全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 977
三种分析水稻 F1代幼苗生长过程中酯酶同工酶变化的电泳方法比较
彭元成 1,3,*, 宋春霞 2, 严敏 3,4
曲阜师范大学 1生命科学学院, 2化学学院, 山东曲阜 273165; 3华南农业大学生命科学学院, 广州 510642; 4青岛农业大学植
物科技学院, 山东青岛 266109
Comparison of Three Electrophoresis Methods Used in Analyzing Changes of
Esterase Isoenzymes in Seedling Growth of F1 Hybrid Rice (Oryza sativa L.)
PENG Yuan-Cheng1,3,*, SONG Chun-Xia2, YAN Min3,4
1College of Life Sciences, 2College of Chemistry Sciences, Qufu Normal University, Qufu, Shandong 273165, China; 3College of Life
Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China; 4College of Plant Science and Technology, Qingdao
Agricultural University, Qingdao, Shandong 266109, China
提要: 利用聚酯胶片作为凝胶支持物的超薄等电聚焦电泳(UTLIEF)研究水稻F1种子萌发过程中的酯酶同工酶多态性变化
的结果表明, UTLIEF相比非变性不连续聚丙烯酰胺电泳(native-PAGE)和常规等电聚焦电泳(IEF)得到的酯酶同工酶图谱更
清晰, 酶带数目和强弱的多态性变化更高, 用pH 2~9的两性电解质时等电聚焦的电泳效果较好。
关键词: 水稻; 酯酶同工酶; 非变性不连续聚丙烯酰胺电泳; 等电聚焦; 超薄等电聚焦
收稿 2008-07-14 修定 2008-07-24
资助 广东省自然科学基金(0 0 05 9 0 )、广东省教育厅自然科
学基金(2 0 00 6 8 )和曲阜师范大学科研启动基金。
* E-mail: yuanchengp@163.com; Tel: 0537-4456415
酯酶(esterase, EST)是一类能催化酯类化合物
水解的酶, 多为单体酶, 以单链蛋白或二聚体蛋白
的形式在植物体中广泛存在(Arulsekar等 1986;
Tabaeizaeh等 1986)。同工酶是指能催化相同的化
学反应, 但酶蛋白分子结构, 理化性质甚至免疫学
性质都不同的一组酶。目前发现的酯酶同工酶约
有20余种, 在植物的不同种属和同一植物的不同组
织中, 酯酶同工酶的组成也是不同的, 它具有较高
的组织特异性(Collet等 2005; 丁玲等 2007)。同工
酶是基因表达的产物, Pretová 等(2001)的研究表明,
亚麻中酯酶同工酶的组成具有时间特异性, 即不同
时间段内酯酶的组成也是不同的。而目前水稻中
相关的报道较少, 因此研究水稻种子萌发过程中酯
酶同工酶带的数目和活性变化, 进而揭示水稻中酯
酶的时间特异性, 将会有助于研究水稻的生长发育
过程。
酯酶同工酶的检测方法主要有非变性不连续
聚丙烯酰胺电泳(na t i ve pol yacr yla mide gel
electrophoresis, native-PAGE)和等电聚焦电泳
(isoelectric focusing electrophoresis, IEF)两种方法。
native-PAGE电泳是根据分子量的不同分离酯酶的,
但电泳时间较长, 电泳时电极发热导致有些酶带模
糊, 以致分辨率降低(Brown等 1995)。IEF电泳是
利用酶蛋白的等电点差异来分离酯酶的, IEF电泳
所用电压较高, 但凝胶在电泳过程中易出现散热不
充分, 对活性较弱的酶带影响较大(Wouters和Booy
2000)。水稻种子萌发过程中酯酶同工酶的变化可
能比较细微, 因而选择合适的电泳方法比较关键。
本文尝试用超薄等电聚焦电泳(ultrathin-layer iso-
electric focusing electrophoresis, UTLIEF)来分离水
稻种子发育过程中的酯酶同工酶, 并与native-PAGE
电泳和 IEF电泳进行比较, 以期能找到一种更准
确、更快速的酯酶同工酶电泳分离方法。
材料与方法
实验材料为水稻(Oryza sativa L.)品种 ‘培矮
64S’בEP431’的 F1种子和 ‘培矮 64S’בG67’的 F1
种子, 两性电解质为 LKB公司产品, 聚酯胶片为
Pharmacia公司产品, 聚丙烯酰胺为上海伯奥公司分
装, 坚牢蓝、α- 萘乙酸和 β - 萘乙酸为国产分析
纯。取以上种子于25 ℃恒温下在干净的培养皿中
培养, 从种子萌发第 1天, 即当胚芽长度约等于种
子长度一半时, 开始取材, 每天取水稻种粒和幼苗
置于-20 ℃低温冰箱中保存, 直到萌发第 6天。分
别取保存材料, 加适量石英砂在冰浴上快速研磨, 为
尽可能降低温度对酶活的影响, 研钵和研锤在使用
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月978
前预先冷却。将研磨后的溶液转移至离心管中, 于
0~4 ℃低温下保存 5 h, 充分提取酶液后于 4 ℃下
15 200×g离心 20 min, 所得上清液即为酯酶提取
液。
Native-PAGE电泳参照Brown等(1995)文中的
方法并稍加改进, 电泳所用分离胶浓度为 10%, 浓
缩胶浓度为 3%, 电极缓冲液为 pH 8.3的 Tris-Gly-
cine溶液。每孔上样量 20 µL, 电泳于 4 ℃低温下
进行, 浓缩胶电压 200 V, 电泳约 1 h; 分离胶电压
300 V, 电泳约 3 h。IEF电泳凝胶的配制参照胡群
宝等(2004)文中的方法并稍加改进, 取30%丙烯酰
胺贮备液 2.5 mL、蒸馏水 6.5 mL、两性电解质
600 µL、TEMED 20 µL和 10%过硫酸铵 100 µL,
搅匀后转入玻璃板空隙内, 丙烯酰胺聚合完成后将
凝胶平铺于冷却系统的平板上。凝胶两端分别加
上电极条, 样品点在靠近阴极处的滤纸条上。IEF
电泳过程参照Wouters和 Booy (2000)文中的方法,
从 25 mA、300 V开始恒流电泳, 待电压升至1 000
V时, 进行恒压电泳, 当电流达到最低值时停止电
泳, 整个电泳过程约 3 h。UTLIEF电泳参照 Zhao
等(2005)文中的蛋白质电泳方法, 取Gel-Fix聚酯胶
片放在下层玻璃板上, 将配好的凝胶溶液滴到胶片
中央, 将上盖玻璃板缓慢放下并防止气泡出现, 使
凝胶溶液均匀分布到上下玻璃板之间的间隙中。
凝胶聚合后, 用小刀将下层玻璃板撬开, 将带有凝
胶的聚酯胶片从上盖玻璃板上取下。UTLIEF电泳
时, 将带有凝胶的聚酯胶片放到电泳槽的冷却板上,
电泳温度设定为 10 ℃, 电压在 70 min内由 200 V
上升至 1 000 V, 整个电泳过程约 70 min。上述 3
种电泳方法使用的均是同一酯酶提取液, 每孔点样
量均为 25 µL。
酯酶同工酶染色液的配制参照Wouters 和
Booy (2000)文中的方法, 取 100 mg固蓝、50 mg
α-醋酸萘酯和 50 mg β-醋酸萘酯用 10 mL丙酮溶
解, 再加入 90 mL 0.1 mol·L-1 pH 6.5的磷酸缓冲溶
液混匀, 待溶液变为砖红色时即可用于染色, 染色
液现配现用。电泳后的胶片在染色液中染色, 褐色
酶带清晰后停止染色, 约需 30 min。
实验结果
1 酯酶同工酶电泳图谱
从用 native-PAGE电泳分离水稻种子 ‘EP431’
得到的酯酶同工酶图谱(图1)可以看到, 在水稻种子
萌发 1~6 d的过程中, 各泳道的图谱没有出现大的
差异。B带是一条弱带, 在种子萌发的过程中并没
有观察到明显变化。A带是一条强带, 但随着种子
萌发时间的延长, 可以看到A带下方的拖尾发生一
定程度的变化, 这些变化可能反映了种子萌发过程
中酯酶同工酶种类和数目的相应变化。从图 1可
以发现native-PAGE电泳对变化最显著的A带附近
的一些可能条带上并没有有效分离。
图 1 水稻 ‘培矮 64S’בEP431’的 F1种子萌发过程中酯酶
同工酶 native-PAGE电泳图谱
1~6 号泳道分别对应萌发 1~6 d的水稻种子。
图2为利用IEF电泳得到的酯酶同工酶图谱,
从中可以观察到, 在水稻种子萌发过程中, 存在 3
条酶带, 其中 2条酶带较明显, 1条酶带不够明显。
从图 2还可以看出, 在种子萌发的过程中A带和B
带的强弱变化不大, 而 C带在第 3天和第 4天较为
明显, 在其他萌发时间内却较弱或观察不到。
图 2 水稻 ‘培矮 64S’ בEP431’ 的F1种子萌发过程中酯酶
同工酶等电聚焦电泳图谱
1~6 号泳道分别对应萌发 1~6 d的水稻种子。
图3是用UTLIEF电泳得到的酯酶同工酶图谱,
从该图能观察到, 在水稻种子 1~6 d的萌发过程中
利用该法共分离出 4条酶带, 且酯酶同工酶存在较
大的多态性变化。A带和 B带在水稻种子萌发的
6天内没有发生明显的变化; C带在萌发的1~3 d内
逐步增强, 第 3天和第 4天的强度相当, 在第 5天
和第 6天又减弱; D带在种子萌发的第 1~2天内不
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月 979
存在, 而在第 3天以后出现, 且条带的强度保持稳
定。另外, 我们又利用UTLIEF电泳分析了水稻 ‘
培矮64S’בG67’的F1种子萌发时的酯酶同工酶变
化情况, 结果如图 4所示。可以看出该品种在萌发
第 1天时最少, 有 4条带; 而第 6天最多, 有 8条带;
从该图还可发现酯酶同工酶除数目发生变化外, 其
酶带的强弱也在发生着变化。
讨　　论
植物生长发育过程中同工酶电泳图谱的变化
反映了其特定时期的生理活动特点, 因而准确和深
入地研究水稻种子萌发时酯酶同工酶的变化, 对于
进一步揭示水稻种子的生命活动规律是有意义的。
目前用于同工酶检测的电泳方法较多, 主要用同工
酶分子量或等电点的差异进行分离, 如native-PAGE
电泳、等电聚焦电泳、复性电泳(G-PAGE)和十
二烷基磺酸锂电泳(LDS-PAGE)等(王爽和陈卫良
2006)。
Native-PAGE电泳时间较长, 且酶活性会有一
定程度的丧失, 如图 1所示, 染色后酶带常出现拖
尾现象, 而且染色后胶片常有较深的背景, 对于较
弱的酶带这种影响较严重。此外此法对于分子量
相近或分子量相同但等电点不同的酶蛋白, 则不能
有效分离, 上述这些因素都限制了其在水稻种子萌
发时的酯酶动态变化研究中的应用。Native-PAGE
电泳不破坏酶蛋白的结构, 并在一定程度上可以保
证同工酶的生物学活性, 因而该法目前仍用于鉴定
一些物种的亲缘关系和植物的抗逆生理研究, 如豌
豆和玉米等(Pošvec和Griga 2000; Mohamed 2005)。
常规 IEF电泳由于在制胶和电泳操作中的局限性,
得到的结果可能不很理想, 如图 2所示, 整个电泳
图谱中共显示出 3条酶带, 且不同萌发时间的酶带
未表现出差异, 这可能是由于某些酶带没有分离出
来, 这种分辨率上的局限性也影响了常规 IEF在水
稻种子萌发时酯酶同工酶研究中的应用。UTLIEF
电泳是对常规 IEF的一种改进, 它使用聚酯胶片做
为薄层聚丙烯酰胺凝胶的载体, 凝胶质量更好些, 聚
焦电泳时致冷效果更好, 电泳时间也更短, 因而能
图 4 水稻 ‘培矮 64S’ בG67’ 的 F1种子萌发过程中酯酶同
工酶超薄等电聚焦电泳图谱
1~6 号泳道分别对应萌发 1~6 d的水稻种子。
图 3 水稻 ‘培矮 64S’ בEP431’ 的F1种子萌发过程中酯酶
同工酶超薄等电聚焦电泳图谱
1~6号泳道分别对应萌发 1~6 d的水稻种子。
2 不同pH范围内两性电解质对酯酶同工酶超薄等
电聚焦电泳的影响
电泳时两性电解质在凝胶中形成稳定和线性
的 pH梯度, 因而不同等电点的同工酶可在凝胶中
形成不同的酶带。以萌发第 9天的水稻种子 ‘ 培
矮64S’בEP431’的F1种子为材料, 研究不同pH范
围(2~11、2~9、4~7、6~9)对超薄等电聚焦的
影响, 得到的电泳图谱如图 5所示。从该图可以
看出, 当两性电解质的 pH范围为 2~11和 pH 4~7
时, 能找到的同工酶标记带较少; 而pH范围6~9的
电泳图谱中, 同工酶带又不清晰; 比较而言, 当两
性电解质的 pH范围为 2~9时, 同工酶标记带较明
显和丰富, 且条带清晰, 可以作为适宜的两性电解
质。
图 5 不同 pH范围下酯酶同工酶超薄等电聚焦电泳图谱
植物生理学通讯 第 44卷 第 5期，2008年 10月980
得到更好的电泳图谱。采用与 IEF电泳相同 pH范
围的两性电解质, UTLIEF电泳能够分离出 4条酶
带。从图 3可以观察到, 在水稻种子萌发的 1~6 d
内, 酯酶同工酶的数目变化较明显, 同一酶带在不
同萌发天数里的有无和活性强弱也较常规IEF更为
明显, 酯酶的这些变化可以间接地反映种子萌发时
相关基因表达的差异。另一品种 ‘培矮64S’בG67’
的杂种F1研究表明, 不同品种间酯酶同工酶的数目
和活性强弱的差异也很大, 从图 4可以观察到 ‘培
矮 64S’בG67’的杂种F1酶带数萌发第 1天有 5条,
而第 6天有 8条, 这进一步说明水稻种子萌发时酯
酯同工酶具有较高的多态性。
目前用上述方法分离同工酶用以鉴定植物亲
缘关系和检测品种纯度的研究较多, 而分析植物种
子发育过程的研究较少。本文用这 3种方法研究
了水稻种子发育过程中酯酶同工酶的变化, 根据电
泳结果和操作过程的比较, 认为UTLIEF电泳分辨
率更高、更快速, 是研究水稻种子萌发时酯酶同工
酶变化中比较好的方法。
参考文献
丁玲, 陈发棣, 滕年军, 房伟民(2007). 菊花不同生长阶段不同器
官 P O D 和 E S T 同工酶比较. 西北植物学报, 2 7 ( 1 0 ) :
2029~2034
胡群宝, 夏清华, 陈森(2004). 用等电聚焦技术鉴定杂交稻华优桂
99的种子纯度. 植物生理学通讯, 40 (5): 597~598
王爽, 陈卫良(2006). LDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析植物过氧化
物酶同工酶. 植物生理学通讯, 42 (4): 713~716
Arulsekar S, McGranahan GH, Parfitt DE (1986). Inheritance of
phosphoglucomutase and esterase isozymes in persian walnut.
J Hered, 77 (3): 220~221
Brown JK, Coats SA, Bedford ID, Markham PG, Bird J, Frohlich
DR (1995). Characterization and distribution of esterase
electromorphs in the whitefly, Bemisia tabaci (Genn.)
(Homoptera: Aleyrodidae). Biochem Genet, 33 (7): 205~
214
Collet S, Collet M, Machado M (2005). Differential gene expres-
sion for isozymes in somatic mutants of Vitis vinifera L.
(Vitaceae). Biochem Syst Ecol, 33 (2): 691~703
Mohamed AA (2005). Two-dimensional electrophoresis of soluble
proteins and profile of some isozymes isolated from maize
plant in response to NaCl. Res J Agr Biol Sci, 1 (1): 38~44
Pošvec Z, Griga M (2000). Utilization of isozyme polymorphism
for cultivar identification of 45 commercial peas (Pisum
sativum L.). Euphytica, 113 (3): 249~256
Pretová A, Obert B, Hajduch M, Gregová E (2001). Total protein
and isozyme characterization in the flax zygotic embryo
during development. Sexual Plant Rep, 13 (6): 329~334
Tabaeizadeh Z, Ferl RJ, Vasil IK (1986). Somatic hybridization in
the gramineae: Saccharum officinarum L. (sugarcane) and
Pennisetum americanum (L.) K. Schum. (pearl millet). Proc
Natl Acad Sci USA, 83 (15): 5616~5619
Wouters TCAE, Booy G (2000). Stability of esterases and total
proteins during seed storage of perennial ryegrass (Lolium
perenne L.) and their use for cultivar discrimination. Euphytica,
111 (3): 161~168
Zhao T, Yan M, Lu YP, Yang F, Huang J, Wang XF (2005).
Genetic purity testing of two-line hydrid rice seeds by ul-
trathin-layer isoelectric focusing of proteins. Seed Sci
Technol, 33 (1): 45~52