全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2011, 47 (2): 147~152 147
收稿 2010-08-18 修定 　2010-12-06
资助 珠海市科技重大项目(PB2004 1018)和暨南大学创新培
育基金及本科生科技创新工程项目基金( cx0 90 8 8)。
* 通讯作者(E-mail: tiger@jnu.edu.cn, tzhangcw@jnu.edu.cn;
Tel: 020-85224366)。
氮胁迫对雨生红球藻色素积累与抗氧化系统的影响
杨瑾 1, 王铭 1,2, 李涛 1,2, 李爱芬 1,2,*, 张成武 1,2,*
暨南大学 1生态学系, 2水生生物研究中心, 热带亚热带水生态工程教育部工程研究中心, 广州 510632
摘要: 选用雨生红球藻CG-06为试验藻株, 以BBM为基础培养基, 分别设置了 0、13.7、27.5、41.2 mg·L-1四个硝态氮浓度
梯度, 分析并探讨在不同硝态氮浓度条件下雨生红球藻生长、生理特性、细胞内主要色素含量的变化以及抗氧化酶活性。
结果表明: 细胞中色素的积累量和积累速率与初始硝态氮浓度成反比, 与抗氧化酶活性呈负相关。缺氮时, 培养到第3天的
藻细胞中虾青素含量达到4.95 μg·mg-1, 而对照组在培养到第9天的细胞中才开始产生虾青素, 而且在整个培养周期内细胞
中的虾青素最大含量仅为 4.17 μg·mg-1。酶活测定结果显示, 虾青素含量较高的红色细胞中, 超氧化物歧化酶(SOD)、过氧
化氢酶(CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的活性明显高于绿色细胞, 且GSH-Px活性最高。研究表明, 雨生红球藻可
能有两种过氧化防御机制, 绿色细胞阶段以抗氧化酶作用为主, 在培养后期启动虾青素保护机制, 两种机制具有协同作用。
关键词: 雨生红球藻; 氮胁迫; 虾青素; 色素; 抗氧化酶
Effects of Nitrate-Nitrogen Stress on Pigment Content and Antioxidant Sys-
tems in Haematococcus pluvialis
YANG Jin1, WANG Ming1,2, LI Tao1,2, LI Ai-Fen1,2,*, ZHANG Cheng-Wu1,2,*
1Department of Ecology, 2Institute of Hydrobiology, Engineering Research Center of Tropical and Subtropical Aquatic Ecological
Engineering, Ministry of Education, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract: The effects of different nitrate-nitrogen concentrations on the growth, physiological characteristics,
pigment contents and antioxidant enzyme activities were investigated in Haematococcus pluvialis CG-06 grown
in BBM media with four series of nitrate-nitrogen concentrations (0, 13.7, 27.5, 41.2 mg·L-1). The results
showed that the accumulation amount and rate of the pigments and the antioxidant enzyme activities in H.
pluvialis CG-06 had negative correlation with the initial nitrate-nitrogen concentrations. The astaxanthin accu-
mulation amount in H. pluvialis cells grown in nitrogen-free BBM medium could be up to 4.95 μg·mg-1 on the
3rd day, however, the H. pluvialis cells grown in normal BBM medium (control group) started to accumulate
astaxanthin only on the 9th day, and its maximum astaxanthin content was 4.17 μg·mg-1 during the whole
growth period. The determination of antioxidant enzyme activities indicated that superoxide dismutase (SOD),
catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) activities in red cells of H. pluvialis with more astaxanthin
were always higher than those in green cells, and the maximum antioxidant enzyme activity in H. pluvialis cells
was the GSH-Px. In this study, it was suggested that H. pluvialis might have two mechanisms of antioxidative
defense. In the vegetative green cell stage, the antioxidase might play a major role and after that the cells started
to accumulate astaxanthin for further protection mechanism. Two mechanisms had a synergistic effect.
Key words: Haematococcus pluvialis; nitrogen stress; astaxanthin; pigments; antioxidase
雨生红球藻是一种淡水绿藻, 在红色细胞阶段
能大量积累虾青素(astaxanthin) (Guerin等 2003;
Naguib 2000)。虾青素具有强抗氧化活性和着色能
力, 广泛应用于保健品、化妆品和饲料等行业
(Guerin等 2003)。
雨生红球藻积累虾青素是细胞对环境条件胁
迫的一种防御响应。研究表明, 雨生红球藻在逆境
条件下, 包括强光、高温、营养盐(氮、磷)饥饿、
盐胁迫和氧化压力等(Hagen等2001; Boussiba 2000;
研究报告 Original Papers
植物生理学报148
Margalith 1999), 叶绿素及初生类胡萝卜素不足以
保护细胞免受损伤时大量产生次生类胡萝卜素
(Rise等 1994)。Boussiba (2000)报道在氮源缺乏条
件下, 雨生红球藻叶绿素的含量下降, 而虾青素合成
迅速, 当叶绿素含量低到一定程度时虾青素不再合
成(Boussiba和Vonshak 1991)。近年来, 关于雨生
红球藻积累虾青素的机制国内外都有相关研究报
道。如缺氮诱导虾青素快速积累时, 藻细胞的色素
组成和硝酸还原酶、Rubisco酶的活性发生改变,
光合放氧速率下降, 光系统的结构受到破坏等
(Kobayashi 2000)。雨生红球藻对逆境的防御机制
与胁迫环境中细胞内产生的活性氧有一定关系, 藻
细胞的抗氧化酶和虾青素都具有清除活性氧保护细
胞的作用(殷明焱等 1998; Tjahjono等 1994)。因此,
探讨雨生红球藻在氮素缺乏条件下, 细胞虾青素积累
与抗氧化酶活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含
量以及氮素消耗等的关系和规律, 为进一步研究雨
生红球藻高效合成虾青素机制提供基础和依据。
材料与方法
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis Flotow
CG-06)由暨南大学水生生物研究中心实验与应用
藻类学实验室藻种室提供。实验采用BBM培养基,
6 cm管径的柱状生物反应器, 培养温度为(24±0.5)
℃, 连续 60 μmol·m-2·s-1光照和通气(VCO2:V空气 =0.5:
99.5)培养。将培养至对数生长期的雨生红球藻
CG-06以 4 000×g离心 5 min, 收集藻泥, 用新鲜无
氮的 BBM培养基洗涤藻细胞以用于后续实验。
以BBM培养基中的NaNO3浓度为基础, 设置
4个不同NaNO3浓度实验: (1) 0 mg·L-1 NaNO3 (缺氮
实验组); (2) 13.7 mg·L-1 NaNO3; (3) 27.5 mg·L-1
NaNO3; (4) 41.2 mg·L-1 NaNO3 (对照组, 氮浓度与
BBM培养基中的相同)。将实验藻液分别接种于上
述培养基中培养, 各实验组均设 2个平行实验。每
隔 2 d取样测定相关参数。
采用藻液在750 nm的吸光值(OD750)表示雨生
红球藻的生长状况。利用分光光度法测定藻液的
叶绿素(Chl)和类胡萝卜素含量, 按以下公式计算:
Chl a=12.7×A663–2.69×A645; Car=4.70×A440–5.45×
A645–2.16×A663 (Jeffrey和 Humphrey 1975)。虾青
素含量的测定采用高效液相色谱(HPLC)法(Orosa
等 2005), 准确称取藻粉 10 mg, 先加入二甲基亚砜
(分析纯)溶液反复震荡萃取, 然后用丙酮定容至10
mL, 萃取好的样品经0.22 μm滤膜过滤后用于HPLC
分析(以上操作均避光进行)。采用的检测系统为
Agilent 1100, DAD检测器, Kromasil C18柱(250
mm×4.6 mm), 柱温 25 ℃, 流动相A (H2O)、B (丙
酮)、C (甲醇), 流速为 1 mL·min-1。洗脱条件参
考文献(李福生等 2009)。
取各处理组藻液 50 mL, 5 000×g离心 10 min,
弃上清液, 所得藻泥加入预冷的 0.05 mol·L-1磷酸
缓冲液(PBS, pH 7.8), 在冰浴条件下用超声波破碎
细胞, 12 000×g离心10 min, 上清液为粗酶提取液。
谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-
Px)的测定采用南京建成生物工程研究所生产的试
剂盒, 采用光化学还原法(Bewley 1979)测定超氧化
物歧化酶(superoxide dismutase, SOD), 紫外分光光
度法(Upadhyaya等 1985)测定过氧化氢酶(catalase,
C A T )的活性。M D A 含量采用硫代巴比妥酸
(thiobarbituric acid, TBA)分析法(Hernandez和
Almansa 2002)。用考马斯亮蓝法(李合生 2006)测
定可溶性蛋白含量。采用全自动连续流动化学分
析仪(Bran-Luebbe AutoAnalyzer 3, 德国)测定培养
液中硝态氮含量。
取各氮浓度处理下对数生长末期的藻液, 以
Clark型氧电极(Hansatech Oxygraph液相氧电极, 英
国)测量藻的光合放氧速率, 以空气饱和的蒸馏水标
定氧电极的满刻度, 通过加入少量Na2SO3粉末标定
零刻度, 反应体系温度由超级恒温水浴控制。光照
由LED光源提供, 通过光源控制器控制光强, 光照
强度由照度计(QRTI, Hansatech)测定。其中叶绿
素 a的测定按 Jeffrey和Humphrey (1975)的方法
(90% 丙酮)。
实验数据采用Origin 7.5软件进行图表绘制。
实验结果
1 雨生红球藻在不同氮浓度条件下的生长与光合
效率
由图1可见, 藻的生长状况(以藻液OD750表示)
与培养液的氮素浓度呈正相关关系。在整个实验
周期中, 缺氮实验组藻的增长始终处于较低的水平,
细胞增长不显著; 氮浓度为13.7和27.5 mg·L-1实验
杨瑾等: 氮胁迫对雨生红球藻色素积累与抗氧化系统的影响 149
组及对照组藻细胞增长明显, 3组藻液的OD750值在
培养前 3 d无差异, 在培养前 12 d内增长迅速, 均
达到最大值, 对照组藻的增长明显高于其他实验
组。显微镜观察表明, 缺氮实验组的藻细胞数量
增长虽不明显, 但细胞体积在生长后期有所增大。
雨生红球藻细胞的光合效率随培养基中氮浓
度的不同而呈现明显的差异, 氮缺乏对于藻细胞的
光合作用效率抑制很大(图 3)。
随着培养时间的延长, 培养基中的氮不断被消
耗, 藻细胞中水溶性蛋白的含量也明显降低(图 2),
各个处理组间的蛋白含量差异与培养环境中氮浓度
的差异呈正相关。氮是组成蛋白质的最主要的元
素, 缺氮则造成了藻细胞对生长所需蛋白质的合成
量受到限制, 这种影响也反映在相关抗氧化酶的合
成及活性变化方面。
2 不同氮浓度条件下雨生红球藻的色素含量
2.1 叶绿素
雨生红球藻的总叶绿素含量与氮素浓度呈正
相关性。缺氮实验组藻液的叶绿素含量从开始就
呈下降趋势, 培养至第 9天后基本稳定; 氮浓度为
13.7和27.5 mg·L-1实验组和对照组在培养前3 d叶
绿素含量相近, 后期随着细胞数目的不断增长, 分
别在第6~9天达到最大值; 对照组的叶绿素含量最
高, 为 26 mg·L-1, 分别是氮浓度为 13.7和 27.5 mg·L-1
实验组的 1.73和 2.36倍(图 4-A)。从图 4-B可以
看出, 培养基中硝态氮的含量在培养的前 3 d下降
速度最快, 其中氮浓度为 13.7 mg·L-1实验组在第
3天时的硝态氮浓度仅为 0.293 mg·L-1, 消耗率为
99.64%, 氮浓度为 27.5 mg·L-1实验组和对照组的
氮消耗率依次减小, 分别为 96.31%和 91.25%; 从
第 3~6天, 氮浓度下降趋于平缓; 第 6天之后, 各实
验组均检测不到硝态氮。
2.2 类胡萝卜素
由图5可见, 各实验组类胡萝卜素含量均呈上
升趋势。由于缺氮实验组很大程度上藻的生长受
到抑制, 藻液的类胡萝卜素含量最低; 其他 3个实
验组藻液的类胡萝卜素含量与培养液氮素浓度呈负
相关, 氮浓度为 13.7 mg·L-1实验组>氮浓度为 27.5
图 1 不同氮浓度下雨生红球藻CG-06藻液OD750值的变化
Fig.1 Changes in OD750 values of H. pluvialis CG-06 under
the different nitrate-nitrogen concentrations
图 2 不同氮浓度下雨生红球藻CG-06藻液
中水溶性蛋白含量变化
Fig.2 Changes in water-soluble protein contents of
H. pluvialis CG-06 grown in BBM with different
nitrate-nitrogen concentrations
图 3 不同氮浓度下雨生红球藻CG-06的光合放氧速率
Fig.3 The photosynthetic oxygen evolution rate of
H. pluvialis CG-06 under the different
nitrate-nitrogen concentrations
植物生理学报150
mg·L-1实验组>对照组, 其中氮浓度为 13.7 mg·L-1
实验组的最高, 为 9.2 mg·L-1, 是对照组的 1.44倍。氮
浓度为 13.7和 27.5 mg·L-1实验组及对照组藻液的
类胡萝卜素含量分别在第 12和 15天达到最大值。
2.3 虾青素
图 6结果表明, 不同氮浓度条件下, 雨生红球
藻培养液中虾青素产生的时间不同。缺氮实验组
由于培养基完全无氮, 胁迫程度最高, 藻液中虾青
素产生时间早, 在培养的第2天即能观察到藻液颜
色明显变为黄褐色, 显微镜下观察到藻细胞中央已
经有红色色素积累, 色素面积约占整个细胞的 1/3;
其他3个组藻液产生虾青素的时间先后顺序与培养
液中氮浓度梯度呈负相关, 氮浓度最高的对照组产
生虾青素的时间(第 9天之后)最迟。由此可见, 氮
胁迫条件对于雨生红球藻中虾青素的积累速度有较
大影响, 胁迫程度越大, 产生速度越快。
图 4 不同氮浓度下雨生红球藻CG-06的叶绿素含量(A)
和培养液中硝态氮浓度(B)的变化
Fig.4 Changes in chlorophyll content (A) of H. pluvialis CG-06
and nitrate-nitrogen concentration (B) in culture medium
under the different nitrate-nitrogen concentrations
图 5 不同氮浓度对雨生红球藻CG-06
总类胡萝卜素含量的影响
Fig.5 Effects of different nitrate-nitrogen concentrations on
the total carotenoid content of H. pluvialis CG-06
各实验组的虾青素积累量均随着培养时间的
不断延长而增加, 缺氮和氮浓度为13.7实验组藻液
虾青素含量相近, 明显高于其他 2个组。藻液虾青
素增加速度于大约第 12天开始趋于稳定, 第 17天
时测得的虾青素含量有所下降, 可能是由于此时的
细胞壁加厚, 简单的溶剂萃取已经不能对色素进行
完全的萃取, 测定得到的色素含量并非藻细胞中色
素实际含量的全部。同时, 对该天各处理组藻细胞
图 6 不同氮浓度下雨生红球藻CG-06
中虾青素含量的动态变化
Fig.6 Changes in astaxanthin contents of H. pluvialis
CG-06 with time-course under the different
nitrate-nitrogen concentrations
杨瑾等: 氮胁迫对雨生红球藻色素积累与抗氧化系统的影响 151
进行镜检观察到, 细胞壁均明显加厚, 鞭毛脱落, 红
色色素几乎覆盖了整个细胞, 大部分细胞已进入不
动的红色孢子时期。
3 雨生红球藻抗氧化系统的变化
在雨生红球藻培养周期中 3 种颜色细胞的
MDA含量有差异, 依次为: 褐色细胞>红色细胞>绿
色细胞(图 7-A)。细胞的抗氧化酶 SOD、CAT和
GSH-Px的活性也存在一定差异: SOD和CAT的活
性较低, 在不同细胞阶段的差异不明显; CAT和
GSH-Px活性在不同细胞阶段的变化规律相近, 红
色细胞<绿色细胞<褐色细胞; GSH-Px的活性最高,
在不同阶段的细胞中存在差异, 说明GSH-Px在雨
生红球藻抗氧化酶中起主要作用(图 7-B)。
文结果显示, 藻液吸光度值自第 12天起不再增加,
说明氮缺乏胁迫影响藻细胞的生长, 实验在完全无
氮条件下, 藻细胞仍表现有微弱生长, 表明藻细胞
自身有一定的氮储备功能, 当生长环境中氮素匮乏
时, 细胞将储备的氮释放并利用。本研究证实缺氮
对雨生红球藻的光合生理影响较大, 放氧效率显著
降低。刘建国和张京浦(2 00 0)报道雨生红球藻
CCCFA712株在缺氮条件下藻细胞大多变为红色游
动细胞, 最大光化学效率降低了 15.9%, 光合放氧
速率降低近 91.6%。本实验室对氮饥饿 8 d的藻细
胞进行的光谱分析结果(待发表资料)进一步解释了
上述现象, 即核心天线色素蛋白 CP43 (683 nm)荧
光发射峰增强, CP47 (693 nm)荧光发射峰减弱, 缺
氮条件出现明显的650 nm荧光峰。表明通过CP47
传递给反应中心的能量未能有效传递, 一部分能量
以 650 nm波长的荧光耗散, 上述结果可能与D1蛋
白降解有关。
本文结果表明雨生红球藻中虾青素的积累量
与培养液氮消耗量呈负相关, 随着培养环境中氮素
含量的减少, 虾青素的积累量明显增加, 缺氮可以
促进虾青素的合成, 这一结果与许多学者的研究结
果一致。如庄惠如等(2000)研究表明当培养体系
中氮元素的量减半时, 有利于虾青素积累; Borowitzka
等(1991)研究不同浓度KNO3对虾青素合成的影响,
结果表明, 当氮浓度为 1.38 mg·L-1时, 细胞培养至
第 10天即完全变红, 而氮浓度为 13.8 mg·L-1时, 第
38天才出现红色不动孢子, 说明缺氮有助于虾青素
的积累。
雨生红球藻的培养周期经历绿色、褐色和红
色3种类型细胞阶段, 绿色细胞阶段基本没有虾青
素合成, 细胞的抗氧化作用主要通过抗氧化酶系统
实现, 红色细胞阶段虾青素积累最多, 抗氧化酶活
性最低, 可见, 绿色细胞中以抗氧化酶体系为主要
自我保护机制, 红色细胞则以虾青素的抗氧化保护
为主, 两种机制同时存在, 但作用时间有一定的顺
序。抗氧化酶系统首先发挥作用, 当胁迫条件使得
抗氧化酶的作用难以实现时, 细胞启动虾青素的抗
氧化保护, 并最终由虾青素完成主要的细胞防御功
能。相关研究也表明, 这两种机制对环境胁迫产生
的过氧化反应均发挥作用(苏忠亮等 2009; Naguib
2000; Kobayashi 2000; Tjahjono等 1994)。另外,
讨　　论
氮素是藻类生长必需的大量元素, 是影响其生
长的重要因子。Gomez Pinchetti等(1998)的研究表
明, 缺氮条件明显影响微藻的生长, 且藻细胞中叶
绿素 a的含量和脂肪酸的组分都会发生变化。本
图 7 不同细胞类型中的MDA含量(A)和抗氧化酶活性(B)
Fig.7 MDA content (A) and antioxidant enzyme activitie (B)
in different cell types of H. pluvialis CG-06
植物生理学报152
在培养后期, 藻细胞壁加厚, 在一定程度上也避免
了环境对藻细胞的伤害。
细胞在不同阶段抗氧化酶活性与细胞的过氧
化状况以及其他抗氧化反应有关, 绿色细胞生理状
况良好, 过氧化程度最低, 但此时的细胞尚未有虾
青素合成, 所以抗氧化酶的活性相对较高。雨生红
球藻褐色细胞是由绿色游动细胞向红色不动细胞
(孢子)的过渡阶段, 此时细胞生长开始受到环境胁
迫, 生理状况下降, 过氧化程度最高, 而褐色细胞中
虽有虾青素开始积累, 但量少, 对细胞的抗氧化作
用不大, 因此细胞的抗氧化酶活性最高, 表明此时
的细胞正处于不同抗氧化保护机制的转换期, 对过
氧化的防御尚未发挥最大作用。红色细胞的过氧
化程度虽高于绿色细胞, 但总体上维持在一个相对
较低的水平, 此时细胞的抗氧化酶活性最低, 其原
因一方面表明在绿色细胞阶段抗氧化酶系统发挥主
要作用, 另一方面也证实红色细胞阶段大量合成积
累的抗氧化物质虾青素, 已发挥主要防御功能。
雨生红球藻在缺氮逆境中保护机制与类胡萝
卜素的积累有密切关系, 细胞在不同生理阶段, 存
在着抗氧化酶和虾青素两种保护机制, 两者协同作
用。低氮胁迫能够诱导细胞启动虾青素保护机制,
但这两种机制间的相互转化过程尚待进一步研究。
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