全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月 785
收稿 2006-03-29 修定 　2006-05-25
资助 农业部农业结构调整重大技术研究专项(05-09-2A)。
* E-mail: aaahs78@163.com, Tel: 0898-23301306
橡胶树花药的培养
孙爱花* 李哲 黄天带
中国热带农业科学院橡胶研究所，农业部热带作物栽培生理学重点开放实验室，海南儋州 571737
Anther Culture of Rubber Tree (Hevea Brasiliensis Muell. Arg)
SUN Ai-Hua*, LI Zhe, HUANG Tian-Dai
Key Laboratory of Ministry of Agriculture for Tropical Crop Physiology, Rubber Research Institute, Chinese Academy of Tropical
Agricultural Sciences, Danzhou, Hainan 571737, China
提要 文章介绍橡胶树的花药培养和影响其培养因素的研究进展，并指出这项技术的应用前景。
关键词 橡胶树；花药培养
自从1964年 Guha和 Maheshwari报道毛叶蔓
陀罗(Datura innoxia)花药培养获得单倍体植株以
来，花药培养已成为获得单倍体及纯合体的途径
之一。由于橡胶树生命周期长，又是异花授粉作
物，在遗传上高度杂合，并且在农作物中行之有
效的某些重要育种技术长期未能在橡胶树上得到应
用。通过花药培养诱导花粉植株，为橡胶树单倍
体育种、多倍体育种，充分利用杂种优势，培
育产量高、抗性强而生长快的优良品种，展示了
广阔的前景，并为研究各种经济性状的遗传规律
提供了优良材料。通过花药培养诱导二倍体植
株，可以获得自根幼态无性系，排除不良砧木的
影响，提高产量；可以获得抗寒性强而一致的优
良砧木，减少寒害；也可获得均一的材料，供
科研使用，并为橡胶树的良种繁育提供一条值得
考虑的途径。
在分子生物技术迅速发展和日趋成熟的今天，
花药培养的应用领域不断扩大，其研究意义日益
突出。本文对国内外橡胶树花药培养的研究现状
及影响花药培养的主要因素进行了概述，并对花
药培养存在的问题及其应用前景作了分析和探讨。
1 橡胶树的花药培养
20 世纪 70 年代以来，我国、马来西亚、印
度尼西亚、斯里兰卡等国采用离体花药相继成功
地培育出花粉单倍体及花药壁二倍体植株，此后
关于这方面的研究得到了迅速发展，获得了来自
橡胶树花药壁的二倍体组织和花粉多细胞球，并
证 明 橡 胶 树 的 小 孢 子 是 可 以 启 动 发 育 的
(Satchuthananthavale和Irugulbandara 1972; Satchu-
thananthavale 1973)。我国从1973年开始橡胶树花
药培养的研究工作，于 1977 年培养出数棵植株，
但经移栽未能成活；1977~1978 年，有人先后从
‘海垦2’和‘热研88-13’2 个品种中诱导出161
棵植株，并移栽成活(王泽云等1978)。到1979年
底，已从‘海垦2’、‘海垦1’、‘热研8 8-1 3’等品
种中诱导出完整植株 137 棵，移栽成活率提高到
69%，组织学和细胞学研究证明，花药植株起源
于花药壁的体细胞(王泽云等 1980，1984)。
Paranjothy和Ghandimathi (1975，1976)从花
药培养试验中获得胚状体，但未再生植株。陈正
华等 (1978，1979)从三叶橡胶花药培养中获得5
棵植株，并证明来源于花粉。岑明等(1981)对花
药胚状体和小植株根尖进行细胞学观察证明，所
获得的胚状体和小植株确实来源于花粉，而且从
胚状体到小植株这一段时间内，染色体数有逐渐
增加的趋势，往往是以 9 的倍数增加。
王泽云等(1989)认为橡胶树花药体细胞植株集
芽接树和实生树的优点于一体，是一种幼态自根
无性系，表现出生长快、产量高和发育时期从老
植物生理学与农业及生产应用 Plant Physiology and Agriculture and Applications
植物生理学通讯 第42卷 第4期，2006年8月786
态回复到幼态等优点，也是一种很有发展前途的
新一代种植材料。吴胡蝶等(1994)研究 6-BA 和
ABA 影响橡胶花药体细胞胚形成及植株再生的结
果表明，培养基中加入 6-BA 后，橡胶树体细胞
胚和植株的诱导率提高。其作用可能是促进胚胎
原始细胞的发育或是消除愈伤组织中残留2,4-D对
胚胎原始细胞发育的抑制作用。但添加的浓度要
适宜，浓度过高，活性太强，胚状体发育反而受
阻，不能达到提高植株诱导率的效果，一般以2~5
mg·L-1 范围的 6-BA 较适宜；添加0.2~0.5 mg·L-1
的 ABA 也可明显提高胚状体的数量、质量以及植
株的诱导率。可见，ABA 对橡胶花药体细胞的形
成和植株再生也有良好的效应。杨少琼和莫业勇
(1994)对生长在系比区内的2个巴西橡胶无性系的
花药体细胞植株产量和生理特性进行初步检测和观
察的结果表明，‘海垦 2’花药体细胞植株的第
一割年的产量高于供体无性系 45.2%，与胶乳再
生和排胶有关的10项生理参数的分析都显示其具
有与高产相适应的生理基础；‘海垦1’花药体细
胞植株的产量高于供体无性系20.6%，但此产量主
要是通过胶乳严重长流获得的，有一定的缺憾。
Arokiaraj等 (1994，1996，1998)应用农杆菌
介导和基因枪法，成功地将 b- 葡萄苷酸酶(GUS)
和新霉素磷酸转移酶(nptII)等基因导入橡胶树花药
的愈伤组织，并获得完整植株。曾宪松等(1997)
用0.5%的秋水仙素处理橡胶树二倍体花药体细胞
愈伤组织(浸泡或滴渍) 1 d，可有效地从多倍性的
细胞再分化成多倍性胚状体并再生植株。梁国平
和肖三元(2004)对几个橡胶品系的花药进行离体培
养，从中筛选出易获得诱导率高、质量好胚状体
的橡胶品种‘云研73-477’，其胚状体的诱导率达
到76.83%，诱导出完整植株37株，成苗率16.9%，
移栽成活 21 株，成活率 56.8%，为进一步开展
橡胶树花药培养研究提供了较好的品种材料。
2 影响花药培养的因素
2.1 材料 用作花药培养的亲本植株的基因型、生
理状态以及接种时花粉所处的发育时期等对植株的
诱导频率有直接影响，因此在接种前应对所用的
材料进行严格的选择。
2.1.1 基因型 供体植株的基因型是影响花药培养
的关键因素，不同基因型植株的花药对培养的反
应不同，表现在花药培养力如愈伤组织诱导率、
分化率、胚状体诱导率及植株诱导率等，有些材
料对某些培养基没有反应。目前培养成功的植物
种类以茄科、禾本科和十字花科的植物所占比例
较大，从大麦、小麦、大豆、亚麻等作物进行
研究都证实，不同基因型植物的花药诱导能力和
器官形成能力有差异，即存在明显的基因型效应
(朱睦元等1990；Kintzios 和 Fischbeck 1994；
Kiviharju和Tauriainen 1999)。在橡胶树花药培养
中，只有少数橡胶树无性系能通过花药培养产生
大量植株，这些无性系有：‘P R 1 0 7’、‘G T 1’、
‘海垦 2 ’、‘海垦 1 ’、‘热研 8 8 - 1 3 ’、‘热
研7-33-97’等(王泽云等 1978，1980；Carron
等1998)。黄德贵等(1982)研究不同花药材料对诱
导反应的结果表明，不同材料对基本培养基的适
应程度不同，而且对同一培养基不同附加成份的
适应程度也有差异。许多抗寒力较强的材料诱导
愈伤组织比较困难，而许多愈伤组织诱导率很高
的材料又很难分化出胚状体或植株。因此认为，
选择合适基因型的橡胶树无性系对花药离体培
养诱导再生植株的成败起着重要作用。
2.1.2 生理状况 不同生长季节、栽培环境、不同
部位的花蕾导致其花粉的生理状态均可能不同，
诱导率有明显差异。一般认为，采集自适宜环境
条件下的供体植株花药培养的胚诱导率和植株再生
率高，从季节上看，冬春季较夏秋季更适于进行
花药培养(Yang等 1992)。王泽云等(1978，1980)
认为不同花期橡胶树的花药分化能力也不同，虽
然春、夏、秋三季的花都能诱导出胚状体，但
其数量则是秋花多于春、夏花。
2.1.3 花粉的发育时期 选择合适的花粉发育时期
是提高花粉植株诱导频率的重要因素。被子植物
的花粉发育经历四分体时期、单核期(小孢子阶
段)、双核期和三核期(雄配子阶段)，单核期又可
分为单核早、中、晚 3 个时期。在花药培养早
期的研究中发现，并不是任何时期的花粉都可以
培养产生愈伤组织或胚状体，只有花粉发育到一
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定时期对离体的刺激才最敏感。然而，对大多数
植物而言，单核中期至单核晚期的花粉最容易形
成花粉胚或花粉愈伤组织(卫志明2003)。在橡胶
树育种中，许多研究者也认为单核晚期( 长度
3 ~ 4 m m )的花粉最容易培养(王泽云等 1 9 7 8，
1980，1984；陈正华等 1978，1979；黄德贵
等 1982)。
2.1.4 预处理 花药预处理对提高胚状体诱导频率
有很好的效果，不同作物所用的处理方法不同。
一般采用30~35℃高温或3~10℃低温对花蕾进行
处理的效果较好。其它预处理方法如浸泡和离心
等也有人研究和尝试过(李靖等2005)。目前，低
温处理花粉胚胎发生能力的机制有2种不同看法。
Nitsch和Norreel (1973)认为低温处理改变花粉粒第
1 次有丝分裂的轴向，从而导致花粉朝着胚胎的
方向发育；而Sunderland (1978)则认为低温的作
用不在于改变纺锤轴取向，而是保持花粉的活
力，因而营养细胞得以完成细胞质的改组转向胚
胎发生。此外，低温预处理也能延缓花药壁组织
的衰老和降低花粉的死亡率( 王伟光和高亦珂
2005)。黄德贵等(1982)在探索低温处理对橡胶树
花药形成愈伤组织的效应中见到，经低温处理的
花药愈伤组织诱导率有明显提高，他们还观察
到，一般容易诱导愈伤组织的品种或是采用含生
长调节物质较高的培养基，低温处理的作用即不
显 著 。
2.2 培养基
2.2.1 基本培养基 选择合适的基本培养基是花药
培养技术的重要环节之一。林木花药培养所采用
的基本培养基有 M S、N i t s c h、B 5、B N、B H、
MB、N 6、Miller、H。较为常用的是 MS、BN、
H、MB 培养基(张冰玉等 2003)。许多研究者认
为，诱导橡胶树花药愈伤组织的基本培养基以
M S 或 M B ( M S 培养基的大量元素和铁盐，用
Bourgin 及Nitsch烟草培养的微量元素及有机生长
物质)较好(王泽云等 1978，1980，1984；陈正
华等1978，1979)。黄德贵等(1982)认为诱导花
药愈伤组织的基本培养基 MB 的效果比 MS 好。陈
正华等(1986)也认为 MB 的诱导效果好。MS 培养
基是一种高盐培养基，特别是含 N H 4 + 的浓度较
高。有研究表明，高浓度 N H 4 + 可促进橡胶树花
药培养时的胚状体发生，低浓度 NO3- 可提高其花
粉胚状体的诱导率(陈正华1986)。
2.2.2 碳源 林木花药培养主要以蔗糖为碳源。因
树种不同，所用蔗糖浓度有很大差别(2%~10%)。
为了得到较高的橡胶树花药胚性愈伤组织诱导率和
胚状体诱导率，国内的很多学者单就不同浓度蔗
糖效应作过探讨。陈正华(1988)研究三叶橡胶的
花药培养的结果表明，在脱分化培养基中添加
2%~10% 蔗糖均可促进花药愈伤组织分化，但组
织学观察表明，接种25 d后的小孢子存活率是添
加 10% 蔗糖比添加 3% 蔗糖高 1 倍以上，最适浓
度为 7 % ~ 8 % 。
2.2.3 激素 在花药培养的不同时期，所用的生长
调节物质种类和浓度不同。在脱分化培养基中细
胞分裂素类物质与生长素类物质共同使用对诱导愈
伤组织十分重要，缺少其中之一，花药诱导均不
能成功。经常使用的生长素类物质有 2 , 4 - D 、
I A A、N A A，细胞分裂素类物质有 K T、6 - B A，
其浓度范围有0.5~2.0 mg·L-1不等。在分化培养基
中，细胞分裂素类物质对愈伤组织的分化有十分
重要的作用，也应与生长素类物质配合使用。一
般而言，加入 0.5~1.0 mg·L-1 2,4-D、0.5~1.0
mg·L-1 KT 均可促进橡胶树花药胚性愈伤组织的诱
导，加入0.1~0.2 mg·L-1 NAA、0.2~1.0 mg·L-1
KT、0~0.5 mg·L-1 GA3 能显著促进胚状体增长(王
泽云等1978)。添加0.2~0.5 mg·L-1的 ABA也可明
显提高胚状体的数量、质量以及植株的诱导率(吴
胡蝶等1994)。刘桂珍和陈正华(1999)在悬浮培养
基中加入1.0 mg·L-1 2,4-D即能促进胚胎发生。
2.2.4 活性炭 活性炭在花药培养中有普遍提高出
苗率的作用(Fridborg和Eriksson 1975；Johansson
等 1982)。在橡胶树花药培养中，添加适量的活
性炭，可以降低组织培养物产生的有害代谢物质
的浓度，从而有利于细胞生长。在脱分化培养基
中增加生长调节剂的情况下，再添加 0 . 0 5 % ~
0.1% 活性炭，可成倍提高‘RRIM600’等品种
的愈伤组织诱导频率；在分化和出苗培养基中各添
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加 0.1% 活性炭，可提高分化频率；有的胚状体
可增长数倍，植株增长 1 倍(王泽云等 1988)。
除了上述 4 种影响培养基效果的因素外，天
然附加物椰子汁(coconut water，CW)对提高橡胶
树花药胚性愈伤组织和胚状体诱导率也有作用。
2.3 培养方法和培养条件 花药培养的方式一般采
用固体培养基培养，但近年来也有许多用液体培
养基培养花药。还有人采用悬浮细胞培养获得巴
西橡胶的胚状体(Wilson和Street 1975；Wilson等
1976)。Veisseire等(1994)用类似方法虽然获得了
胚状体，但均未得到小植株。刘桂珍和陈正华
(1999)用悬浮细胞培养方法成功地获得巴西橡胶胚
状体及再生植株。
培养条件中最重要的是温度。橡胶树花药培
养的培养温度一般为 25~28℃，诱导愈伤组织和
胚状体阶段，应在黑暗条件下，而在胚状体诱导
幼苗阶段则应照光，可用日光灯每天照明 12 h，
光强为45 mmol·m-2·s-1。
2.4 植株的诱导和移栽 橡胶树花药培养植株诱导
中有3个关键步骤：(1)花药接种在脱分化培养基
中，促使花药愈伤组织化；(2)愈伤组织化的花药
转移至分化培养基上，诱导产生胚状体；(3)肉眼
可见的胚状体转入成苗培养基上，促使其生根、
抽茎、生叶、成为小植株。促使花药植株移栽
成活，一般需要注意以下几个问题：(1)要有发育
良好的根系；(2)掌握适宜的时机，不可过早移
栽；(3)移栽苗前锻炼；(4)室内温度、湿度和光
照应适宜；(5)成活的苗应进行野外锻炼。
3 结语
花药培养是橡胶树组织培养中研究较早和较
多的一个方向，也是橡胶树遗传转化的重要途径
(谭德冠等2005)。至今，虽已获得了一定数量的
花药植株，但与农作物相比，其发展比较落后。
主要原因是花药植株的诱导率在总体上比较低，
不能形成足够的选择群体；另外，橡胶树花药培
养对基因型的依赖性较强，性状优良的某些品种
很难诱导出花药植株。因此限制了花药植株在橡
胶树育种及遗传研究中的进一步应用。
鉴于橡胶树花药培养的落后局面和巨大应用
潜力，除应加强这一领域的研究力度以外，以下
几个问题值得今后研究与考虑：
(1)根据花药植株的利用目的不同，可选择具
有代表性的品种进行花药培养，综合运用各种手
段提高花药植株的诱导率。同时，应用分子生物
学手段进行花药培养的基础性研究，从根本上找
出基因型影响花药植株诱导率的原因。
(2)在提高花药植株诱导率的基础上，将花药
培养技术与细胞离体筛选、诱变、转基因技术相
结合，在短时间内，培育高抗优质的橡胶树新品
种。特别是以花药培养单倍体愈伤组织或单倍体植
株作为转化受体，以实现外源基因的稳定转化。
(3)在提高花药植株诱导率的基础上，构建双
单倍体群体，从而为分子标记、遗传图谱的构
建、基因克隆以及各种遗传学研究提供理想的研
究材料。
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