全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2012, 48 (12): 1173~1178 1173
收稿 2012-09-24 修定 2012-12-04
资助 国家科技支撑计划项目(2011BAD30B01)、农业部国
家科技支撑计划(2006BAD01A06-3)、科技创新强省
计划(2009AB001)、云南省产业重大关键技术开发专
项计划([2008]1657号)、云南农垦重点科技计划项目
(2006XJ03)。
* 通讯作者(E-mail: liling2612@163.com; Tel: 0691-2120332)。
橡胶树未成苗体细胞胚的茎芽分化及利用
李玲*, 梁国平, 管艳, 黄凤翔, 肖三元, 田海
云南省热带作物科学研究所, 云南景洪666100
摘要: 以橡胶树未成苗体细胞胚为试材, 选取未成苗双子叶胚、连体胚、多子叶胚、单子叶胚和子叶愈伤化胚作为外植
体, 研究不同体细胞胚类型的外植体分化茎芽的情况, 并利用其进行幼态微型芽条的培育研究。结果表明: 在植株诱导培
养基中培养80 d后, 未成苗双子叶胚、连体胚、多子叶胚、单子叶胚、子叶愈伤化胚均能分化出芽, 双子叶胚分化率最高
(达90%), 单子叶胚最低(20%), 多子叶胚和连体胚最多可分化出芽3个, 双子叶胚2个。幼态微型芽条增殖的最优培养基为
MS+6-BA 2 mg·L-1或MS+6-BA 2 mg·L-1+KT 1 mg·L-1, 而添加NAA对芽的伸长有抑制作用; 适宜幼态微型芽条伸长培养的基
本培养基为MS。
关键词: 橡胶树; 体细胞胚类型; 未成苗体细胞胚; 幼态微型芽条
Bud Differentiation and Utilization of Non-Seedling Somatic Embryos of He-
vea brasiliensis Muell. Arg.
LI Ling*, LIANG Guo-Ping, GUAN Yan, HUANG Feng-Xiang, XIAO San-Yuan, TIAN Hai
Yunnan Tropical Crops Research Institute, Jinghong, Yunnan 666100, China
Abstract: Non-seedling somatic embryos of Hevea brasiliensis, including dicotyledonous embryo, connection
radicle embryo, polycotyledonous embryo, monocotyledonous embryo and cotyledon recallus embryo, were
used as explants in this study. The bud differentiation and the mini-juvenile-type bud stick cultivation of all
these somatic embryos were studied. The results indicate that all 5 types of embryos can develop buds after they
were cultured in an induction medium for 80 d. The highest differentiation rate was 90% found in dicotyledon-
ous embryos, and the lowest differentiation rate was 20% found in monocotyledonous embryos. Polycotyledon-
ous embryo and connection radicle embryo could differentiate 3 buds at most, 2 for dicotyledonous embryo.
The optimal medium for the propagation of mini-juvenile-type bud stick was MS+6-BA 2 mg·L-1 or MS+6-BA
2 mg·L-1+KT 1 mg·L-1. The optimal basic medium for elongation of mini-juvenile-type bud stick was MS. With
addition of NAA, the elongation of shoots can be inhibited.
Key words: Hevea brasiliensis; classification of somatic embryos; non-seedling somatic embryos; mini-juve-
nile-type bud stick
橡胶树一直被认为是林木组织培养中诱导再
生植株难度较大的树种之一(El Hadrami等1991),
橡胶树的体细胞胚发生率低以及植株再生频率低
是制约其组培苗工厂化的瓶颈(谭德冠等2005)。
而目前胚胎发生是橡胶花药体细胞植株再生的唯
一途径(吴胡蝶等1994), 尽管人们从花药及内珠被
组织均已成功诱导体细胞胚胎发生及植株再生,
但体细胞胚诱导率低, 出苗率也低(陈雄庭等1998,
1993), 即使是比较容易诱导成苗的品系如‘海垦
2’、‘热研88-13’, 其植株诱导率也仅有4%~5%, 尚
有85%以上的体细胞胚生长受阻, 出现畸形胚, 不
能萌发成苗(谭德冠等2005; 吴胡蝶等1997; 王泽云
等1978)。有的在形态上已发育至子叶期的成熟
胚, 仍未能抽芽成苗, 很多体细胞胚只能分化出根,
不抽茎(梁国平和肖三元2004; 吴胡蝶等1997; 王泽
云和陈雄庭1995; 王泽云等1980), 使已培育出的体
细胞胚未能得到有效利用。我们在研究橡胶树花
药培养时, 同样出现了大量的此类体细胞胚, 这类
体细胞胚虽具有根系, 但未能进一步发育形成正
植物生理学报1174
常植株, 被称为未成苗体细胞胚。目前有关未成
苗体细胞胚的研究尚未见报道。
通过对未成苗体细胞胚进行茎芽诱导增殖能
获得大量橡胶幼态微型芽条, 可以为橡胶树籽苗
芽接提供优良无性系接穗材料。用微型芽条进行
籽苗芽接能解决生产上籽苗芽接过程中由于砧木
与芽条在大小上不对称所造成的芽接操作困难的
问题(陈雄庭2007), 在生产中有很大的潜在应用价
值。本文以未成苗体细胞胚为实验材料, 比较了
不同类型未成苗体细胞胚的茎芽分化情况, 并利
用其进行幼态微型芽条的培育, 以期为未成苗体
细胞胚的利用提供新的途径和方法, 达到充分利
用未成苗体细胞胚的目的, 并为橡胶树籽苗芽接提
供新的大量优良无性系幼态微型芽条来源, 为橡胶
树组织培养和工厂化育苗体系的建立奠定基础。
材料与方法
1 材料
在对本所培育的橡胶树(Hevea brasiliensis Mu-
ell. Arg.)优良无性系品种‘云研73-477’进行花药组
织培养的基础上, 选择成熟体细胞胚经植株再生
过程产生的未成苗体细胞胚为试验材料。
2 未成苗体细胞胚的茎芽分化
成熟体细胞胚在完整植株诱导培养基(梁国
平和肖三元2004)上培养20~50 d, 部分发育成具有
根、茎、叶的完整植株。50 d后挑选出只长根不
抽茎的未成苗体细胞胚继续长时间分化培养, 选
取的体细胞胚类型有未成苗双子叶胚、单子叶
胚、多子叶胚、连体胚、子叶愈伤化胚。培养80 d
后统计不同类型未成苗体细胞胚芽的分化情况。
3 未成苗带芽体细胞胚芽的伸长培养
在无菌条件下将分化出芽的未成苗体细胞胚的
根系切除, 接种于伸长培养基上。以MS为基本培养
基, 加入蔗糖70 g·L-1、琼脂6.5 g·L-1、6-BA 2 mg·L-1,
添加NAA浓度分别为0、0.2、0.3、0.5、0.8 mg·L-1,
研究NAA对未成苗带芽体细胞胚芽伸长生长的影
响。培养基pH值为5.8, 在培养温度为(26±2) ℃、光
照时间12 h·d-1、光照强度20 µmol·m-2·s-1的条件下
进行培养, 45 d后统计茎芽的高度及其生长状况。
4 幼态微型芽条的培育
4.1 增殖培养
采用L9(3
3)的正交实验设计, 以MS为基本培养
基, 加蔗糖60 g·L-1、琼脂5 g·L-1, 6-BA浓度为1、
2、3 mg·L-1, NAA浓度为0、0.2、0.5 mg·L-1, KT浓
度为0、0.5、1 mg·L-1三因素三水平设计实验, 以
增殖系数和伸长率为指标, 筛选最优培养基。在
无菌条件下将伸长的茎芽去叶, 切成带有1~3个腋
芽的基部或带有顶芽的3 cm左右的顶部两个部分,
接种在不同植物生长调节剂浓度的MS培养基上。
每个处理接种10管, 所有试验均重复3次, 45 d后统
计幼态微型芽条的增殖情况。培养基pH值为5.8,
在培养温度为28 ℃、光照时间10 h·d-1、光照强度
25 µmol·m-2·s-1的条件下进行培养。当新芽长到
3~5 cm、甚至更高时, 再用同样的方法切取顶部
和基部接种到增殖培养基上进行幼态微型芽条的
增殖培养, 45 d继代增殖一次。伸长率为伸长1 cm
以上的芽数与总芽数的比值。
4.2 幼态微型芽条的伸长培养
分别以MS、4/5MS、1/2MS为基本培养基,
加蔗糖60 g·L-1、琼脂5 g·L-1、6-BA 1.5 mg·L-1、
KT 1 mg·L-1、NAA 0.05 mg·L-1。将增殖后的新芽
转接到不同基本培养基上进行伸长培养, 以伸长
率和平均伸长高度为指标, 筛选出最适芽条伸长
的基本培养基。每个处理接种10管, 重复3次。培
养基pH值为5.8, 在培养温度为28 ℃、光照时间12
h·d-1、光照强度为30 µmol·m-2·s-1的条件下进行培
养, 45 d后统计芽的伸长情况。
5 数据统计与分析
采用DPSv7.05统计软件进行Duncan新复极差
方差分析与差异显著性检验, 文中百分率数据分
析时经过反正弦平方根转换。
实验结果
1 不同类型未成苗体细胞胚芽的分化情况比较
在完整植株诱导培养基上培养60 d后, 部分未
成苗体细胞胚陆续有生长点萌发长出幼芽, 但多
数芽萌发后未能继续生长, 少数芽虽能伸长但较
为纤细且发育较慢, 80 d后茎芽仍不能够展叶, 无
明显伸长(图1)。从表1可看出, 5种形态未成苗体
细胞胚均能分化出芽, 其中以未成苗双子叶胚分
化出芽的体细胞胚数最多, 分化率达90%, 单子叶
胚分化率最低, 仅为20%。在培养中发现, 多子叶
胚和连体胚最多可分化出3个芽, 双子叶胚最多能
分化出2个芽。
李玲等: 橡胶树未成苗体细胞胚的茎芽分化及利用 1175
图1 不同类型未成苗体细胞胚的芽分化
Fig.1 Bud differentiation of different types of non-seedling somatic embryos
A: 子叶愈伤化胚诱导出芽; B、C: 单子叶胚诱导出芽; D: 多子叶胚诱导出1个芽; E: 多子叶胚诱导出2个芽; F: 胚根相连的连体胚诱导
出2个芽; G: 胚根相连的连体胚诱导出3个芽; H、I: 双子叶胚诱导出芽。
表1 不同类型未成苗体细胞胚芽的分化比较
Table 1 Bud differentiation of non-seedling somatic embryos in different types
体细胞胚类型 未成苗体细胞胚数/个 分化芽的体细胞胚数/个 分化率/% 芽分化数/个
双子叶胚 20 18 90 1~2
多子叶胚 20 15 75 1~3
单子叶胚 20 4 20 1
连体胚 20 15 75 1~3
子叶愈伤化胚 20 8 40 1
植物生理学报1176
2 NAA对未成苗带芽体细胞胚芽伸长生长的影响
将未成苗带芽体细胞胚的根系切除, 接种于
6-BA浓度为2 mg·L-1、添加不同浓度NAA的培养
基上进行茎芽伸长培养, 1周后芽开始伸长, 叶片
逐渐展开(图2)。表2显示, 在所使用的NAA浓度范
围内, 茎芽均有不同程度的伸长, 但随着NAA浓度
的增大, 对茎芽伸长的抑制作用越明显。不添加
NAA时茎芽的平均生长量最大, 达3.67 cm, 茎芽长
势好, 与NAA为0.2 mg·L-1时的平均芽高差异不显
著, 而与NAA浓度为0.3、0.5、0.8 mg·L-1时的差异
显著; NAA为0.8 mg·L-1时茎芽平均生长量最低, 为
1.83 cm, 茎芽生长缓慢。可见, 高浓度的NAA抑制
茎芽伸长, 茎芽伸长生长须在低浓度的NAA条件
下进行。
表2 不同浓度NAA对茎芽伸长生长的影响
Table 2 Effects of different concentrations of NAA on the elongation and growth of buds
NAA浓度/mg·L-1 接种带芽体细胞胚数/个 平均芽高/cm 茎芽生长状况
0 30 3.67a 茎芽长势好、健壮, 叶宽大舒展、绿色
0.2 30 2.78ab 茎芽长势好, 叶宽大舒展、绿色
0.3 30 2.27b 茎芽长势好, 叶狭窄、绿色
0.5 30 2.19b 茎芽生长缓慢, 叶偏狭窄、绿色
0.8 30 1.83b 茎芽生长缓慢, 叶细小卷曲、黄绿色
同列数据上的小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
图2 未成苗带芽体细胞胚芽的伸长培养
Fig.2 Bud elongation culture of budded non-seedling somatic embryos
A、B: 单子叶胚; C: 双子叶胚; D: 连体胚; E: 多子叶胚; F: 子叶愈伤化胚。
李玲等: 橡胶树未成苗体细胞胚的茎芽分化及利用 1177
3 6-BA、NAA和KT对幼态微型芽条增殖的影响
将伸长的茎芽切成顶部和基部两个部分, 接
种在不同植物生长调节剂及其浓度配比的培养基
中, 15 d后切口处不同程度长出愈伤组织, 顶芽和
腋芽陆续萌动抽芽(表3)。对正交试验的结果进行
极差分析, 并对增殖系数和伸长率的K值(每一列
上各个水平的平均值)作分析, 结果表明6-BA、
NAA和KT对幼态微型芽条增殖的各项指标影响
主次和最优组合不同。6-BA对幼态微型芽条增殖
系数的影响最大, 其次是KT, NAA的影响最小, 最
优水平组合为A2B2C3, 即MS+6-BA 2 mg·L
-1+NAA
0.2 mg·L-1+KT 1 mg·L-1。而对伸长率而言, NAA的
影响最大, 其次是KT, 6-BA的影响最小, 最优水平
组合为A1B1C1, 即MS+6-BA 1 mg·L
-1。以上两个指标
单独分析出的最优组合不一致, 必须根据因素的影
响主次, 综合平衡确定最优组合。对于因素6-BA,
其对增殖系数是主要因素, 对伸长率是次要因素,
故取A; 同理, NAA的优水平为B1, KT为C1或C3。
综合平衡后得到的最优组合为A2B1C1或A2B1C3，
即MS+6-BA 2 mg·L-1或MS+6-BA 2 mg·L-1+KT 1
mg·L-1。增殖效果见图3-A和B。
4 基本培养基对幼态微型芽条伸长的影响
增殖培养后的新芽节间短小, 为促进新芽伸
长展叶, 快速生长, 抑制侧芽分化, 形成可用芽条,
将增殖培养后的新芽接种于伸长培养基上, 培养
到45 d后, 这些新芽部分可伸长5 cm以上, 形成幼
态微型芽条, 经过一次继代培养后, 可达10 cm以上
(图3-C)。从表4可见, 不同基本培养基之间对幼态
微型芽条的伸长率没有显著的影响, 而对平均伸
长高度有显著影响。通过多重比较可以看出: 对
伸长率而言, 以MS为基本培养基时伸长率最高, 达
75.41%, 与以4/5MS和1/2MS为基本培养基的差异
表3 不同浓度6-BA、NAA和KT对幼态微型芽条增殖的影响
Table 3 Effects of different concentrations of 6-BA, NAA and
KT on the proliferation of mini-juvenile-type bud stick
编号
植物生长调节剂及其浓度/mg·L-1
增殖系数 伸长率/%
6-BA (A) NAA (B) KT (C)
1 1 0 0 3.69c 48.05a
2 1 0.2 0.5 4.75bc 28.56cd
3 1 0.5 1 4.10bc 23.39d
4 2 0 0.5 4.28bc 44.65ab
5 2 0.2 1 7.94a 19.73d
6 2 0.5 0 6.26ab 31.35bcd
7 3 0 1 5.20bc 41.04abc
8 3 0.2 0 3.72c 26.31d
9 3 0.5 0.5 3.44c 29.62cd
增殖系数 K1 4.18 4.39 4.56
K2 6.16 5.47 4.15
K3 4.12 4.60 5.75
R 2.04 1.08 1.59
伸长率 K1 33.33 44.58 35.24
K2 31.91 24.86 34.28
K3 32.32 28.12 28.05
R 1.42 19.71 7.18
同列数据上小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。
图3 幼态微型芽条的增殖与伸长培养
Fig.3 Proliferation and elongation culture of mini-juvenile-type bud stick
A: 顶部在芽条增殖培养基上20 d的抽芽情况; B: 基部在芽条增殖培养上45 d的增殖情况; C: 伸长至10 cm以上的幼态微型芽条。
植物生理学报1178
表4 不同基本培养基对幼态微型芽条伸长的影响
Table 4 Effects of different basic mediums on the elongation
of mini-juvenile-type bud stick
基本培养基 外植体数/个 总芽数/个 伸长率/% 平均伸长高度/cm
1/2MS 30 101 61.03aA 1.44bB
4/5MS 30 102 62.63aA 1.57bAB
MS 30 111 75.41aA 2.12aA
同列数据上大写字母不同表示差异极显著(P<0.01), 小写字母
不同表示差异显著(P<0.05)。
不显著; 对平均伸长高度来说, 也是MS基本培养
基为最高, 达2.12 cm, 与以4/5MS和1/2MS为基本
培养基的差异显著。因此, 适宜幼态微型芽条伸
长培养的基本培养基为MS。
讨 论
本文以橡胶树花药未成苗体细胞胚为实验材
料, 在植株诱导培养基中进行80 d左右的长时间茎
芽分化培养 , 发现双子叶胚、连体胚、多子叶
胚、单子叶胚、子叶愈伤化胚均能分化出芽, 这
与谭德冠等(2011)对花药胚性愈伤组织进行体细
胞胚胎发生研究时所发现的只有双子叶胚和连体
胚才含有生长点的结论不一致。在一些作物(如棉
花)组织培养中, 其体细胞胚发生过程中产生的单
子叶胚、三子叶胚、四子叶胚等都能发育成植株
(张家明等1992)。对分化出芽的未成苗体细胞胚
进行芽的伸长培养, 茎芽可伸长至8 cm左右。
植物生长调节剂种类及浓度的筛选是组织培
养工作的重点和难点(孙爱花等2008), 本研究在增
殖阶段分别使用6-BA、NAA和KT等对幼态微型
芽条进行增殖培养, 最优培养基组合为MS+6-BA 2
mg·L-1或MS+6-BA 2 mg·L-1+KT 1 mg·L-1, 细胞分裂
素对芽增殖的影响较大, 这与陈雄庭等(1998)和孙
小龙等(2009)的研究结论一致。本文结果表明, 生
长素类植物生长调节剂NAA对伸长率的影响最大,
添加NAA对芽的伸长有抑制作用, 这在试验材料
增殖过程中也得到验证。而赵辉等(2009)对成龄
树茎段进行微繁时发现, 不使用NAA时, 萌动的腋
芽很难抽枝增殖; 在添加6-BA基础上再加少量
NAA (0.5 mg·L-1)时, 萌动芽能很快抽出。这与本
文的结论不符, 可能与取材不同有关。此外, 我们
还用无菌的正常花药苗为试验材料, 发现其增殖
结果与以未成苗体细胞胚为材料的一致。
作为籽苗芽接的芽条必须有一定的高度和粗
度, 且萌动的侧芽会降低籽苗芽接的成活率(陈雄
庭2007), 伸长培养阶段除了要掌握和控制好植物
生长调节剂的合理配比之外, 基本培养基的选择
尤为重要。适宜幼态微型芽条伸长培养的基本培
养基为MS, 继代一次后部分芽条可伸长至10 cm以
上, 直径2 mm左右, 长势良好。在幼态微型芽条伸
长培养中仍然有侧芽萌发的问题, 可能与外植体
取材类型、培养基及添加物质构成、培养环境等
有关。因此, 今后还需要进一步对培育幼态微型
芽条的各种外植体材料和培养条件进行研究, 以
建立完善的幼态微型芽条培育体系。
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