全 文 ：植物生理学报 Plant Physiology Journal 2013, 49 (11): 1267~1272 1267
收稿 2013-07-15　　修定 2013-08-27
资助 山东省农业良种工程重大项目(鲁科农字[2008]167号)。
* 通讯作者 (E-mail: gszheng@qau.edu.cn; Tel: 0532-86080640)。
牡丹病程相关蛋白1表达载体的构建及遗传转化
杨德翠，郑国生*
青岛农业大学生命科学学院, 山东省高校植物生物技术重点实验室, 山东青岛266109
摘要: 为了对牡丹病程相关蛋白1 (PsPR1)基因功能进行研究, 构建了PsPR1基因超表达载体pBI121-PsPR1, 通过农杆菌介
导法将PsPR1基因转入普通烟草NC89中。经过抗性筛选和RT-PCR分子检测, 获得含PsPR1转基因植株。对转化烟草的T0
代植株进行抗病性鉴定, 发现转PsPR1基因烟草能轻微增强对烟草黑胫病的抗性, 说明PsPR1基因具有抗烟草黑胫病原菌
(Phytophthora parasitica var. nicotianae)的功能。
关键词: 牡丹; 病程相关蛋白1; 载体构建; 遗传转化
Expression Vector Construction and Genetic Transformation of Pathogenesis-
Related Protein 1 of Paeonia suffruicosa
YANG De-Cui, ZHENG Guo-Sheng*
Key Lab of Plant Biotechnology in Universities of Shangdong Province, College of Life Sciences, Qingdao Agricultural Univer-
sity, Qingdao, Shandong 266109, China
Abstract: In order to study the function of pathogenesis-related proteins 1 of Paeonia suffruicosa (PsPR1)
gene, pBI121- PsPR1, the overexpression vector of PsPR1, was constructed and the gene was introduced into
tobacco ‘NC89’ by agrobacterium tumefaciens. Using resistance screening and RT-PCR detection, the
genetically modified tobacco plant containing PsPR1 was obtained. The transgenic tobacco plants of T0
generation were tested for disease resistance. It was found that transgenic tobacco with PsPR1 could slightly
enhance resistance to tobacco black shank. This result showed that the PsPR1 gene had a resistance to
Phytophthora parasitica var. nicotianae.
Key words: Paeonia suffruicosa; pathogenesis-related protein 1; vector construction; genetic transformation
植物病程相关蛋白(pathogenesis-related pro-
teins, PRs)总共有17个大家族, 其中一个重要而功
能又未知的PR是PR1蛋白。PR1基因常被当作系
统获得抗性(systemic acquired resistance, SAR)的分
子标记(van Loon和van Strien 1999), 它的高水平表
达与SAR途径密切相关, 是PRs中表达量最高的蛋
白(Alexander等1993)。通过转基因对其基因功能
进行研究是近年来对PRs研究的热点之一。
研究发现一些PR1基因对病原菌表现出了一
定的抗性。Alexander等(1993)在转PR-la基因烟草
中发现, 该基因以组成型高效表达, 增加了烟草对
两种卵菌、疫霉属、斜尖状孢子菌属侵染的耐受
性, 但其抗病机制尚不明确。Niderman等(1995)研
究认为PR1蛋白在微克分子水平上就具有抗菌活
性 , 番茄PR1蛋白不但强烈抑制致病疫霉(Phy-
tophthora infestans)孢子的萌发, 还阻止叶盘上病
斑的扩展。PR1基因是多基因家族, 但并非所有
P R 1基因都具有抗病功能。葡萄中只有碱性
VvPR1b1增强了对烟草野火病菌(Pseudomonas sy-
ringae pv. tabaci)的抗性(Li等2011), 而在苹果中克
隆的PR-1a、PR-1b和PR-1c通过转基因后发现, 在
苹果幼苗中没有表现出抗病功能 (Bonasera等
2006)。
目前, 控制牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)病
害主要是喷施农药, 但农药会造成污染, 而传统抗
性新品种培育困难。植物基因工程可以直接把目
的基因导入受体而较少影响受体植株的其他性状,
因此自出现以来就倍受重视。目前已在棉花、大
豆、玉米等作物上转化成功 (王永飞和马三梅
2007)。转化植株培育抗性品种, 寻找抗性基因至
植物生理学报1268
关重要。
对PR1基因功能的研究大多集中于草本植物,
而对于木本植物中的研究相对较少, 牡丹中的PR1
基因研究未见报道。前期研究中分离到牡丹病程
相关蛋白1基因PsPR1, 编码158个氨基酸, 与其他
植物PR1高度同源, 且受SA和病原菌Cylindrocladi-
um canadense的诱导(杨德翠等2013), PsPR1可能
参与了牡丹的抗病防御过程。但对于PsPR1基因
是否能增强植物抗病性并不清楚, 为此, 构建了该
基因的超表达载体pBI121-PsPR1, 通过农杆菌介
导法转化烟草‘NC89’, 并对转化烟草的抗黑胫病
进行检测。本研究初步验证了PsPR1基因的功能,
为PsPR1在牡丹抗病育种上的应用奠定了基础。
材料与方法
1 材料
试验材料为四年生牡丹(Paeonia suffruticosa
Andr.)品种‘鲁菏红’叶片, 材料培养及处理方法参
考杨德翠等(2013)的方法。用于遗传转化的材料
为烤烟(Nicotiana tabacum L.)品种‘NC89’。
菌种为大肠杆菌E. coli DH5α和根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens) EHA105, 为青岛农业
大学植物生理教研室保存。烟草黑胫病原菌为中
国农业科学院烟草研究所赠送。
2 主要试剂
EASYspin植物RNA快速提取试剂盒购自原
平皓(天津)生物技术有限公司; 反转录试剂盒为
Fermentas公司RevertAidTM First Strand cDNA Syth-
esis Kit; Taq DNA Polymerase、限制性内切酶
BamHI和SacI及克隆载体pMD18-T Simple均购自
TaKaRa (大连)公司; 植物表达载体pBI121由山东
农业大学国家作物生物学重点实验室郑成超教授
馈赠; Kan (kanamycin, 卡那霉素)、Cef (cefotaxime
sodium, 头孢噻肟钠)和Rif (rifampicin, 利福平)购
自生工生物工程(上海)股份有限公司、6-BA和
NAA购自北京索莱宝科技有限公司; 其他生化试
剂均为国产分析纯。
3 试验方法
3.1 目的基因PsPR1片段的克隆
利用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提
取牡丹叶片总RNA, 然后利用RevertAidTM First
Strand cDNA Sythesis Kit合成cDNA, 作为RT-PCR
的模板。根据已获得牡丹病程相关蛋白1基因的
cDNA全长(杨德翠等2013), 在开放阅读框的两端
分别设计含有BamHI和SalI的酶切位点的引物, 上
下游引物分别为: PsPR1-ORF F: 5-GGATCCATG-
GTTCTTTTAGACAGGCTTTG-3和PsPR1-ORF R:
5-GTCGACCTAGCGATGATGCTTGCTCCTTG-3
(下划线处分别为BamHI和SalI酶切位点)。反应试
剂有10×Taq Reaction Buffer 5.0 μL, 10 μmol·L-1
dNTP Mix 4 μL, 上下游引物各2.0 μL, Taq DNA
Polymerase (5 U·μL-1) 0.4 μL, 模板2.0 μL, 灭菌
ddH2O 34.6 μL, 总体积为50 μL。扩增程序为94 ℃
5 min; 94 ℃ 30 s, 58 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环;
72 ℃ 3 min; 4 ℃保存。对所得片段回收、纯化,
连接至pMD-18T Simple上, 转化大肠杆菌E.coli
DH5α, 挑选阳性克隆, 委托上海博尚生物技术有
限公司进行测序。将序列正确的菌液和pBI121分
别提取质粒, 获得pMD-PsPR1质粒和pBI121质粒,
对质粒分别用BamHI和SalI进行双酶切, 电泳并回
收目的片段。用T4连接酶将目的基因小片段与
pBI121质粒大片段连接, 构建超表达载体pBI121-
PsPR1, 经PCR鉴定筛选出重组子。将该表达载体
用热激法转化农杆菌EHA105, 经抗性筛选和PCR
检测获得转化农杆菌。
3.2 烟草的遗传转化
烟草‘NC89’成熟种子用70%酒精表面灭菌30
s, 再用NaClO (有效氯含量为2%)消毒15 min, 无菌
水冲洗7~8遍后, 播种于MS固体培养基(pH 5.8), 光
照800 µmol·m-2·s-1, 每天光照时间12 h, 温度25
℃。等烟草长到4~5叶时用于转化。
挑取pBI121-PsPR1阳性重组子于20 mL的LB
培养基中(内含50 μg·mL-1 Kan+50 μg·mL-1 Rif), 28
℃, 200 r·min-1, 培养大约20 h, OD600约为0.6时, 菌
液4 000×g离心10 min。将菌液滴入20 mL的MS液
体培养基中至稍显浑浊。将烟草叶片剪成5 cm×5
cm的小块, 迅速放进上述MS培养基中, 侵染时间
10~15 min, 中间不断摇动, 使材料浸没在液体中。
取出叶片将表面的菌液吸收, 将叶片转移到共培
养基(MS+6-BA 1 μg·mL-1+NAA 0.2 μg·mL-1)上, 在
28 ℃暗中培养2~3 d; 然后转移至后培养基(MS+6-
BA 1 μg·mL-1+NAA 0.2 μg·mL-1+Cef 250 μg·mL-1)
杨德翠等: 牡丹病程相关蛋白1表达载体的构建及遗传转化 1269
上, 28 ℃, 光下培养1~2 d; 转到分化培养基(MS+6-
BA 1 μg·mL-1+NAA 0.2 μg·mL-1+Cef 250 μg·mL-1+
Kan 50 μg·mL-1)上, 28 ℃, 每天光照12 h; 分化出烟
草幼苗后, 将幼苗切下转入生根培养基(MS+Cef
250 μg·mL-1+Kan 50 μg·mL-1)上。
3.3 转化烟草的PCR检测
待幼苗长至5~6 cm时, 进行PCR检测。提取
转化烟草和野生烟草的总RNA并进行反转录, 转
录产物用作PCR模板。检测引物为PsPR1基因上
的特异片段, 上下游引物分别为PsPR1-qpF 5-
CTCCGCCCAAGACTCCCCACAAG-3和PsPR1-
qpR 5-GCAAGATTCTCACCATAGGGACCAC-
CAG-3。PCR检测体系25 μL, 试剂如下: 10×Taq
Reaction Buffer 2.5 μL, 10 μmol·L-1 dNTP Mix 2 μL,
上下游引物各1 μL, 模板1 μL, Taq DNA Polymerase
(5 U·μL-1) 0.2 μL, 灭菌ddH2O。扩增程序为94 ℃ 5
min; 94 ℃ 30 s, 53 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 35个循环;
72 ℃ 3 min; 4 ℃保存。以1%琼脂糖电泳检测。
3.4 扩繁和移栽
将检测为阳性的转化苗在MS基本培养基上
扩繁, 以达到一定数量。待幼苗长到5~6 cm时, 移
栽到小花盆中, 保湿3 d, 移入温室培养, 在烟草苗
长至10~12叶时进行抗病性鉴定。
3.5 转PsPR1基因烟草的抗病性检测
对转化烟草T0代进行烟草黒胫病的抗病性检
测, 黑胫病采用茎基部针刺创伤接种, 方法和抗病
级数统计均参照刘廷利(2007), 略有改动。
供试烟草黑胫病原菌于燕麦培养基, 25 ℃黑
暗培养5~6 d, 打成直径为1 cm的菌饼, 用昆虫针轻
度刺伤烟草茎基部以上1 cm处, 菌饼贴于伤口处,
并用灭菌水湿润的脱脂棉覆盖以保湿, 转化烟草
和野生型各处理4株, 对照用无菌培养基代替菌饼
处理野生烟草。材料置于光照培养箱内培养, 光
照12 h, 30 ℃, 黑暗12 h, 25 ℃。20 d后观察结果,
统计病情指数。病情指数(%)=∑(病级代表值×该
病级株数)/(最高级值×调查总株数)×100。根据不
同发病情况分为0~4级。0级: 全株没有发病; 1级:
茎部病斑不超过茎围1/2, 仅纵向少许扩展或少数
叶片失绿萎蔫; 2级: 茎部病斑已超过茎围1/2, 或半
数叶片失绿萎蔫; 3级: 茎部病斑环绕茎围, 大多数
叶枯萎, 少数叶是绿色; 4级: 全株萎蔫, 枯死。
实验结果
1 目的基因PsPR1超表达载体的构建
1.1 目的片段的PCR扩增
在PsPR1基因开放阅读框(ORF)两端设计含
酶切位点的引物, 以此引物进行PCR扩增, 扩增目
的片段如图1, 目的片段长度为477 bp, 与预期相一
致, 回收并纯化目的片段, 测序正确的序列用于下
一步载体的构建。
图1 含有酶切位点的ORF扩增产物
Fig.1 Amplification products of ORF with restriction
enzyme sites
M: DL2000 marker; 1: 目的片段。
1.2 质粒酶切与超表达载体构建
对pMD-PsPR1质粒和pBI121质粒DNA进行
BamHI和SalI双酶切, 结果如图2。将pMD-PsPR1
酶切小片段(目的片段477 bp)和pBI121酶切大片段
进行回收纯化(图3), 将小片段和大片段连接组成重
组质粒pBI121-PsPR1。利用重组质粒转化农杆菌, 阳
性转化菌的PCR结果如图4, 此农杆菌将用于‘NC89’
图2 pMD-PsPR1质粒与pBI121质粒的BamHI和
SalI双酶切鉴定
Fig.2 Plasmid of pMD-PsPR1 and pBI121 digested by
BamHI and SalI
M: DL2000 marker; 1: pBI121质粒; 2: pBI121双酶切片段; 3:
pMD-PsPR1质粒; 4: pMD-PsPR1双酶切片段。
植物生理学报1270
图3 质粒BamHI和SalI双酶切产物的回收片段
Fig.3 Fragment of purification of plasmid digested by BamHI
and SalI
M: DL2000 marker; 1: pBI121酶切大片段; 2: pMD-PsPR1酶切小片段。
图4 转化根癌农杆菌的菌液PCR检测
Fig.4 Bacteria liquid PCR identification of transformed
Agrobacterium tumefaciens
泳道1和2: 目的片段; M: DL2000 marker。
烟草的转化。整个超表达载体构建流程见图5。
2 转PsPR1基因烟草的抗性鉴定
2.1 转PsPR1基因烟草的分子鉴定
根据PsPR1基因序列设计特异引物进行转化
烟草的PCR检测, 以野生型烟草作为对照。提取各
材料的RNA, 以cDNA为模版, 进行PCR扩增。如
图4~6所示, 从转化的烟草植株中通过PCR扩增获
得与预期一致的180 bp特异性片段, 而野生型烟草
图5 pBI121-PsPR1表达载体的构建
Fig.5 Construction of expressional vector pBI121-PsPR1
杨德翠等: 牡丹病程相关蛋白1表达载体的构建及遗传转化 1271
未获得该片段, 说明PsPR1已整合到烟草中。本研
究中获得1棵转基因植株, 通过快速繁殖, 获得足
够数量的转化苗。
2.2 转PsPR1基因烟草的抗病性检测
对转化烟草对黑胫病的抗性进行了检测, 野
生型烟草和转化烟草均在2 d出现症状, 在接菌的
根茎基部出现黑色。20 d时如图7所示, 野生型烟
草下面的部分叶片失绿枯萎, 病斑环绕茎围部分
超过1/2, 向上蔓延。而转PsPR1烟草病斑扩展稍
慢, 茎部病斑环绕没有超过茎干的1/2。转化烟草
图6 转化PsPR1基因烟草的PCR鉴定
Fig.6 PCR identification of transgenic tobacco plants
1: 转基因烟草; 2: 野生型烟草; M: DL2000 marker。
图7 转PsPR1基因烟草T0代和野生型烟草对黑胫病菌抗性分析
Fig.7 Analysis of resistance to P. parasitica var. nicotianae in PsPR1 transgenic tobacco and wild type tobacco plants
与野生型烟草病情指数分别为25%和37.5%, 转
PsPR1基因对烟草黑胫病菌表现出轻微的抗性, 但
不显著。
讨　　论
PR1基因在多种植物中能被病原菌、非生物
因素和环境因素诱导(van Loond等2006; 侯丽霞等
1012), 尽管PR1基因在植物组织诱导表达量最高,
但对PR1蛋白生化功能了解甚少(Hong和Hwang
2005)。前期研究得到的PsPR1与其他植物PR1基
因高度同源, 又具有保守的SCP_PR-1_Like功能结
构域(杨德翠等2013), 但由于不同植物上分离的
PR1基因在功能上的差异比较大, 仅从氨基酸序列
和结构同源性来推断基因功能是不可靠的, 需要
通过转基因进行抗性试验。
某些PR1蛋白通过转基因确定具有抗菌功
能。如烟草中过表达PR1a基因增强了对霜霉病和
黑胫病的抗性(Alexander等1993), 过表达辣椒碱性
PR1基因对几种真菌和细菌表现出抗性(Sarowar等
2005)。但只有基因家族的少数成员被诱导表达而
表现出抗菌功能, 大多数的PR1蛋白参与发育调
控 , 具有未知的生物学功能。研究发现 , 苹果
(Malus domestica )中3个PR1基因在幼苗中没有对
病原菌和激发子做出反应(Bonasera等2006)。
在葡萄的PR1基因中, 只有碱性的VvPR1基因
表现出抗病性(Li等2011), 烟草中的碱性PR1蛋白
和辣椒中pI 8.5的PR1蛋白表现出显著的抗病功能
和抗生理胁迫(Alexander等1993; Kim和Hwang
2000; Hong和Hwang 2005; Sarowar等2005)。有人
认为碱性PRs蛋白能比酸性PRs蛋白表现出更强的
抗菌活性(Sela-Buurlage等1993), 但番茄中的PR1
pI＜5也具有明显的抗病功能(Niderman 等1995)。
植物生理学报1272
PR1是多基因家族, 在植物中PR1家族不同成员之
间功能差异很大, 因此, 不能简单地根据pI值和序
列同源性来判断基因是否具有抗病功能, 而必须
要通过试验才能确定(Li等2011)。
PsPR1基因的表达能够被牡丹上的病原菌C.
canadense和信号分子SA所诱导(杨德翠等2013),
那么PsPR1基因可能参与了牡丹对柱枝孢叶斑病
的防御过程。为了更多了解PsPR1基因的功能, 构
建了植物超表达载体pBI121-PsPR1, 获得了转化
PsPR1基因的烟草植株, 并对转化PsPR1基因烟草
对黑胫病的抗病性进行研究, 发现转化烟草表现
出了轻微的抗病性。从而初步推断PsPR1基因具
有抗烟草黑胫病原菌的功能。在不同的植物-病原
菌互作中, 启动不同的信号途径, 有不同的病程相
关蛋白参与, PsPR1是否还参与了其他病害的防御
过程, 有待研究。
某些转PR1基因植株还表现出抗逆功能。辣
椒PRl蛋白基因CaBPR1转入烟草中过量表达, 结
果表明该基因表达后不仅增强了烟草对多种病原
菌的抗性 , 还增强了烟草对重金属胁迫的抗性
(Sarowar等2005)。在拟南芥中过表达辣椒CaBPR1
增强了拟南芥的渗透胁迫和氧化胁迫(Hong和
Hwang 2005), CaBPR1基因的启动子也被高盐、干
旱和低温胁迫所诱导(Hoog等2005)。我们打算对
转化PsPR1基因烟草进一步进行抗逆性研究, 为更
多了解PR1基因的功能以及为PsPR1基因在牡丹抗
病育种中的应用提供参考。
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