全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (8): 778~786778
收稿 2013-06-28 修定 2013-07-21
资助 江苏省大学生实践创新训练计划项目(2012JSSPITP1409)。
* 通讯作者(E-mail: qqliu@yzu.edu.cn; Tel: 0514-87996648)。
T-DNA插入水稻OsGUN4基因导致淡黄叶突变
陈盛杰, 刘巧泉*
扬州大学农学院教育部植物功能基因组学重点实验室, 江苏扬州225009
摘要: 从籼稻‘龙特甫B’来源的转基因后代中筛选获得一份淡黄叶突变体ygl-11, 并对其进行了遗传分析和基因克隆研究。
遗传分析表明, 该淡黄叶突变性状受1对隐性核基因控制, 并且与导入的T-DNA标签共分离。采用T-DNA标签的方法, 从淡
黄叶突变体植株中克隆了T-DNA插入位点的侧翼序列; 序列分析表明T-DNA插入在水稻第11染色体OsGUN4基因5非翻译
区–103 bp处。RT-PCR分析结果表明, 突变体植株叶片中OsGUN4基因不表达; 定量RT-PCR结果显示该基因在幼嫩的绿色
叶片组织中表达量最高, 在根和种子等组织中的表达极低。
关键词: 水稻; 淡黄叶突变体; 叶绿素; OsGUN4基因; T-DNA标签
T-DNA Tagging of the OsGUN4 Gene Resulted in the Yellow-Green Leaf Muta-
tion in Rice (Oryza sativa L.)
CHEN Sheng-Jie, LIU Qiao-Quan*
Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education, College of Agriculture, Yangzhou University, Yang-
zhou, Jiangsu 225009, China
Abstract: In present study, a novel yellow-green leaf mutant ygl-11 was selected from the transgenic progeny
of the indica rice cultivar ‘Longtefu B’, and its genetic behavior as well as mutated gene was carefully studied.
The leaf of the ygl-11 mutant is yellow during the whole growing periods. The mutation could be stably
inherited according to the observation of several generations. The genetic analysis results indicated that the
yellow-leaf mutation was controlled by a recessive gene and co-segregated with the integrated T-DNA in ygl-11
mutant. By using the inverse- and TAIL-PCR methods with minor modification, the flanking genomic sequence
of the T-DNA insertion was cloned from the mutant. After alignment between the cloned sequences and rice
genomic sequences, the T-DNA was identified to insert into the 5-untranslational region of the OsGUN4 gene
on chromosome 11. The result of semi-quantitative RT-PCR revealed that there was no expression of the
OsGUN4 gene in ygl-11 mutant. Real-time RT-PCR analysis showed that the OsGUN4 gene highly expresses in
green tissue of wild type rice, but very low in root and seed.
Key words: Oryza sativa L.; yellow-green leaf mutant; chlorophyll; OsGUN4 gene; T-DNA tagging
水稻是世界上近一半人口的主食, 也是我国
最重要的粮食作物之一。叶片是植物进行光合作
用的主要器官, 水稻产量的95%来自于叶片的光合
作用。叶绿素(chlorophyll, Chl)是叶片中参与光合
作用的主要色素, 其含量的高低直接影响了作物
叶片的光合效率, 而后者又是影响产量的关键因
子。研究表明叶色突变体尤其是黄化和白化等光
合色素减少的突变体往往造成作物产量的下降
(Huang等2008)。叶绿素合成缺陷突变在水稻中较
为常见, 有白化、黄化、黄绿等多种突变类型, 其
叶色变异主要与叶绿素合成受阻、叶绿体发育畸
形和质-核信号传导受阻等有关(Brusslan和Peter-
son 2002; Zhang等2011)。近年来叶色突变体的研
究价值越来越受到关注, 在水稻中已鉴定了很多
相关突变体, 这类突变体是研究光合作用机制、
培育高光效水稻和开发作物标记性状等研究的理
想材料(Kang等2012; 宋克堡和肖建平2012)。
高等植物的叶绿素包括叶绿素a (Chl a)和叶
绿素b (Chl b)两种, 其生物合成是由多基因参与的
复杂的酶促生化反应过程。从谷氨酰-tRNA (Glu-
tRNA)开始到Chl b的合成结束为止共包括16个步
骤, 共由20 多个基因编码的16种酶参与(Susek等
陈盛杰等: T-DNA插入水稻OsGUN4基因导致淡黄叶突变 779
1993), 其中任何一步酶促反应发生突变都可能导
致叶色变异。已有研究表明, 在叶绿素生物合成
过程中存在两个分支途径, 一个是合成叶绿素的
镁分支, 另一是合成亚铁血红素(heme)和光敏色素
的铁分支, 两个分支的共同底物是原卟啉IX (pro-
toporphyrin IX, Proto IX) (Brusslan和Peterson
2002)。其中镁分支途径的调控非常复杂, 一方面
原卟啉Ⅸ经镁螯合酶催化下与镁离子结合形成
Mg-原卟啉IX (Mg-protoporphyrin IX, MP), 后者经
甲基化、环化、酯化等步骤形成叶绿素a和b; 另
一方面, 原卟啉IX参与了核-质信号转导的调控
(Brusslan和Peterson 2002; Zhang等2011)。在对拟
南芥核质信号转导突变体研究中发现了一类能够
将质体的功能状态与核基因的转录状态解偶联的
突变体即细胞核基因组与质体基因组间解耦联突
变体(genomes uncoupled, gun), 与之对应的基因即
GUN基因(Susek等1993; Larkin等2003)。目前已有
6个GUN基因被鉴定克隆出来, 然而其具体参与的
信号调控网络并不清楚。研究表明, GUN4基因是
编码叶绿素合成的调控蛋白, 体外实验表明其能
够与镁离子螯合酶的底物Proto1X结合, 来激活该
酶, 从而促进MP的合成, 同时也能与MP结合, 帮助
其运输, 从而调控核基因的表达(Larkin等2003)。
然而随后的研究尚无法证明MP的积累与核基因的
表达存在关系(Mochizuki等2008)。Peter和Grimm
(2009)的研究表明在烟草中过量表达源自拟南芥
的GUN4基因能够明显提高植株的叶绿素含量。
在水稻中有关GUN基因的研究非常少, 到目前为
止还未见有相关突变体的报道。
目前叶色突变性状已在杂交稻制种中得到了
广泛的应用, 如紫叶标记、淡绿叶标记和白花转
绿等标记的应用大大降低了两系杂交种子生产的
风险和纯度鉴定成本, 充分发挥了杂交稻的增产
作用(董凤高等1995; 卢华金等2012; 宋克堡和肖建
平2012)。尽管上述叶色标记开展了一些应用, 然
而由于叶标记本身的一些不足, 或者严重影响带
有标记植株的正常发育或者标记不连续, 而无法
终生连续稳定遗传 , 最终限制了杂交制种的推
广。而淡黄叶突变标记由于其稳定的隐性遗传,
终身保持且对植株影响小等优点而在生产上应用
较多(宋克堡和肖建平2012)。目前, 育种家已利用
该标记选育了一系列的不育系用于两系杂交制种,
如‘安农标810S’、‘标泰S’和‘标88S’等(宋克堡和
肖建平2012)。因此, 开展水稻叶色突变体的遗传
定位、基因克隆及其作用机理等方面的研究, 对
于指导育种实践具有重要的参考价值。
本实验室在籼稻品种‘龙特甫B’来源的转基
因后代材料中筛选获得了一份淡黄叶突变体(yel-
low-green leaf mutant), 暂命名为ygl-11。本研究以
ygl-11突变体为实验材料, 分析了该突变性状的遗
传特性, 并利用T-DNA标签的方法克隆了导致淡
黄叶突变的OsGUN4基因, 同时研究了该基因的表
达模式, 以期为明确该基因在水稻生长发育、叶
绿素合成等过程的机理提供一定的依据。
材料与方法
1 实验材料与试剂
用于本研究的淡黄叶突变体ygl-11源自以籼
稻(Oryza sativa L. ssp indica)品种‘龙特甫B’为受体
的转基因水稻群体。转基因水稻为经农杆菌介导
培育, 用于转化的农杆菌双元载体p13dsSBE1的
T-DNA区结构如图1-A (Zhu等2012), 其中含有潮
霉素抗性基因Hyg和由水稻谷蛋白Gt1启动子控制
的反义分支酶1基因(Anti-SBE1)。ygl-11及其亲本
‘龙特甫B’于2011~2012年正季种植于扬州大学校
内实验农场。每个材料种植4行, 每行10株, 株行
距分别为4寸和5寸。土壤肥力中等, 按常规水肥
管理。
克隆载体pMD18-T、DNase I、DNA回收试
剂盒、普通DNA聚合酶、PrimeSTAR HS DNA 聚
合酶、DNA Markers购自大连宝生物公司, RNA提
取试剂盒购自北京天根公司, RevertAidTM First
Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司,
2×SYBR Green PCR Master Mix 购自美国AB (Ap-
plied Biosystems)公司, 大肠杆菌DH5α为本实验室
保存, 引物合成委托上海生工生物工程技术服务
有限公司完成。
2 实验方法
2.1 叶绿素含量测定
利用Perkin Elme公司的LAMBDA 35型分光
光度计在分蘖期分别测定突变体和对照水稻叶片
的叶绿素含量和吸收波长。
植物生理学报780
2.2 遗传分析
T1代转基因水稻群体中出现叶色分离, 调查
表现为正常绿叶植株和淡黄叶植株的比例, 同时
进行T-DNA标签共分离分析。共分离分析采用水
稻叶片潮霉素抗性离体检测与PCR相结合的方
法。叶片潮霉素抗性检测参照刘巧泉等(2001)的
方法进行 , 具体操作为从每一植株上剪取1片
0.5~1.0 cm长的绿叶片, 放入含50 mg·L-1潮霉素和
0.5 mg·L-1 6-BA的检测液中, 在26 ℃、12 h (光)/12
h (暗)的条件下培养, 3~4 d后观察结果, 叶片保持
新鲜绿色表示该植株对潮霉素表现抗性, 变枯褐
色的表示对潮霉素敏感。
2.3 水稻总DNA的PCR分析
按Murray和Thompson (1980)所述的CTAB法
提取水稻叶片总DNA, 用于PCR分析。在20 μL反
应液中混合1 μL叶片总DNA (50~100 ng)、1×反应
缓冲液、1.5 mmol·L-1 MgCl2、0.2 mmol·L
-1
dNTPs、1 μmol·L-1引物和1单位Taq DNA聚合酶
(大连宝生物)及适量水, 然后进行PCR扩增。用于
鉴定潮霉素抗性基因的引物为Hyg-1 (5 GCTT-
C T G C G G G C G AT T T G T G T 3 )和H y g - 2 ( 5
GGTCGCGGAGGCTATGGATGC 3), 扩增DNA片
段产物大小为650 bp; PCR反应程序如下: 95 ℃, 5
min; 95 ℃, 50 s, 56 ℃, 50 s, 72 ℃、40 s, 32个循环; 72
℃, 10 min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上
分离, 然后在Bio-RAD UV 1000核酸成像仪上观察。
2.4 T-DNA插入旁邻序列的扩增、克隆与序列比对
采用改良的反向P C R技术扩增突变体中
T-DNA区的侧翼序列。在T-DNA的左边界的TaqI
酶切位点与左边界序列之间设计3个巢式引物LB1
(5 TTCTAATTCCTAAAACCAAAATCCA 3)、
LB2 (5 ATTAATTCGGGCGTTAATTCA GTAC 3)
和LB3 (5 GTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTC
3) (图1-A); 同时选择潮霉素抗性基因Hyg的一段
序列(图1-B中引物Hyg-5至TaqI酶切位点间的序
列)作为反向PCR中的接头, 该接头序列3末端可通
过经限制性内切酶TaqI酶切后产生的粘性末端与
突变体总DNA经相同酶切后的产物进行连接, 最
后以该连接产物为模板, 利用接头上的一个引物
Hyg-L (5 CAAACTGTGATGGACGAC 3) (图1-B)
分别与3个巢式引物配对进行PCR扩增。
为获得接头序列, 首先利用引物Hyg-2 (同上)
和Hyg-5 (5 GCTGTTATGCGGCCATTGTC 3)、并
以突变体总DNA为模板扩增, 扩增产物再经限制
性内切酶TaqI消化。同时用TaqI酶解突变体总
DNA。采用无水乙醇沉淀和70%乙醇洗涤的方法
去除酶切产物中的杂质, 并用50 µL双蒸馏水溶解
纯化后的DNA。将经TaqI消化的接头序列与突变
体总DNA 用T4 DNA连接酶进行连接。取1 µL连
接产物进行3轮PCR扩增, 扩增条件分别为: 第一
轮, 引物: LB1和Hyg-L, 程序: 94 ℃, 4 min; 94 ℃,
45 s; 58 ℃, 1 min; 72 ℃, 45 s; 72 ℃, 2 min; 5个循
环; 94 ℃, 45 s; 45 ℃, 4 min; 72 ℃, 2 min; 94 ℃, 45
s; 58 ℃, 4 min; 72 ℃, 2 min; 94 ℃, 45 s; 58 ℃, 4
min; 72 ℃, 2 min; 94 ℃, 45 s; 48 ℃, 4 min; 72 ℃, 2
min; 12个循环; 72 ℃, 4 min, 15 ℃, 1 min。第二轮,
图1 T-DNA结构及其侧翼序列扩增示意图
Fig.1 The structure of T-DNA region and the position of the primers for amplification of flanking sequences
陈盛杰等: T-DNA插入水稻OsGUN4基因导致淡黄叶突变 781
引物: LB2和Hyg-L, 程序: 94 ℃, 4 min; 94 ℃, 45 s;
58 ℃, 4 min; 72 ℃, 2 min; 94 ℃, 45 s; 58 ℃, 4
min; 72 ℃, 2 min; 94 ℃, 45 s; 48 ℃, 4 min; 72 ℃, 2
min; 12个循环; 72 ℃; 4 min; 15 ℃, 1 min。第三
轮, 引物: LB3和Hyg-L, 程序同第二轮。PCR产物
经琼脂糖凝胶电泳和回收后连入pMD18-T载体(大
连宝生物公司), 送南京金斯瑞公司测序。测序结
果在NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进
行序列比对分析。
2.5 T-DNA突变体的鉴定
在T- D N A插入位置的两侧分别设计引物
GUN-F (5 ATGCTGACTACATTGCCACAC 3)以
及GUN-R (5 TTGTCCCTGTTGTTTGTCC 3)来鉴
定其插入位置。分别用野生型亲本(WT)和淡黄叶
突变体植株基因组DNA做模板来进行PCR反应。
2.6 OsGUN4基因的克隆与序列分析
根据预测的OsGUN4基因组序列, 设计一对引
物GUNC-F (5 ATGCTGACTACATTGCCACAC 3)
和GUNC-R (5 TTGTCCCTGTTGTTTGTCC 3), 利
用PCR技术从水稻总DNA中克隆OsGUN4基因组
全序列。PCR程序: 94 ℃, 4 min; 94 ℃, 40 s; 60 ℃,
4 min; 72 ℃, 3 min; 35个循环; 72 ℃, 10 min; 15 ℃,
1 min。所得扩增产物预计长为3 .2 kb , 连入
pMD18-T载体并测序。序列比对在NCBI网站
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行。
2.7 半定量和实时定量RT-PCR分析
利用天根公司的总RNA提取试剂盒提取水稻
不同组织总RNA, 并按照RevertAidTM First Strand
cDNA Synthesis Kit说明书合成第一链cDNA。半
定量和实时定量RT-PCR分析均以第一链cDNA为
模板, 用引物GUN4R-F (5 CATCAACCCCCA-
ACTCAC 3)和GUN4R-R (5 TTGCTCCTCTT-
CAAAGGC 3)进行扩增; 以OsActin1为内参基因,
对应引物为Actin01-F (5 CCAAGGCCAATCGTG-
AGAAGA 3)和Actin01-R (5 AATCAGTGAGATC-
ACGCCCAG 3)。半定量RT-PCR体系同总DNA的
PCR分析。荧光实时定量RT-PCR反应在96孔PCR
板中进行, 20 μL的反应体系包括: 10 μL 2×SYBR
Green PCR Master Mix (美国Applied Biosystems公
司)、5和3端引物(3 μmol·L-1)各1 μL和1 ng的第一
链cDNA模板。反应条件如下: 50 ℃, 2 min; 95 ℃,
10 min; 95 ℃, 15 s; 60 ℃, 1 min; 共40个循环。
实验结果
1 ygl-11突变体的主要表型特征
突变体ygl-11从苗期开始直至结实灌浆期的
整个生长发育过程始终保持淡黄叶色的表型(图
2)。为了比较突变体与野生型对照的光合色素的
差异, 首先对叶绿素进行了全波长扫描分析, 如图
3-A所示, ygl-11叶片光合色素吸收值在300~700
nm的范围内均极显著低于野生型对照。为进一步
定量比较两者叶绿素含量的差异, 分析了分蘖期
叶片叶绿素的含量, 结果(图3-B)表明ygl-11突变体
的叶绿素含量较对照极显著降低, 其中叶绿素a和b
的含量均有较大幅度的下降, 说明其淡黄叶性状
是由于总叶绿素的含量下降所引起的。同时ygl-
11突变体的叶绿素a/b比值明显高于对照亲本, 说
明叶绿素b的下降幅度更明显。
2 ygl-11突变性状的遗传分析
田间观察结果表明, T0代转基因植株叶色正
常, 但在T1代出现了正常绿叶与淡黄叶植株的分
离。共调查了222株个体, 其中正常叶色为167株,
淡黄叶色为55株 , 分离比符合3 :1的分离方式
(χ2=0.006, 0.75
上收获的自交种子, 种成T2代群体, 所有植株均表
现为淡黄叶, 说明该突变能稳定遗传给下一代。
为验证突变性状是否与T-DNA插入有关, 首先利
用叶片潮霉素抗性检测的方法调查了分离株系内
淡黄叶与正常叶色植株的基因型。如图4-A所示,
分离出的淡黄叶均表现为潮霉素抗性, 而正常叶
色的部分植株叶片对潮霉素敏感、部分植株叶片
表现抗性, 这说明该叶色突变可能与T-DNA插入
共分离。为了进一步验证这个结果, 选取了部分
淡黄叶植株抽提叶片DNA并且利用潮霉素抗性基
因作为目的基因, 用PCR的方法对选取的植株进行
了检测, 结果表明这些淡黄叶植株均能扩增出目
的条带(图4-B), 进一步证明该叶色突变与整合的
T-DNA共分离。
3 T-DNA插入位点边界序列的扩增与分析
采用反向PCR和TAIL-PCR相结合的技术, 从
ygl-11突变体植株基因组DNA中扩增得到了一条
植物生理学报782
图2 淡黄叶突变体ygl-11和野生型植株在分蘖期和抽穗期的表现
Fig.2 Phenotypes of ygl-11 mutant and its wild type (WT) at tillering stage and heading stage
约3 kb大小的特异片段(图5-A)。通过T/A克隆的
方式获得了该段序列并对其测序。通过将序列在
NCBI水稻数据库中比对, 发现该段序列中含有一
小段与位于水稻第11染色体的O s G U N 4基因
(Os11g0267000)的启动子区序列完全一致, 该段序
列其他碱基经比对确认为T-DNA的左边界序列。
因此, 可以确认T-DNA插入在OsGUN4基因的启动
子区(图5-B)。进一步分析, 发现插入位点位于
OsGUN4基因5非翻译区上游–103个碱基处。
为了验证插入位置, 根据NCBI数据库中粳稻
‘日本晴’中OsGUN4基因序列信息分别在T-DNA插
入位点两侧设计了引物并结合左翼序列引物LB3
(图5-B)对突变体、亲本和分离个体进行了PCR扩
增验证。如图5-C所示, 引物GUN-F/R能够在亲本
当中扩增出目的片段, 而在突变体中无法扩增; 反
之, 引物GUN-F与LB3配对则可以在突变体中扩增
出条带, 而在亲本中无法扩增出条带来。这说明
是由于T-DNA的插入而导致了上述结果的出现。
利用混合引物GUN-F/R和LB3对分离群体中的个
体进行了扩增, 结果表明淡黄叶植株均能扩增出
图3 抽穗期突变体和野生型叶片叶绿素的吸收光谱和叶绿素含量分析
Fig.3 Absorbance spectra of chlorophyll and chlorophyll content analysis from mutant and wild type at heading stage
A: 叶绿素的全波长扫描分析; B: 叶绿素含量分析。
陈盛杰等: T-DNA插入水稻OsGUN4基因导致淡黄叶突变 783
图4 叶片潮霉素抗性离体检测和总DNA的PCR分析
Fig.4 Leaf assay of hygromycin resistance and PCR amplification of target gene
A: 左边为突变体植株叶片都表现对潮霉素的抗性, 右边为杂合植株(叶色正常)后代发生分离, 部分植株叶片对潮霉素敏感。B: 利用
潮霉素抗性基因引物作PCR分析, 显示所有突变体植株均含有潮霉素抗性基因。M: DNA分子量标记DL2000; P: 含有超霉素抗性基因的
质粒对照, WT为野生型对照。
图5 T-DNA 插入突变体边界序列扩增与共分离鉴定
Fig.5 The amplification of T-DNA flanking sequence and co-segregated analysis
A: 侧翼序列扩增产物; B: T-DNA插入位置及鉴定引物位置; C: 对插入位置的鉴定; D: 利用插入位置信息进行共分离分析。M: DNA
分子量标记DL2000; WT: 野生型对照。
植物生理学报784
与突变体一致的条带(图5-D), 并且正常植株中有
部分两条带都能扩增得到, 说明这部分植株为杂
合类型, 这与前期的潮霉素抗性检测结果非常吻
合。上述结果说明获得的侧翼序列信息正确。
4 OsGUN4的克隆和表达分析
为明确籼稻‘龙特甫B’中OsGUN4基因的序列
信息 , 首先分析了已测序粳稻品种 ‘日本晴 ’中
OsGUN4的序列, 该基因只有一个外显子、不含内
含子, 编码一段包含273个氨基酸的蛋白质。基于
上述信息, 分别在5端和3端设计引物, 通过高保真
PCR扩增的方式, 获得了籼稻‘龙特甫B’来源的长
度为3 294 bp的OsGUN4基因组序列信息(图6)。通
过序列比对, 表明源自‘龙特甫B’的OsGUN4序列
在其启动子区与与粳稻‘日本晴’存在很多变异, 但
在编码区只存在一个碱基的差异, 且该差异并未
造成编码的氨基酸改变 , 因此两个品种来源的
OsGUN4所编码的氨基酸序列是一致的, 同时说明
该基因在籼稻和粳稻中可能非常保守。
图6 ‘龙特甫B’来源的OsGUN4基因编码序列
Fig.6 The coding sequence of OsGUN4 from the indica rice ‘Lengtefu B’
为进一步研究OsGUN4基因可能参与水稻叶
色调控的功能 , 首先分析了ygl-11突变体中Os-
GUN4的表达情况, 以确定是否T-DNA的插入造成
了该基因的沉默或者降低了该基因的表达。对孕
穗期的突变体和野生型植株叶片总RNA进行了半
定量RT-PCR分析, 结果(图7-A)显示, 突变体中的
OsGUN4并未表达, 因此可能造成了该基因功能的
丧失而导致叶色变异。
为了研究该基因在水稻生长发育过程中的表
达模式, 采用实时定量RT-PCR的方法检测了粳稻
品种‘日本晴’不同组织中OsGUN4的表达水平, 如
图7-B所示, 在水稻植株叶片等含叶绿素较多的组
织中表达量最高, 而在其它组织中表达量较低, 尤
其是在种子中的表达量最低, 几乎检测不到。
讨 论
植物的光合作用及其调控机理研究一直是植
物生理和分子生物学研究的热点。叶绿素是光合
色素的主要组成部分, 其功能是捕获光能并将能
量传递到光反应中心从而产生化学能, 是植物叶
绿体内参与光合作用的重要色素(Tanaka和Tanaka
2006)。光合作用的效率直接影响着作物的产量,
因此提高植物光合效率是当前作物高产育种的重
要目标, 对叶绿素合成相关基因的鉴定和功能研
究非常有必要。
目前在水稻中已鉴定、克隆了大量的叶绿素
合成相关基因, 并且参与叶绿素合成的主要酶类
及其代谢途径已有深入研究, 其中一些基因的突
变就会造成黄叶或淡黄叶的产生 ( Ta n a k a等
2011)。Lee等(2005)在水稻中鉴定了2个叶绿素a氧
化酶同源的基因OsCAO1和OsCAO2。Wu等(2007)
利用图位克隆的方法鉴定了一个控制水稻黄绿叶
突变性状的基因YGL1。Jung等(2003)利用T-DNA
标签技术克隆了编码镁离子螯合酶大亚基的Os-
陈盛杰等: T-DNA插入水稻OsGUN4基因导致淡黄叶突变 785
CHLH基因。随后Zhang等(2006)通过图位克隆的
方法克隆了另外两个镁离子螯合酶亚基基因Os-
CHLD和OsCHLI, 这3个基因所编码的蛋白质(亚
基)共同组成了镁离子螯合酶。镁离子螯合酶是叶
绿素合成分支中镁分支途径的关键酶, 其催化形
成Mg-原卟啉IX的步骤非常复杂, 存在转录水平和
转录后水平的调控, 相关基因的突变都有可能造
成叶色的变异(Mochizuki等2011; Masuda 2008)。
随着技术的进步和试验方法的改进, 在对叶绿素
代谢关键途径研究的基础上, 基因间的表达调控
网络调控研究越来越受到关注, 因此, 一些关键调
控基因的功能研究显得尤为重要, 而后者功能的
明确有待于关键突变体的发现和鉴定。
本研究通过筛选转基因水稻后代获得了一个
淡黄叶突变体ygl-11, 通过遗传分析证明该表型受
一对隐性基因控制, 利用改良的反向PCR和TAIL-
PCR相结合的方法鉴定了造成该叶色突变的基因
为OsGUN4。OsGUN4是拟南芥GUN4的同源基因,
该基因在拟南芥中的研究较多。研究认为该基因
参与了叶绿素合成过程中镁分支的调控(Larkin等
2003; Peter和Grimm 2009), 在蓝藻中的研究发现
其能够与镁离子螯合酶的H亚基结合并且是维持
镁离子螯合酶活性所必须的, 并且还与其他亚基
存在相互作用(Wilde等2004; Morita等2005)。在豌
豆中的研究表明该基因的表达受到镁离子螯合酶
基因表达的影响, 随着后者表达的下调而下调(Luo
等2013)。尽管随着研究的深入, 蓝藻GUN4蛋白
的晶体结构也得到了阐述, 但是由于该基因所编
码的蛋白与高等植物并不完全相同, 是否存在着
类似的作用还不清楚(Davison等2005; Davison和
Hunter 2011; Kindgren等2011)。在水稻中有关该
基因的研究仅有一篇报道, 体外研究表明该基因
编码蛋白的C端是维持镁离子螯合酶亚基CHLH活
性所必须的(Zhou等2012), 而该基因突变后对水稻
植株的影响并未有报道。尽管在拟南芥中GUN4
基因已有很多研究, 并且过量表达该基因后能够
明显提高烟草的叶绿素含量(Peter等2009), 但水稻
中该基因是否有促进叶绿素合成的功能并未有报
道, 因此该突变体对于研究水稻中GUN4基因的功
能具有重要的作用。
在开发作物叶色标记性状研究领域, 淡黄叶
突变性状由于受一对隐性基因控制并且对植株表
型影响较小而成功应用于水稻两系杂交育种中,
并已育成多个水稻不育系(宋克堡和肖建平2012),
这说明该类突变具有较好的生产应用价值, 相关
研究将为生产实践提供很好的理论基础。本研究
中筛选获得的淡黄叶突变体来源于我国籼型杂交
稻的重要亲本, 且受一对隐性基因控制。因此, 所
选育的突变体可用于生产实践, 同时也为直接有
效的分析目的基因的功能, 尤其是对于细胞内核-
图7 突变体和野生型植株中OsGUN4基因的表达分析
Fig.7 Expression profile of OsGUN4 gene in ygl-11 mutant and wild type
A: 突变体和野生型植株叶片中OsGUN4基因的表达分析; B: 粳稻品种‘日本晴’不同组织中OsGUN4的表达。
植物生理学报786
质间这种复杂的信号调控研究提供非常有用的遗
传材料。
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