶毛中强烈表达, 也在主根和花器官里强烈
表达; 这与Senechal等(2014)发现PME17基因在主根
分生区和伸长区强烈表达的结果一致。我们发现
在子叶部分也有较弱的GUS染色, 染色部位主要在
子叶边缘, 而Senechal等的GUS染色结果显示PME17
基因并不在子叶表达, 这可能是由于不同转基因植
株GUS报告基因插入位点不同而导致的差异, 但我
们在大多数(19/31)转基因植株中观察到子叶能够被
GUS染液染色的现象, 因此本实验结果可能更合
理。总之, 本文数据暗示PME17基因参与主根、叶
毛、子叶、花器官的细胞壁合成过程。我们也观
察了pme17-2突变体的结实状况并与野生型作比较,
发现pme17-2突变体结实率为93.3%±2.4% (n=485),
和野生型(95.1%±3.7%, n=363)相比并没有显著差
异。突变体的种子形态正常且能够正常萌发, 说明
pme17-2突变体的育性以及种子发育是正常的, 这可
能是因为拟南芥中有多个PME, 功能冗余所致。
在Pst DC3000的侵染下, PME17基因加强表
达, 说明PME17的表达受Pst DC3000侵染诱导。和
野生型植株相比, pme17-2突变体对Pst DC3000侵
染更加敏感, 说明PME17发挥了抵御Pst DC3000侵
染的功能。其作用机制可能是在病菌侵染过程中,
PME17通过对新合成的果胶进行线性催化的方法
去甲酯化(Ezaki等2005), 使得细胞壁更加坚硬, 以
此来抵抗病原菌入侵。植物抗病的过程可能与水
杨酸信号途径和茉莉酸信号途径有关(冯汉青等
2014), Pst DC3000侵染诱导PME17基因表达可能
与茉莉酸信号途径有关。Bethke等(2014)在研究
病原菌对PME活性的诱导机制时发现, 利用芸苔
生交链格孢(Alternaria brassicicola)侵染拟南芥野
生型以及不同信号途径突变体, 包括dde2突变体
(阻断茉莉酸信号途径)、ein2突变体(阻断乙烯信
号途径)、sid2和pad4突变体(阻断水杨酸信号途
径), 发现只有在dde2突变体中, PME的活性不因病
原菌侵染而增强 , 而野生型和其他突变体中的
PME的活性都受芸苔生交链格孢侵染诱导而显著
增强, 说明茉莉酸信号途径介导了病原菌激活拟
南芥PME活性的过程。总之, 病原菌侵染植株引
起植物体内茉莉酸水平升高, 从而诱导PME基因
PME17强烈表达, 提高细胞PME的活性, 加固细胞
壁, 可能是植物抵抗病原菌侵染的一种防御机制。
图3 pme17-2突变体的鉴定
Fig.3 Identification of pme17-2 mutant
A: PME17基因结构图以及pme17-2突变体T-DNA插入位点;
B: 基因组DNA PCR鉴定pme17-2纯合体; C: RT-PCR显示pme17-2
纯合体是PME17基因的表达下调突变体。
图4 pme17-2突变体对Pst DC3000侵染比野生型更加敏感
Fig.4 pme17-2 mutant is more sensitive than wild-type plant
to Pst DC3000 infection
A: Pst DC3000菌液侵染4 d后的野生型和pme17-2突变体叶片,
标尺=1 cm; B: Pst DC3000菌液侵染后的叶片菌落密度, log10表示
纵坐标为菌落密度对10取对数后的数值。*表示差异显著, 经t检
验, P<0.01。
文以一个拟南芥PME基因PME17为对象, 研究其在
植株中的表达情况, 并且初步研究了pme17-2突变
体在抵抗Pst DC3000中的功能。结果表明, 在正常
植物生理学报1066
参考文献
冯汉青, 白晶月, 管冬冬, 贾凌云, 孙坤(2014). 细胞外ATP通过刺激
NADPH氧化酶缓解水杨酸诱导的细胞死亡. 植物生理学报,
50 (11): 1639~1644
刘清泉, 陈亚华, 沈振国, 郑录庆(2014). 细胞壁在植物重金属耐性
中的作用. 植物生理学报, 50 (5): 605~611
Bethke G, Grundman RE, Sreekanta S, Truman W, Katagiri F, Glaze-
brook J (2014). Arabidopsis pectin methylesterases contibute to
immunity against Pseudomonas syringe. Plant Physiol, 164 (2):
1093~1107
Bosch M, Hepler PK (2005). Pectin methylesterases and pectin dy-
namics in pollen tubes. Plant Cell, 17 (12): 3219~3226
Caffall KH, Mohnen D (2009). The structure, function, and biosynthe-
sis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydr Res, 344
(14): 1879~1900
Ezaki N, Kido N, Takahashi K (2005). The role of wall Ca2+ in the
regulation of wall extensibility during the acid-induced exten-
sion of soybean hypocotyl cell walls. Plant Cell Physiol, 46 (11):
1831~1838
Micheli F (2007). Pectin methylesterases: cell wall enzymes with
important roles in plant physiology. Trends Plant Sci, 6 (9):
414~419
Moustacas AM, Nari J, Borel M (1991). Pectin methylesterase, met-
al ions and plant cell-wall extension. Biochem J, 279 (Pt 2):
351~354
Novoselskaya IL, Voropaeva NL, Semenova LN, Rashidova SS (2000).
Trends in the science and applications of pectins. Chem Nat
Compd, 36 (1): 1~10
Pelloux J, Rusterucci C, Mellerowicz EJ (2007). New insights into
pectin methylesterase structure and function. Trends Plant Sci,
12 (6): 267~277
Senechal F, Graff L, Surcouf O, Marcelo P, Rayon C, Bouton S,
Mareck A, Mouille G, Stintzi A, Hofte H et al (2014). Arabidopsis
PECTIN METHYLESTERASE17 is co-expressed with and pro-
cessed by SBT3.5, a subtilisin-like serine protease. Ann Bot, 144
(6): 1161~1175
Shen Z, Pappan K, Mutti NS, He QJ, Denton M, Zhang Y, Kanost
MR, Reese JC, Reeck GR (2005). Pectin methylesterase from
the rice weevil, Sitophilus oryzae: cDNA isolation and sequenc-
ing, genetic origin, and expression of the recombinant enzyme. J
Insect Sci, 5: 21~30
Smith BG, Harris PJ (1999). The polysaccaride composition of Poales
cell walls: Poaceae cell walls are not unique. Biochem Syst Ecol,
27 (1): 33~53
Tan XY, Liu XL, Wang W, Jia DJ, Chen LQ, Zhang XQ, Ye D (2010).
Mutations in Arabidopsis nuclear-encoded mitochondrial phage-
type RNA polymerase gene RPOTm led to defects in pollen tube
growth, female gametogenesis and embryogenesis. Plant Cell
Physiol, 51 (4): 635~649
Zimmermann P, Hirsch-Hoffmann M, Heniing L, Gruissem W (2004).
GENEVESTIGATOR. Arabidopsis microarray database and
analysis toolbox. Plant Physiol, 136 (1): 2621~2632