全 文 ：植物生理学通讯 第 46 卷 第 7 期, 2010 年 7 月 701
收稿 2010-04-23 修定 　2010-05-14
资助 珠海市科技重大项目(PB2 004 10 18 )。
* 通讯作者(E-mail: tiger@jnu.edu.cn; Tel: 020-85224366)。
不同理化因子对雨生红球藻CG-11碳酸酐酶活性的影响
王铭, 桑敏, 李爱芬 *, 张成武, 杨扬
暨南大学水生生物研究中心, 广州 510632

提要: 以雨生红球藻 CG-11为实验藻株, 探讨在不同CO2、HCO3-、Zn2+浓度以及 pH和氮磷比例条件下, 藻细胞的碳酸酐
酶活性对这些理化因子的响应。结果表明, 通入空气实验组的碳酸酐酶活性最高, 为(75.20±1.53) U·mg-1 (Chl a), 通入 5%
CO2条件下的碳酸酐酶活性为(9.96±1.43) U·mg-1 (Chl a); 高浓度HCO3-对碳酸酐酶活性亦具有明显抑制作用, 培养液中可溶
性无机碳的浓度与碳酸酐酶活性呈负相关; 在实验设置的 pH范围内, pH 9.0时碳酸酐酶活性最高, 为(62.32±3.25) U·mg-1
(Chl a); 适当的氮磷比与Zn2+浓度显著提高了雨生红球藻CG-11的生长速率, 碳酸酐酶的活性亦有明显提高。
关键词: 雨生红球藻; 碳酸酐酶活性; 理化因子
Effects of Physical and Chemical Factors on Carbonic Anhydrase Activity of
Haematococcus pluvialis CG-11
WANG Ming, SANG Min, LI Ai-Fen*, ZHANG Cheng-Wu, YANG Yang
Institute of Hydrobiology, Jinan University, Guangzhou 510632, China
Abstract: The strain Haematococcus pluvialis CG-11 was used to explore the effects of different concentra-
tions of CO2, HCO3-, Zn2+, pH and the ratio of nitrogen and phosphorus on the carbonic anhydrase activity. The
results showed that only supplying compressed air for mixing, the maximum carbonic anhydrase activity can
reach (75.20±1.53) U·mg-1 (Chl a), but providing compressed air enriched with 5% CO2 for mixing, carbonic
anhydrase activity was only (9.96±1.43) U·mg-1 (Chl a). High concentration of HCO3- also inhibited the carbonic
anhydrase activity, and the concentration of total inorganic carbon in culture medium and carbon anhydrase
activity was negatively correlated. The maximum carbonic anhydrase activity was (62.32±3.25) U·mg-1 (Chl a),
that was obtained at pH 9.0 in the range of experiments. The appropriate ratio of nitrogen and phosphorus and
the concentration of Zn2+ could significantly increase the growth rate of H. pluvialis CG-11, and carbonic
anhydrase activity was also improved significantly.
Key words: Haematococcus pluvialis, carbonic anhydrase activity, physical and chemical factors
CO2的固定是光合作用制造有机物的重要步骤
之一, 水体可溶性CO2远低于藻类正常光合作用所
需量, 在长期的进化过程中, 藻类形成了一整套机
制, 以应对水体可溶性CO2不足带来的光合限制问
题, 即出现了二氧化碳浓缩机制(CO2-concentrating
mechanism, CCM), 而其中碳酸酐酶扮演着重要的
角色(Spalding等 1983; Moroney等 1985; 邱保胜和
高坤山 2001)。
碳酸酐酶(carbonic anhydrase, CA)是一种含有
锌离子的金属酶, 广泛存在于各类生物体中。微藻
的碳酸酐酶主要参与介导 CO2 和 HCO3- 的可逆反
应, 维持这两种可溶性无机碳形式在溶液中的平
衡。有关真核微藻碳酸酐酶的研究工作, 一直是真
核藻类CCM研究的热点之一。对真核微藻碳酸酐
酶的存在及其功能的研究表明, 碳酸酐酶的存在已
成为判断真核微藻存在CCM的标志之一(Karlsson
等1998; Eriksson等1998; Villarejo等1998; Moroney
和 Somanchi 1999)。
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种淡
水单细胞绿藻, 生长周期的红色细胞阶段能大量
积累虾青素, 含量可高达细胞干重的 6.0% 以上
(Borowitzka 等 1991), 因而成为生产天然虾青素的
理想材料。本实验室开展了对于雨生红球藻培养
及其虾青素积累等方面的研究工作(刘健晖和李爱
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芬 2006; 董祎婷 2007), 并对 H. pluvialis CG-11 藻
株的光合作用特性进行了初步探讨(王铭等2009)。
本实验以 H. pluvialis CG-11 为材料, 研究了不同
CO2、HCO3-、Zn2+ 浓度以及不同 pH 和氮磷比例
对 H. pluvialis CG-11 碳酸酐酶活性的影响, 探讨
不同理化因子提高 H. pluvialis CG-11 碳酸酐酶活
性的条件 , 旨在为进一步阐明碳酸酐酶在 H .
pluvialis CCM中的作用机制, 并为雨生红球藻规模
化生产中的CO2添加方式和途径, 以及对可能存在
的无机碳源利用相关的环境因子提供理论指导。
材料与方法
雨生红球藻(Haematococcus pluvialis Flotow.
CG-11)由暨南大学水生生物研究中心藻种室提供。
以BBM培养基作为基础培养基, 光照培养箱温度为
(24±0.5) ℃, 光照强度为 90 μmol·m-2·s-1, 光周期为
12 h:12 h。培养至指数生长末期的H. pluvialis CG-
11于 4 000×g离心 3 min去上清, 收集藻泥, 重悬浮
于新鲜的 BBM 培养基中, 用于后续实验。
将培养的新鲜藻液, 设置如下实验: (1)分别通
入不同浓度的CO2气体, 设置CO2与空气的比例为
0.5%、1%和 5%, 以通入普通空气作为对照组; (2)
在BBM培养基中加入不同浓度的NaHCO3, 使培养
基中 H C O 3 - 的浓度分别为 1、2、5、1 0 和 2 0
μmol·L-1, 不加 HCO3- 的作为对照组; (3)使用 0.1
mol·L-1 的 HCl 或 NaOH 调节培养基的 pH 值, 使得
BBM 培养基的 pH 值分别为 7.0、7.5、8.0、8.5
和9.0; (4)以原始BBM培养基中氮磷比(约为3:2)作
为对照组; 氮的量固定不变, 添加 2倍BBM培养基
的磷含量, 设置一组氮磷比为3:4的实验组; 磷的量
固定不变, 分别添加 2、3 和 6 倍BBM培养基的氮
含量, 设置氮磷比为 6:2、9:2和 18:2的实验组; (5)
将离心得到的藻泥悬浮于新鲜缺Zn2+的BBM培养
基中, 分别加入不同浓度的ZnSO4, 使BBM培养基
中的Zn2+ 浓度分别为 0、1、10、30、100 和 1 000
μmol·L-1, 原 BBM 培养基 Zn2+ 浓度(30 μmol·L-1)为
对照组。其中, 实验(1)采用 500 mL 的柱状玻璃
管培养至对数末期, 测定CA活性; 实验(3)采用500
mL 三角瓶静置培养, 接种 300 mL 藻液, 在培养过
程当中每隔 4 h 调节培养基的 pH 值, 使之维持在
实验设计的 pH (±0.05)范围内, 培养 48 h 后, 测定
CA 活性; 实验(2)、(4)和(5)采用 500 mL 三角瓶静
置培养, 按照 10% 的接种量接种 300 mL 藻液, 培
养至对数末期, 取样测定 CA 活性, 实验(4)和(5)每
2 d 测定光密度值(OD680 nm); 以上各实验组均设置
3 个平行。
碳酸酐酶活性测定根据Wilbur-Anderson量电
法(Wilbur 和 Anderson 1948), 并进行了适当修正。
取各处理条件下对数生长期的藻液 50 mL, 4 ℃,
3 000×g离心 10 min后去上清, 收集藻细胞, 使用 4
℃预冷的巴比妥钠缓冲液(pH 8.4, 20 mmol·L-1)洗
涤一次, 离心后使用 5 mL 巴比妥钠缓冲液悬浮藻
细胞, 进行冰浴超声波破碎, 超声波功率200 W, 共
作用 64 s, 每次作用时间 8 s, 间隔时间 9.9 s。在 4
℃下迅速加入 3 mL 0 ℃饱和CO2的蒸馏水至细胞
匀浆液中, 用 pH 计监测反应体系 pH 值变化, 记录
pH 值从 8.3 降到 7.0 所需的时间。碳酸酐酶活性
(U)的计算公式为: U=10×(T0/T-1), 其中 T0 为反应
体系中未加细胞时pH值下降所需的时间, T是反应
体系中加细胞破碎液时pH值下降所需的时间。同
时测定藻液叶绿素 a含量, 叶绿素含量按下列公式
计算: Chl a=(11.93×A664)-(1.93×A647) (Jeffrey 和
Humphrey 1975), 碳酸酐酶活性单位(以Chl a计)为
U·mg-1 (Chl a)。
取各处理对数生长期的藻液 30 mL, 5 000×g
离心 10 min, 取上清液至分析瓶内, 上机测定可溶
性无机碳(dissolved inorganic carbon, DIC)浓度。
使用总有机碳(总氮)分析仪(德国, Elementar), 分析
测定 DIC 的浓度。
实验数据采用 Origin 7.5 软件进行图表绘制。
实验结果
1 CO2对雨生红球藻碳酸酐酶活性的影响
不同 CO2 浓度培养条件下的碳酸酐酶活性与
培养液中 DIC 的浓度如图 1 所示。随着通入 CO2
浓度的升高, 碳酸酐酶的活性呈现出下降趋势, 通
入空气的对照组中碳酸酐酶的活性最高, 达到了
(75.20±1.53) U·mg-1 (Chl a), 而5% CO2培养条件下
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的碳酸酐酶活性仅有(9.96±1.43) U·mg-1 (Chl a)。
培养液中DIC的浓度随着CO2浓度的升高, 呈现增
加的趋势, 当 CO2 浓度为 5% 时, 溶液中 DIC 的浓
度为(47.65±1.26) mg·L-1。
验组, 测得的碳酸酐酶活性最低, 为(5.05±1.21)
U·mg-1 (Chl a)。培养液中 DIC 浓度与碳酸酐酶的
活性呈负相关, DIC 的最高浓度出现在 20 mmol·L-1
HCO3- 浓度的实验组, 其 DIC 浓度为(250.63±2.50)
mg·L- 1。
3 pH对雨生红球藻碳酸酐酶活性的影响
图3是雨生红球藻在不同pH条件下的碳酸酐
酶活性与培养液中 DIC 的浓度。培养液 pH 为 7.0
和7.5时, 碳酸酐酶的活性差别不大, 分别为(40.32±
1.72)和(40.09±2.01) U·mg-1 (Chl a), 碳酸酐酶的活
性在 pH 7.5~9.0 范围内, 随培养液 pH 的升高活性
增大, pH 9.0 时碳酸酐酶活性最高, 为(62.32±3.25)
U·mg-1 (Chl a)。培养液 DIC 浓度在 pH 为 8.0 时出
现最高值, 为(18.65±1.72) mg·L-1。
图 1 H. pluvialis CG-11 在不同 CO2 浓度条件下碳酸酐酶
活性与 DIC 浓度
Fig.1 The CA activity and DIC contents of H. pluvialis
CG-11 with different CO2 content source
图 2 H. pluvialis CG-11 在不同 HCO3- 浓度条件下的碳酸
酐酶活性与 DIC 浓度
Fig.2 The CA activity and DIC contents of H. pluvialis
CG-11 with different HCO3- content source
图 3 H. pluvialis CG-11 在不同 pH 条件下的碳酸酐酶活性
与 DIC 浓度
Fig.3 The CA activity and DIC contents of H. pluvialis
CG-11 with different pH
4 氮磷比值对雨生红球藻生长及碳酸酐酶活性的
影响
不同氮磷比条件下, 藻液的OD680变化情况如
图 4-A 所示。与对照组, 即原始 BBM 培养基中氮
磷比(3:2)相比, 低氮高磷(3:4)培养条件下, 生长至
第 4 天起, 明显低于对照组; 氮磷比为 6:2 与 9:2的
实验组藻液OD680自第4天后, 开始高于对照组; 而
氮磷比(18:2)最高的实验组藻液OD680的变化趋势与
对照组相似, 但 OD680 低于对照组。对于不同氮磷
2 HCO3-对雨生红球藻碳酸酐酶活性的影响
添加不同 HCO3- 浓度实验对碳酸酐酶活性的
影响结果(图2)表明, 高浓度的HCO3-能够抑制碳酸
酐酶的活性。对照组的碳酸酐酶的活性为(59.44±
1.02) U·mg-1 (Chl a)。20 mmol·L-1 HCO3- 浓度的实
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比实验对碳酸酐酶活性的影响结果如图 4-B, 对照
组碳酸酐酶的活性为(47.16±1.50) U·mg-1 (Chl a),
不同氮磷比(3:4、6:2、9:2 和 18:2)的实验条件下,
测得的碳酸酐酶活性分别为对照组的 7 4 . 7 %、
117.1%、128.7% 和 85.2%, 其中以氮磷比为 9:2时
的碳酸酐酶活性最高, 达到了(60.70±2.14) U·mg-1
(Chl a)。
5 Zn2+对雨生红球藻生长及碳酸酐酶活性的影响
在不同Zn2+浓度条件下测得藻液的OD680变化
如图5-A所示。与对照组, 即原始BBM培养基(Zn2+
浓度为 30 μmol·L-1)相比, 培养液 Zn2+ 浓度为 1 000
μmol·L-1条件下, 藻体生长至第4天出现白化死亡现
象; Zn2+浓度为1 μmol·L-1实验组, 生长状况始终优
于对照组; Zn2+ 浓度为10 μmol·L-1实验组的生长情
况与对照组基本相同; Zn2+ 浓度为 0 μmol·L-1 和 100
μmol·L-1两实验组藻液OD680一直低于对照; 而Zn2+
浓度为100 μmol·L-1实验组从第8天起藻液OD680开
始高于缺 Zn2+ 实验组。不同 Zn2+ 浓度实验对碳酸
酐酶活性的影响表明(图5-B), 对照组的碳酸酐酶的
活性为(42.86±2.14) U·mg-1 (Chl a), 而Zn2+浓度为1
μmol·L-1 时, 碳酸酐酶活性最高, 为(52.21± 1.50)
U·mg-1 (Chl a)。
图 4 H. pluvialis CG-11 在不同 N/P 条件下生长的相关参数
Fig.4 The growth parameters of H. pluvialis CG-11 with different N/P content source
A: 光密度; B: 碳酸酐酶活性。
图 5 H. pluvialis CG-11 在不同 Zn2+ 浓度下生长的相关参数
Fig.5 The growth parameters of H. pluvialis CG-11 with different Zn2+ content source
A: 光密度; B: 碳酸酐酶活性。
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讨　　论
研究证实, 无机碳对碳酸酐酶活性的影响比较
复杂, 在天然水体中HCO3-占主要形式, 对于HCO3-
离子的吸收利用碳酸酐酶发挥首要作用, 而 pH 等
环境因子对HCO3-和CO2形式的转化也影响到碳酸
酐酶活性(Villarejo等1997; 陈雄文等2000; Beardall
和 Giordano 2002; Giordano 等 2005)。H. pluvialis
CG-11不具有胞外碳酸酐酶活性(王铭 2009), 因此
HCO3- 的直接利用受到很大限制。本文的初步实
验表明, HCO3- 对H. pluvialis CG-11胞内碳酸酐酶
活性的影响不仅仅局限于其本身的作用, 添加
HCO3- 引起的培养体系 pH的改变对碳酸酐酶活性
的影响更明显。碳酸酐酶能够催化 HCO3- 脱水生
成 CO 2, 并且远远高于其自发脱水的速率。H .
pluvialis CG-11 不存在胞外碳酸酐酶, 因此, 培养
体系中游离态的HCO3-不能有效地转化为藻体可直
接利用的 CO2。培养液添加 HCO3- 后, H. pluvialis
CG-11细胞被诱导表达出了碳酸酐酶活性, 随着浓
度的增加, 碳酸酐酶的活性呈现明显的下降趋势, 这
是过量的 HCO3- 对 H. pluvialis CG-11 的生理状态
产生了影响, 致使 H. pluvialis CG-11 光合活性降
低, 消耗的DIC减少, 引起了碳酸酐酶活性下降(王
山杉等 2006)。培养液 pH 值在 7.0~9.0 区间主要
通过 DIC 的形态变化影响 H. pluvialis CG-11 碳酸
酐酶活性(Villarejo 等 1997; Moroney 和 Somanchi
1999; 王山杉等 2006)。
氮和磷作为大量营养元素, 对于微藻生长至关
重要。本文结果显示, 适量增加氮磷比有利于 H.
pluvialis CG-11 的生长(图 4-A)和碳酸酐酶活性的
提高(图 4-B)。因为氮磷比增加, 有利于提高 H.
pluvialis CG-11 的光合生理活性, 从而增加了培养
系统对 DIC 的需求, 诱导 H. pluvialis CG-11 表达
出更高的碳酸酐酶活性。已有研究也表明, 适当浓
度的磷限制能够提高碳酸酐酶活性(Beardall 等
2005), 增加氮浓度, 对碳酸酐酶活性亦具有促进作
用(Giordano 等 2005)。
本实验表明, 较低浓度的 Z n 2 + 有利于 H .
pluvialis CG-11的生长, Zn2+ 浓度超过一定范围后,
H. pluvialis CG-11的生长受到抑制, 藻体全部死亡
(图 5-A)。而 Ikegami 等(2005)的研究发现, 黑暗培
养的 Chlorella 叶绿体中的 Zn2+ 浓度高达 10~40
mmol·L-1, 这表明不同藻种对于 Zn2+ 浓度的耐受程
度有差异。Zn2+ 是碳酸酐酶的重要组分, 实验证
实, 适当浓度 Zn2+ 对 H. pluvialis CG-11 碳酸酐酶
的活性具有促进作用, Zn2+缺乏碳酸酐酶的活性受
到明显抑制(图 5-B)。
综上所述, 通空气培养、碳酸氢钠浓度低于 5
mmol·L-1、pH 9.0、氮磷比值为 9:2 (3 倍 BBM 基
础培养基氮含量)和锌离子浓度为 1 μmol·L-1时, 都
能提高 H. pluvialis CG-11 的碳酸酐酶活性。
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