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Study on the Optimization of Haematococcus pluvialis Wall Broken and Extraction of Astaxanthin by SEM and RSM

扫描电镜和响应面优化雨生红球藻破壁萃取虾青素的工艺研究


为了充分利用雨生红球藻这一微藻资源,研究虾青素低温抗氧化的萃取技术。本文利用扫描电镜(scanning electron microscopy,SEM)研究了雨生红球藻粉超微粉碎后细胞壁的结构变化,确认破壁的最佳条件。采用超临界CO2对其进行萃取,运用响应面法(response surface methodology,RSM)优化萃取工艺条件,并对萃取后的精油逐个进行GC-MS分析其脂肪酸成分。结果表明最佳工艺条件为:原料粒度60目,萃取压力42 MPa,萃取温度47℃,萃取时间120 min,液固比1.6,在此条件下,虾青素在藻粉中的提取率可达1.23%,在萃取物中提取率为4.84%。然后将响应面不同条件得到的萃取物进行GC-MS分析,可知当压力40MPa,温度55℃,液固比为1,不饱和脂肪酸(UFA)含量最高为155.1 mg·g-1;当压力45MPa,温度45℃,液固比为2,多不饱和脂肪(PUFA)含量最高为132.05 mg·g-1


全 文 :核 农 学 报  2014,28(6):1052 ~ 1061
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
收稿日期:2013⁃05⁃07  接受日期:2013⁃11⁃25
基金项目:国际合作项目 (S2011ZR0360)
作者简介:季晓敏,女,主要从事食品工程研究。 E⁃mail:sxczjxm@ 126. com
通讯作者:苏秀榕,女,教授, 主要从事食品科学与工程 /生化与分子生物学研究。 E⁃mail:suxiurong@ gmail. com
文章编号:1000⁃8551(2014)06⁃1052⁃10
扫描电镜和响应面优化雨生红球藻破壁
萃取虾青素的工艺研究
季晓敏1   王亚男1   徐嘉杰2   黄  健1   智姝婕1   苏秀榕1
( 1 宁波大学海洋学院,宁波 浙江  315211;2 中国农业机械化研究院,北京  10000)
摘  要:为了充分利用雨生红球藻这一微藻资源,研究虾青素低温抗氧化的萃取技术。 本文利用扫描电
镜(scanning electron microscopy,SEM)研究了雨生红球藻粉超微粉碎后细胞壁的结构变化,确认破壁的
最佳条件。 采用超临界 CO2 对其进行萃取,运用响应面法( response surface methodology,RSM)优化萃取
工艺条件,并对萃取后的精油逐个进行 GC⁃MS 分析其脂肪酸成分。 结果表明最佳工艺条件为:原料粒
度 60 目,萃取压力 42 MPa,萃取温度 47℃,萃取时间 120 min,液固比 1􀆰 6,在此条件下,虾青素在藻粉中
的提取率可达 1􀆰 23% ,在萃取物中提取率为 4􀆰 84% 。 然后将响应面不同条件得到的萃取物进行 GC⁃MS
分析,可知当压力 40MPa,温度 55℃,液固比为 1,不饱和脂肪酸(UFA)含量最高为 155􀆰 1 mg·g - 1;当压
力 45MPa,温度 45℃,液固比为 2,多不饱和脂肪(PUFA)含量最高为 132􀆰 05 mg·g - 1。
关键词:雨生红球藻;虾青素;超临界;响应曲面法;气相色谱 -质谱联用
DOI:10􀆰 11869 / j. issn. 100⁃8551􀆰 2014􀆰 06. 1052
    虾青素(Axtaxanthin),化学名称是 3, 3′ -二羟基
- 4, 4′ -二酮基 - β, β′ -胡萝卜素,分子式为 C40H52
04,是自然界中分布最广泛的一种脂溶性色素,在动植
物界中广泛存在,是一种理想的抗氧化剂和饲料添加
剂,具有很好的开发前景[1 - 2]。 近年来被食品,美容,
医药,保健界所广泛认知,寻找适合生产天然虾青素的
自然资源显得至关重要。 雨生红球藻(Haematococcus
pluvialis)是一种淡水单胞绿藻,隶属绿藻门、团藻目、
红球藻科、红球藻属,具有生长周期短、繁殖速度快、易
于培养、虾青素含量高达干重的 3% ~ 5% 、提取成本
较低等优点,所以被公认为自然界中生产虾青素最好
的生物来源[3],并已成为近年来国内外虾青素研究的
热点。
虾青素的提取方法常采用单一有机溶剂或不同比
例的混合溶剂进行提取;例如欧阳琴等[4]用氯仿,乙
醇的混合溶剂,赵立艳等[5]采用乙醇和乙酸乙酯混合
溶剂进行虾青素酯的提取;上述有些有机溶剂虽是虾
青素良好的溶剂,却很难用离心的方法将溶剂与破碎
藻细胞完全分离,对后续的生物利用安全性造成隐患。
其他提取方法还有微波提取[6]、酶法提取[7],低温研
磨萃取等,其中王灵昭等[6]通过比较微波法、低温研
磨萃取法和碱提法提取雨生红球藻中虾青素的效果,
得到微波法的虾青素提取率最高,低温研磨萃取法次
之,碱提法最低[6]。
超临界 CO2 萃取技术(SFE⁃CO2)是近 20 年来发
展起来的一种提取兼分离技术[8],超临界 CO2 流体萃
取过程是由萃取和分离过程组合而成的[9 - 10]。 由于
其工艺简单,操作低温,无溶剂残留等特点而成为天然
产物的新型工艺之一。 针对这种情况,本研究采用超
临界 CO2 萃取技术提取虾青素,在单因素实验的基础
上,采用 Box ⁃Behnken响应曲面法对影响虾青素萃取
的关键因素时间、压力、温度和夹带剂进行了初步的研
究,为更好地利用雨生红球藻,推进超临界 CO2 萃取
虾青素技术在生产上的应用,提供试验基础和参考数
据。
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  6 期 扫描电镜和响应面优化雨生红球藻破壁萃取虾青素的工艺研究
1  材料与方法
1􀆰 1  材料
雨生红球藻藻粉购自山东青岛森淼有限公司。 脂
肪酸甲酯标准品,虾青素标准品,购自美国 Sigma 公
司。
1􀆰 2  方法
1􀆰 2􀆰 1  样品前处理  雨生红球藻藻粉经过超微粉碎
(FriTSCH型,德国 FriTSCH公司)破壁,用扫描电镜(S
- 3400N,日本日立公司)来观察破壁的结果。 然后通
过 AS200 型震筛机(AS200 型,美国 Retsch 公司生产)
过 60 目筛备用。
1􀆰 2􀆰 2  雨生红球藻中虾青素的提取及含量计算  以
乙酸乙酯 /乙醇(1 / 2,v / v) 的混合液为溶剂配制成一
定浓度的虾青素标准溶液,用紫外可见分光光度计对
其在 200 ~ 600 nm 范围内进行扫描,确定该标准溶液
的最大吸收波长。 配制一系列浓度不同的虾青素标准
溶液,分别在最大吸收波长下测定吸光度,以虾青素的
质量浓度为横坐标,以吸光度为纵坐标,制作标准曲
线。 超临界萃取物稀释定容后,在最大吸收波长处测
定提取溶液的吸光度,计算提取率。
Y = M / M 1; (1)
Y1 = 100 × C × V / M1; (2)
Y2 = 100 × C × V / M; (3)
    上式中,Y(% ):雨生红球藻萃取物精油得率;M1
(μg):称量的藻粉的含量;M(μg):超临界萃取物的含
量;Y1(% ):提取率 -藻粉,指雨生红球藻中虾青素占
藻粉中的提取率;Y2(% ):提取率 -油,指雨生红球藻
中虾青素占萃取物中的提取率;C(μg·mL - 1):根据标
准曲线得出提取液中虾青素的浓度;V(mL):提取液
定容后的体积。
1􀆰 2􀆰 3  单因素及响应面试验设计  根据影响 CO2 超
临界流体萃取效果的因素,选取其中最主要的 5 个因
素进行单因素试验分析,分别为目数,夹带剂,萃取温
度、萃取压强、萃取时间,各试验指标重复 3 次。
在单因素试验的基础上,借助试验设计软件
Design Expert ( version7􀆰 0􀆰 2Trial),采用 Box⁃Behnken
响应曲面法对影响虾青素萃取的关键因素压力、温度
和夹带剂(乙醇)浓度进行优化,以提取率为响应值,
设计三因素三水平的响应面试验。
1􀆰 2􀆰 4  脂肪酸的甲酯化  将萃取物旋转蒸发浓缩后,
取适量用正己烷定溶于 10 mL 容量瓶中,吸取此溶液
2􀆰 0 mL加入 2 mol·L - 1NaOH⁃CH3OH 溶液 1 mL 进行
皂化,漩涡振荡 10 min 后 50 ℃水浴 5 min,冷却至室
温,加入 2 mol·L - 1HCl⁃CH3OH 溶液 2 mL,充分振荡
10 min,于 50 ℃水浴 5 min,进行甲酯化。 然后弃去下
层液体,再加约 2 mL 蒸馏水洗净并去除水层,用滴管
吸出正己烷层,加入无水硫酸钠脱水,进行 GC⁃MS
(Agilent 7890 气相色谱仪,美国 Agilent;M7 - 80Ei 型
质谱仪,北京普析)分析。
1􀆰 2􀆰 5  GC⁃MS分析  色谱柱:DB⁃WAX,柱长 30m,直
径 250μm,载气:氦气 (纯度 99􀆰 99% ),流速 1mL·
min - 1;进样器温度 250,升温程序:柱子初始温度
100℃,保持 5min,以 4℃·min - 1的速率升至 240℃,维
持 15min;采用不分流模式,进样量 1μL。 质谱离子源
温度 210℃,传输线温度 240℃,溶剂延迟 4min,全扫
描速度低速。
1􀆰 2􀆰 6  数据处理   单因素试验结果通过 SPSS19􀆰 0
软件单因素方差分析,响应面借助试验设计软件
Design Expert ( version7􀆰 0􀆰 2Trial),采用 Box⁃Behnken
响应曲面法对影响虾青素萃取的关键因素压力、温度
和夹带剂(乙醇)浓度进行优化。 GC⁃MS 数据采用计
算机的 NIST 质谱进行自动检索,脂肪酸的定量分析
采用外标法。
2  结果与分析
2􀆰 1  扫描电镜观察藻粉的破壁效果
将三种藻,新鲜藻(由宁波大学水产系藻种室提
供)、购买的藻粉(青岛森淼公司)和购买的经过超微
粉碎后的藻粉进行扫描电镜观察并进行比较。 如图 1
所示,可以观察到新鲜的球藻表面光滑,无凹痕,无破
裂;购买的的藻粉,之前经过破壁,低温喷雾干燥等一
系列工艺后使得藻粉变得凹凸不平,被包埋在一起;同
时观察到超微粉粹后,由于物料通过高能的摩擦力和
撞击力实现样品的粉碎,可快速将样品研磨破裂,从而
达到破壁的目的。 通过比较破壁前后的得率,得到当
温度在 45℃,压力 40Mpa,时间 2h,未破壁时雨生红球
藻的得率为 8% ,破壁后得率为 15% ,破壁是必要的。
2􀆰 2  吸收曲线与标准曲线
用以乙酸乙酯 /乙醇(1 / 2,v / v) 的混合液配制一
定浓度的虾青素标准溶液,测定在不同波长下的吸光
度(图 2)。 结果表明:虾青素最大吸收波长为 478nm。
用一系列不同浓度的虾青素标准溶液分别在 478nm
波长下测定其吸光度值并作图(图 3),得到虾青素的
标准曲线方程为 y = 0􀆰 254x - 0􀆰 006,相关系数为
0􀆰 9998,表明线性相关性良好,可用于计算虾青素的含
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核  农  学  报 28 卷
注:a:新鲜球藻; b:原料; c: 超微粉碎。
Note: a: Fresh algage; b: Crude material; c: Superfine pulverizing
图 1  雨生红球藻电镜扫描图
Fig. 1  Scanning electron micrographs of Haematococcus pluvialis
图 2  虾青素标准品的吸收曲线
Fig. 2  Standard absorption curve of astaxanthin
量。
2􀆰 3  单因素实验结果分析
从图 4 可以看出,随着时间的延长,提取率先缓慢
升高后下降。 经分析,各水平间目数(图 4⁃C)一直上
升直到 60 目达到最大,其他因素通过 spss19􀆰 0 软件单
因素方差分析,除了时间(图 4⁃A)对虾青素占藻粉中
的提取率的影响不显著(P > 0􀆰 05),其他因素压力
(图 4⁃B)、夹带剂(图 4⁃D)与温度(图 4⁃E)结果相似,
均对提取率影响显著(P < 0􀆰 05)。 因此最终选择温
度,压力,夹带剂的比例作为响应面方法优化的主要因
素。
由图 4 可知,时间达到 120min 达到最大值,压力
达到 40MPa,夹带剂液固比为 1􀆰 5,温度达到 45℃时,
图 3  虾青素标准溶液在 478nm波长下的吸光度
Fig. 3  Standard absorbency of astaxanthin
in 478nm wavelength
提取率达到最大值;各因素对不同的提取率的影响结
果类似(图 5、图 6),均在以上几点达到最大值。
2􀆰 4  响应面结果分析
通过以上单因素分析,以虾青素占藻粉中的提取
率 Y1 和虾青素占萃取物的提取率和 Y2 为指标,最终
选择显著影响提取率的温度、压力、夹带剂比例作为响
应面方法优化的主要因素。 这 3 个因素分别用压力
(A)、温度(B)、液固比(C)来表示,采用 Design expert
7􀆰 0 软件设计 15 组试验,结果见表 1。
2􀆰 4􀆰 1  模型建立和显著性分析  根据表 1 的结果,分
别以提取率 -藻粉和提取率 -油为响应值对数据进行
多元回归拟合,得到回归方程:
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  6 期 扫描电镜和响应面优化雨生红球藻破壁萃取虾青素的工艺研究
表 1  响应面设计方案和实验结果
Table 1  Design program and experimental results of RSM
试验号
Code
A:压力
Pressure / MPa
B:温度
Temperature / ℃
C:液固比
liquid⁃solid ratio / (mL·g - 1)
提取率 -藻粉 Y1
Extraction yield (asx / algae) / %
提取率 -油 Y2
Extraction yield (asx / extract) / %
1 35 35 1􀆰 5 0􀆰 60 2􀆰 94
2 45 35 1􀆰 5 0􀆰 95 3􀆰 92
3 35 55 1􀆰 5 0􀆰 75 3􀆰 12
4 45 55 1􀆰 5 1􀆰 05 4􀆰 21
5 35 45 1 0􀆰 50 2􀆰 86
6 45 45 1 0􀆰 80 3􀆰 82
7 35 45 2 0􀆰 70 3􀆰 05
8 45 45 2 0􀆰 90 3􀆰 90
9 40 35 1 0􀆰 85 3􀆰 85
10 40 55 1 0􀆰 95 3􀆰 96
11 40 35 2 1􀆰 02 4􀆰 12
12 40 55 2 1􀆰 10 4􀆰 23
13 40 45 1􀆰 5 1􀆰 23 4􀆰 94
14 40 45 1􀆰 5 1􀆰 18 4􀆰 70
15 40 45 1􀆰 5 1􀆰 20 4􀆰 84
图 4  各因素对虾青素占藻粉提取率的影响
Fig. 4  Extraction yield of the various factors of astaxanthin (astaxanthin / algae)
    Y1 = - 23􀆰 888 + 1􀆰 040333A + 0􀆰 06775B - 2􀆰 595C
- 0􀆰 00025AB - 0􀆰 01AC - 0􀆰 0133BC - 0􀆰 01232A2 -
0􀆰 00058B2 - 0􀆰 68167C2
    Y2 = - 71􀆰 30604 + 3􀆰 14742A + 0􀆰 27763B +
6􀆰 20250C + 0􀆰 00055AB - 0􀆰 011AC - 0􀆰 0133BC -
0􀆰 03823A2 - 0􀆰 00323B2 - 1􀆰 85333C2
根据表 2,对回归方程进行显著性分析,提取率 -
藻粉的回归方程的显著性检验 P = 0􀆰 0021 ( P <
0􀆰 05),提取率 -油回归方程的显著性检验 P = 0􀆰 0011
(P < 0􀆰 05),说明虾青素在藻粉中和油中回归模型的
预测值均与实际值非常吻合,模型显著;模型失拟项表
示模型预测值与实际值不拟合的概率[11],提取率 -藻
粉回归方程的失拟项检验 P = 0􀆰 3998(P > 0􀆰 05),提
取率 - 油回归方程的失拟项检验 P = 0􀆰 6818 (P >
0􀆰 05),说明两个方程对实验的拟合度均较好,所选二
次回归模型有效,可用这两个模型分析和预测实验数
据。 三个因素的效应影响大小为压力 >液固比 >温
度。
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表 2  RSM分析实验结果方差分析表
Table 2  Variance analysis of experimental results
方差来源
Source
F值
F value
P值
P vaule
备注
Note
方差来源
Source
F值
F value
P值
P vaule
备注
Note
Y1 84􀆰 87 0􀆰 0021 ∗∗ Y2 62􀆰 47 0􀆰 0011 ∗∗
A 188􀆰 2116 < 0􀆰 0001 ∗∗ A 172􀆰 83 < 0􀆰 0001 ∗∗
B 28􀆰 81879 0􀆰 0030 ∗∗ B 5􀆰 474 0􀆰 0666
C 51􀆰 2334 0􀆰 0008 ∗∗ C 7􀆰 53 0􀆰 0466 ∗
AB 0􀆰 711575 0􀆰 4374 AB 0􀆰 28 0􀆰 6205
AC 2􀆰 8463 0􀆰 1524 AC 0􀆰 28 0􀆰 6275
BC 0􀆰 0000 0􀆰 54 BC 1􀆰 610415 0􀆰 245
A2 398􀆰 5703 < 0􀆰 0001 ∗∗ A2 309􀆰 81 < 0􀆰 0001 ∗∗
B2 14􀆰 1008 0􀆰 0132 ∗ B2 0􀆰 991226 0􀆰 0019 ∗∗
C2 122􀆰 0851 0􀆰 0001 ∗ C2 7􀆰 291588 0􀆰 004 ∗∗
失逆误差 1􀆰 64 0􀆰 3998 失逆误差 0􀆰 58 0􀆰 6818
相关系数 0􀆰 9935 相关系数 0􀆰 9912
    注:“∗”表示显著,“∗∗”表示极显著。
Note: “∗”indicates significant, “∗∗” indicates highly significant.
图 5  各因素对虾青素占萃取物中提取率的影响
Fig. 5  Extraction yield of the various factors of astaxanthin (astaxanthin / extract)
2􀆰 4􀆰 2  响应面交互作用分析与优化  通过三维图可
对任何两因素的交互影响及各因素对响应值的影响进
行分析和评价[12 - 13],并从中确定最佳因素水平范
围[14]。 图 7 ~图 9 分别表示了压力和温度、液固比和
压力、液固比和温度三组因素对提取率的影响。 RSM
三维图形的坡度大小反应了响应值对于所处条件的敏
感程度[15],本试验响应面曲面坡度陡峭,表明提取率
受各因素的影响大。 另外,通过 RSM三维图投影的等
高线图的形状则可以直观地反映两因素交互作用的强
弱,椭圆形表示交互作用显著,越接近圆形表示两因素
交互作用越弱[16 - 17]。 图 7 ~图 9 呈椭圆形,说明各图
中两因素交互作用明显,图 8 近似为圆形[18],说明压
力和液固比的交互作用不显著。
通过软件分析、计算,得到一组最优条件:压力为
41􀆰 9MPa,温度为 47􀆰 49℃,液固比为 1􀆰 58;在此条件
下,得到的提取率 -藻粉为 1􀆰 24,提取率 -油为 4􀆰 89。
由于实际条件的限制,设置压力为 42MPa,温度为
47℃,液固比为 1􀆰 6,为了检验响应面法的可靠性,采
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  6 期 扫描电镜和响应面优化雨生红球藻破壁萃取虾青素的工艺研究
图 6  各因素对萃取物占藻粉得率的影响
Fig. 6  Extraction yield of the various factors of Haematococcus pluvialis (extract / algae )
图 7  压力和温度对虾青素占藻粉和油中提取率的影响
Fig. 7  Response surface for the extraction yield of astaxanthin(algae and extract) by pressure and temperature
用上述优化条件进行试验,得到的提取率 - 藻粉为
1􀆰 23% ,提取率 -油为 4􀆰 84% ,与理论值基本相符。
2􀆰 5  萃取物中脂肪酸组成的气质联用分析
雨生红球藻萃取物经过 GC⁃MS分析后,响应面不
同条件下雨生红球藻脂肪酸的组成及含量见表 3,图
中响应面 13 组条件中脂肪酸含量最高的用加粗数字
代表,此含量是指超临界萃取物中脂肪酸的含量,共鉴
定出 23 种脂肪酸,以第 13 组试验为例,其中饱和脂肪
酸 ( SFA ) 占 28􀆰 30% , 不饱和脂肪酸 ( UFA ) 占
71􀆰 70% ,主要有 C18:1,C18:2,C18:2 trans,C18:3n3,
C20:5n3,单不饱和脂肪(MUFA)占 9􀆰 93% ,多不饱和
脂肪(PUFA)占 61􀆰 78% ,同时分析藻类中的脂肪酸发
现不饱和脂肪酸主要为油酸,亚油酸和亚麻酸,占总的
脂肪酸含量的 61􀆰 73% 。 ω - 3(C18:3n3)对人体健康
有益的作用,如预防癌症,心血管疾病和高血压病[19];
从图中还可得知,不饱和脂肪酸(UFA)含量最高的是
第 10 组(表 3),可知当压力 40MPa,温度 55℃,液固比
为 1 时,不饱和脂肪酸(UFA)含量最高为 155􀆰 1mg·
g - 1;多不饱和脂肪(PUFA)含量最高的是第 8 组(表
3),当压力 45MPa,温度 45℃,液固比为 2 时,多不饱
和脂肪(PUFA)含量最高为 132􀆰 05mg·g - 1。 因此可以
根据实际需要得到所需的条件。
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表 3  响应面不同条件下脂肪酸在超临界萃取物中的含量
Table 3  Fatty acid composition in the lipids extracted from Scf⁃CO2 under different conditions / (mg·g -1)
化合物名称 Name 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
C14:0 1􀆰 00 1􀆰 20 1􀆰 00 1􀆰 00 0􀆰 90 1􀆰 05 1􀆰 55 1􀆰 65 1􀆰 25 1􀆰 75 1􀆰 10 1􀆰 25 1􀆰 35
C14:1 1􀆰 20 0􀆰 90 0􀆰 85 0􀆰 85 0􀆰 70 0􀆰 95 1􀆰 30 1􀆰 25 1􀆰 00 1􀆰 35 0􀆰 95 0􀆰 95 1􀆰 20
C15:0 0􀆰 35 0􀆰 25 0􀆰 25 0􀆰 25 0􀆰 35 0􀆰 30 0􀆰 45 0􀆰 45 0􀆰 45 0􀆰 55 0􀆰 40 0􀆰 35 0􀆰 50
C16:0 28􀆰 45 24􀆰 15 19􀆰 10 19􀆰 50 17􀆰 55 24􀆰 30 36􀆰 35 37􀆰 40 26􀆰 15 35􀆰 10 24􀆰 00 25􀆰 70 29􀆰 40
C16:1 1􀆰 30 1􀆰 30 1􀆰 10 1􀆰 05 0􀆰 95 1􀆰 05 1􀆰 60 1􀆰 50 1􀆰 35 1􀆰 70 1􀆰 20 1􀆰 20 1􀆰 45
C17:0 9􀆰 00 7􀆰 90 7􀆰 55 6􀆰 35 6􀆰 40 5􀆰 90 7􀆰 85 7􀆰 30 7􀆰 20 7􀆰 80 6􀆰 60 6􀆰 35 8􀆰 45
C17:1 3􀆰 40 2􀆰 95 2􀆰 40 2􀆰 60 2􀆰 25 2􀆰 95 4􀆰 30 4􀆰 20 3􀆰 50 4􀆰 30 2􀆰 80 3􀆰 10 3􀆰 65
C18:0 8􀆰 40 5􀆰 45 3􀆰 25 2􀆰 85 2􀆰 65 3􀆰 15 4􀆰 45 4􀆰 30 3􀆰 75 5􀆰 95 5􀆰 60 5􀆰 00 6􀆰 05
C18:1 9􀆰 90 7􀆰 25 6􀆰 45 6􀆰 90 6􀆰 20 7􀆰 80 11􀆰 80 11􀆰 95 9􀆰 20 11􀆰 30 7􀆰 20 7􀆰 70 9􀆰 15
C18:2 29􀆰 95 26􀆰 60 21􀆰 65 23􀆰 60 20􀆰 85 26􀆰 15 38􀆰 65 40􀆰 30 29􀆰 70 38􀆰 50 25􀆰 10 25􀆰 70 31􀆰 10
C18:2 trans 30􀆰 00 26􀆰 65 21􀆰 70 23􀆰 60 20􀆰 85 26􀆰 15 38􀆰 65 40􀆰 25 29􀆰 70 38􀆰 45 25􀆰 10 25􀆰 70 31􀆰 10
C18:3N6 2􀆰 25 1􀆰 75 1􀆰 45 1􀆰 65 1􀆰 30 1􀆰 65 2􀆰 40 2􀆰 25 2􀆰 05 2􀆰 35 1􀆰 80 1􀆰 70 2􀆰 15
C18:3N3 32􀆰 70 24􀆰 90 20􀆰 55 20􀆰 90 19􀆰 80 24􀆰 70 36􀆰 40 38􀆰 05 29􀆰 35 37􀆰 90 24􀆰 10 25􀆰 20 30􀆰 85
C20:0 - 0􀆰 15 - 0􀆰 15 - 0􀆰 05 0􀆰 05 0􀆰 00 0􀆰 35 0􀆰 60 0􀆰 60 0􀆰 30 0􀆰 55 0􀆰 20 0􀆰 25 0􀆰 25
C20:1 0􀆰 45 0􀆰 35 0􀆰 45 0􀆰 50 0􀆰 40 0􀆰 80 1􀆰 25 1􀆰 20 0􀆰 85 1􀆰 20 0􀆰 65 0􀆰 70 0􀆰 85
C20:2 1􀆰 15 0􀆰 75 0􀆰 55 0􀆰 65 0􀆰 50 1􀆰 00 1􀆰 45 1􀆰 45 1􀆰 00 1􀆰 30 0􀆰 90 0􀆰 85 0􀆰 95
C20:3N6 0􀆰 85 0􀆰 45 0􀆰 30 0􀆰 45 0􀆰 30 0􀆰 85 1􀆰 25 1􀆰 30 0􀆰 80 1􀆰 10 0􀆰 70 0􀆰 70 0􀆰 65
C21:0 2􀆰 05 1􀆰 50 1􀆰 35 1􀆰 25 1􀆰 15 1􀆰 55 2􀆰 20 2􀆰 15 1􀆰 70 2􀆰 05 1􀆰 55 1􀆰 50 1􀆰 75
C20:4N6 2􀆰 10 1􀆰 60 1􀆰 40 1􀆰 30 1􀆰 20 1􀆰 60 2􀆰 25 2􀆰 20 1􀆰 75 2􀆰 10 1􀆰 60 1􀆰 55 1􀆰 85
C20:3N3 1􀆰 40 1􀆰 00 0􀆰 80 0􀆰 85 0􀆰 70 1􀆰 15 1􀆰 70 1􀆰 70 1􀆰 25 1􀆰 55 1􀆰 10 1􀆰 05 1􀆰 20
C20:5N3 3􀆰 80 2􀆰 80 2􀆰 10 2􀆰 35 2􀆰 35 2􀆰 80 3􀆰 85 4􀆰 55 3􀆰 50 5􀆰 25 3􀆰 35 3􀆰 30 4􀆰 40
C22:0 - 0􀆰 15 - 0􀆰 15 - 0􀆰 30 - 0􀆰 05 - 0􀆰 25 - 0􀆰 20 0􀆰 15 0􀆰 60 - 0􀆰 25 5􀆰 25 - 0􀆰 05 0􀆰 05 - 0􀆰 05
C22:1N9 0􀆰 40 0􀆰 30 0􀆰 10 0􀆰 30 0􀆰 10 0􀆰 15 0􀆰 65 1􀆰 15 0􀆰 10 6􀆰 75 0􀆰 35 0􀆰 45 0􀆰 45
SFA 49􀆰 10 40􀆰 30 32􀆰 45 31􀆰 25 29􀆰 00 36􀆰 60 53􀆰 45 53􀆰 85 40􀆰 80 53􀆰 75 39􀆰 45 40􀆰 40 47􀆰 75
UFA 120􀆰 85 99􀆰 55 81􀆰 85 87􀆰 55 78􀆰 45 99􀆰 75 147􀆰 50 153􀆰 30 115􀆰 10 155􀆰 10 96􀆰 90 99􀆰 85 121􀆰 00
MUFA 16􀆰 65 13􀆰 05 11􀆰 35 12􀆰 20 10􀆰 60 13􀆰 70 20􀆰 90 21􀆰 25 16􀆰 00 26􀆰 60 13􀆰 15 14􀆰 10 16􀆰 75
PUFA 104􀆰 20 86􀆰 50 70􀆰 50 75􀆰 35 67􀆰 85 86􀆰 05 126􀆰 60 132􀆰 05 99􀆰 10 128􀆰 50 83􀆰 75 85􀆰 75 104􀆰 25
TOTAL 169􀆰 95 139􀆰 85 114􀆰 30 118􀆰 80 107􀆰 45 136􀆰 35 200􀆰 95 207􀆰 15 155􀆰 90 208􀆰 85 136􀆰 35 140􀆰 25 168􀆰 75
SFA% 28􀆰 89 28􀆰 82 28􀆰 39 26􀆰 30 26􀆰 99 26􀆰 84 26􀆰 60 26􀆰 00 26􀆰 17 25􀆰 74 28􀆰 93 28􀆰 81 28􀆰 30
UFA % 71􀆰 11 71􀆰 18 71􀆰 61 73􀆰 70 73􀆰 01 73􀆰 16 73􀆰 40 74􀆰 00 73􀆰 83 74􀆰 26 71􀆰 07 71􀆰 19 71􀆰 70
MUFA % 9􀆰 80 9􀆰 33 9􀆰 93 10􀆰 27 9􀆰 87 10􀆰 05 10􀆰 40 10􀆰 26 10􀆰 26 12􀆰 74 9􀆰 64 10􀆰 05 9􀆰 93
PUFA % 61􀆰 31 61􀆰 85 61􀆰 68 63􀆰 43 63􀆰 15 63􀆰 11 63􀆰 00 63􀆰 75 63􀆰 57 61􀆰 53 61􀆰 42 61􀆰 14 61􀆰 78
3  讨论
雨生红球藻的厚壁孢子具有坚韧的细胞壁,阻碍
有机溶剂进入细胞内提取虾青素[20 - 21]。 因此在虾青
素提取前必须进行破壁处理。 对以上研究发现,当温
度在 45℃,压力 40Mpa,时间为 2h,未破壁时雨生红球
藻的得率为 8% ,破壁后得率为 15% ,得出破壁是必要
的。 这与陈兴才等[20]和周湘池等[22]的结论是一致
的。
夹带剂的作用有增加被分离组分在超临界流体中
的溶解度,提高溶质的选择性,增加溶质溶解度对温
度、压力的敏感程度;改变溶剂的临界参数[23]。 本研
究中无夹带剂时虾青素在藻粉的提取率为 0􀆰 53% ,加
入夹带剂后变为 1􀆰 24% ,大大提高了提取率。 这与钟
玲等[24]的结果相似。
8501
  6 期 扫描电镜和响应面优化雨生红球藻破壁萃取虾青素的工艺研究
图 8  液固比和压力对虾青素占藻粉和油中提取率的影响
Fig. 8  Response surface for the extraction yield of astaxanthin(algae and extract) by the
ratio of liquid to solid and pressure
图 9  液固比和温度对虾青素占藻粉和油中提取率的影响
Fig. 9  Response surface for the extraction yield of astaxanthin(algae and extract) by the
ratio of liquid to solid and temperature
钟玲等[24]的研究只对脂肪酸成分做了简单的概
括,只鉴定出 5 种脂肪酸,本文详细的对藻粉中的脂肪
酸进行定性和定量分析,共鉴定出 23 种脂肪酸,与钟
玲结果差异较大,其主要原因可能与提取方法条件不
同有关。 同时分析了响应面不同条件的脂肪酸含量,
不饱和脂肪酸 ( UFA) 占 71􀆰 70% ,单不饱和脂肪
(MUFA)占 9􀆰 93% ,多不饱和脂肪(PUFA)61􀆰 78% ,其
中多不饱和脂肪(PUFA)含量最高的是第 8 组,不饱
和脂肪酸(UFA)含量最高的是第 10 组,因此可以根据
实际需要得到所需的条件。
4  结论
经过超微粉粹法破壁后的藻粉,用设计软件
Design expert,采用 Box⁃Behnken 试验设计进行超临界
实验,得出最佳条件为:压力为 42MPa,温度为 47℃,
液固比为 1􀆰 6,其中各因素的影响顺序为压力 > 液固
比 > 温度,得到的提取率 -藻粉为 1􀆰 23% ,提取率 -
9501
核  农  学  报 28 卷
油为 4􀆰 84% 。 通过对响应面不同的条件得到的萃取
物进行 GC⁃MS分析,共鉴定出 23 种脂肪酸,其中饱和
脂肪酸 ( SFA)占 28􀆰 30% ,不饱和脂肪酸 ( UFA)占
71􀆰 70% ,不同条件的脂肪酸含量有差别,可以根据实
际需要选则;同时,精油中含有种类丰富的不饱和脂肪
酸,和虾青素具有协同抗氧化作用。
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0601
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2014,28(6):1052 ~ 1061
Study on the Optimization of Haematococcus pluvialis Wall
Broken and Extraction of Astaxanthin by SEM and RSM
JI Xiao⁃min1   WANG Ya⁃nan1   XU Jia⁃jie2   HUANG Jian1   ZHI Shu⁃jie  SU Xiu⁃rong1
( 1School of Marine Science,Ningbo University,Ningbo Zhejiang  315211;
2Chinese Academy of Agricultural Mechanization Sciences, Beijing 10000)
Abstract:In order to make full use of Haematococcus pluvialis, antioxidant extraction technology of axtaxanthin in low
temperature was studied. By using the scanning electron microscopy ( SEM), this study investigated the structural
changes in the cell wall after the superfine grinding of Haematococcus pluvialis and determined optimal conditions of
destroying the cell wall. Super⁃critical CO2 extraction of astaxanthin was optimized by response surface methodology
(RSM). The essential oil were identified by GC⁃MS. The optimal extraction conditions were as follows: the particle size
for 60 screen mesh, liquid⁃solid ratio 1􀆰 6, pressure 42MPa, temperature 47℃, extracting time 120min. under those
conditions, the extraction yield of astaxanthin from algae was 1􀆰 23% , from the extract was 4􀆰 84% . GC⁃MS analysis of
essential oil indicated that the content of unsaturated fatty acids (UFA) reached the maximum value of 155􀆰 1 mg·g - 1
under the extraction conditions: liquid⁃solid ratio was 1, pressure 40MPa, temperature 55℃ . Meanwhile, under
conditions of liquid⁃solid ratio as 2, pressure 45MPa, temperature 45℃, the content of Polyunsaturated fatty acids
(PUFA) reached maximum value of 132􀆰 05 mg·g - 1 .
Key words:Haematococcus pluvialis;Astaxanthin;Super⁃critical;Response surface methodology;GC⁃MS
1601