全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月 515
收稿 2005-11-24 修定 　2006-05-15
资助 国家自然科学基金(30560062)和云南省烟草公司项目
(03A0 1、051 5)。
* 通讯作者(E-mail: lwz67@163.com, Tel: 0877-2056548)。
抑制消减杂交技术及其在植物基因表达研究中的应用
董霞1,2 李文正3,* 刘世贵2
1 云南农业大学东方蜜蜂研究所，昆明 6502013；2 四川大学生命科学学院，成都 610064；3 云南省烟草科学研究所，
云南玉溪653100
Suppression Subtractive Hybridization Technique and Its Application in Gene
Expressing of Plant
DONG Xia1,2, LI Wen-Zheng3,*, LIU Shi-Gui2
1Eastern Bee Research Institute,Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China; 2College of Life Science, Sichuan University,
Chengdu 610064, China; 3Yunnan Tobacco Science Research Institute, Yuxi, Yunnan 653100, China
提要 抑制消减杂交技术以其低假阳性率、高灵敏度等优点，越来越多地应用于植物不同发育阶段、植物突变体、不同
外界因素即非生物因素和生物因素造成植物基因差异表达的研究。文章就此领域的研究进展作介绍。
关键词 抑制消减杂交(SSH); 植物; 基因差异表达
基因是细胞的遗传物质，决定细胞的生物学
性状。细胞的生物学功能最终是由大量的基因表
达产物即蛋白质完成的。基因表达是一个复杂而
精细的网络调控过程，其变化是调控细胞生命活
动过程的核心机制。高等真核生物约含有10万个
不同基因，但在生物体的发育过程中只有 15% 的
基因得以表达，而这大约有15 000个基因的表达
是按时间和空间顺序有序地进行的，此种表达方
式即为基因的差别表达(differential expression)。植
物在不同生长发育阶段的不同类型细胞中基因的表
达具有一定的差异性(Liang和Pardee 1992)，当植
物受到外界因素影响时，基因表达也会发生不同
程度的改变。比较不同细胞、不同基因型、不
同外界条件下基因表达上的差异，是研究生命过
程分子机制的基础和分离克隆目的基因的前提，
而明确植物不同类型的细胞在特定内因或外因条件
下的基因表达及其调控过程，将对人类控制或改
变其生理与病理状态提供一定的帮助。
1 植物差异表达基因相关的研究技术
(1)差异显示PCR (differential display PCR, DD-
PCR)是应用特定引物对目的 mRNA 进行反转录，
电泳后找出差异条带(Liang和Pardee 1992)。此技
术简单、快速、灵敏度高、RNA 用量少(0.2~2
mg)、可同时比较两组以上的样品，但存在假阳
性率高，一般大于 70% 和反转录获得的 DNA 绝
大部分仅是mRNA 3 端的非翻译区，给鉴定带来
困难(Bertioli等1995；Sompayrac等1995)。
(2) cDNA代表性示差分析技术(cDNA-repre-
sentational difference analysis, cDNA-RDA)是在
Lisitsyn等(1993)的基因组DNA示差分析技术基础
上经Hubank和Schatz (1994)改进的方法，其特点
是将 PCR 技术与差减杂交技术相结合，通过 PCR
作用选择性扩增目的片段。此技术有更高的富集
效率，得到的可以扩增的 cDNA 代表着全基因组
的信息，假阳性率低；但存在富集片段短，检
出低丰度 m R N A 受限的缺陷。
(3) RNA指纹技术(RNA fingerprinting)是由
Welsh 等(1992)建立的与DDRT-PCR 相似的方法，
但克服了其只能获得mRNA 3 端序列缺陷，并有
可能得到 cDNA 中段的差异表达序列片段，从而
可获得全长的 c D N A。
(4)基因系列表达分析(serial analysis of gene
expression, SAGE) (Velculescu等1995)是能单独鉴
别1个转录子的核苷酸序列标签和连接短序列标签
对其进行克隆鉴定，能对大量转录子进行分析的
技术，但难用于两两差异表达基因的分析。
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(5) cDNA微阵列(DNA microarray或gene chip)
(Schena 等 1995)技术可将cDNA 文库中的序列分
离固定于支持物上，同时检测比较样品中众多序
列的表达情况和分析基因表达谱，有可自动、定
量、快速检测目的材料中上万个基因的表达情况
等优点，但也存在费用高昂、工作量大、会有
假阳性结果出现等缺陷。
尽管上述方法均有各自的优缺点，但总的来
说筛选差异表达基因的方法已从既费时又费力的方
法(如聚丙酰胺凝胶为基础的差异显示)发展到自动
高通量检测方法( 如 D N A 微阵列) 。消减杂交
(subtractive hybridization, SH)是一种富集差异表达
基因的有效方法(Wan 等 1996)，但因为需要大量
的 mRNA 进行杂交，杂交后的微量 cDNA 进行克
隆亦较困难，所以Duguid和Dinauer (1990)在cDNA
后加上接头，即可以进行选择性 P C R 扩增。为
了克服基因上调表达造成的不良后果，Diatchenko
等(1996)又进一步改进了抑制性杂交 PCR 技术，
提出一种克隆基因的新方法——抑制性消减杂交
(suppression subtractive hybridization, SSH)，经过
几轮循环可以将差异表达基因扩增1 000 倍。
2 SSH的原理
SSH 是抑制 PCR 与差减杂交技术相结合的更
为简单而快速的分离差异基因的方法。此方法运
用了杂交二级动力学原理，即丰度高的单链 DNA
在退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链
DNA，从而使原来在丰度上有差别的单链 DNA 相
对含量基本达到一致。而抑制 PCR 则是利用链内
退火优于链间退火的特点，使非目的序列片段两
端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结
构，无法作为模板与引物配对从而选择性地抑制
非目的基因片段的扩增。这样既利用了差减杂交
技术的差减富集，又利用了抑制 PCR 技术进行了
高效率的动力学富集(刁丰秋1998；陆秋恒和罗志
勇 2001)。其基本步骤为：提取 2 种不同细胞的
mRNA为驱动组(driver)和检测组(tester)，反转录
成 cDNA，分别用同一种识别四碱基序列的限制
酶如 R s a I 消化，以产生大小适当的平头末端
c D N A 片段，将检测组 c D N A 分成均等的 2 份，
各自接上 2 种接头，与过量的驱动组 cDNA 变性
后退火杂交，第 1 次杂交后有 4 种产物：a 是单
链检测组 cDNA，b 是自身退火的检测组 cDNA 双
链，c 是检测组和驱动组的异源双链，d 是驱动
组 cDNA。第 1 次杂交的目的是实现检测组单链
cDNA均等化(normalization)，即使原来有丰度差
别的单链 cDNA 的相对含量达到基本一致，由于
检测组 cDNA 中与驱动组 cDNA 序列相似的片段大
都和驱动组形成异源双链分子 c，使检测组 cDNA
中的差异表达基因的目标 cD N A 得到大量富集。
第 1 次杂交后，合并 2 份杂交产物，再加上新的
变性驱动组单链，再次退火杂交，此时，只有
第1次杂交后经均等化和消减的单链检测组cDNA
和驱动组 cDNA 一起形成各种双链分子。这次杂
交进一步富集了差异表达基因的 cDNA，产生了
一种新的双链分子e，它的2个5端有2个不同的
接头，正由于这 2 个不同的接头，所以其在以后
的 PCR 中可有效地得到扩增(BD Biosciences
Clontech: http://www.bdbiosciences.com/clontech)。
虽然 SSH 技术仍然有一些缺陷，如不能同时
比较多个样品；为了保证结果的准确性，杂交样
品的遗传背景只在某一方面不同；对 RNA 来源困
难的样品有限制；得到的EST (expressed sequence
tags)序列不是全长cDNA (Diatchenko等1996)，但
由于 SSH 综合了 DD-PCR 和 cDNA-RDA 2 种技术
的特点，因此它有 2 项技术各自的优点，且相应
地改进了各自的缺点。SSH 技术很大地降低了假
阳性率，von Stein (1997)的研究表明其阳性率可
达到 94%。由于 SSH 方法所做的均等化和目标片
段的富集，使它具有高灵敏度，可以检出 D D -
PCR 和 cDNA-RDA 中不易被检出的低丰度表达的
m R N A 。另外，S S H 的速度快，效率高，一次
SSH反应可以同时分离几十或成百个差异表达基因
(陆秋恒和罗志勇2001)。
3 SSH技术在植物研究中的应用
SSH 技术构建的cDNA 文库中包含大量的EST
序列，能高效、快速、大规模地得到差异表达
的基因序列片段，从中获得新的 cDNA 序列，结
合 R A C E 、原位杂交等方法获得全长基因。自
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1996年报道以来，该技术已广泛应用于分子遗传
学和定向克隆的研究中，如鉴别病理变化、不同
生物体生长发育和组织分化中的基因表达变化、
不同基因型的植物的基因表达变化、外界因素诱
导使植物产生差异表达的基因(如机械伤害、胁
迫、激素、重金属污染、外源微生物、昆虫)等。
3.1 外界非生物因素引起的植物基因差异表达
3.1.1 外源化学物质的诱导 外源化学物质的诱导
会引起植物基因表达的变化。SSH 技术是一项有
效分离差异表达基因的技术，在植物受到有利化
学物质诱导引起基因差异表达及基因克隆有如下研
究。Kang等(2003)在水杨酸(salicylic acid, SA)诱
导的拟南芥超量表达株系 cDNA 中，采用 SSH 技
术克隆到OBF-binding protein 3 (OBP3)应答基因
(ORGs)，其中 ORG1 和 ORG4 是新基因，ORG5
是伸展蛋白基因，O R G 4 在数据库中无同源蛋
白，ORG1 与细胞分裂调控因子和原纤维蛋白只
有极低的同源性。ORG2 和 ORG3 的氨基酸序列有
80%的同源性并含有一个碱性螺旋-环 -螺旋 DNA
结合区，提示 OR G 2 和 O R G 3 可能是转录因子。
O R G 1、O R G 2、O R G 3 均受 S A 诱导上调表达，
而茉莉酸(jasmonic acid，JA)则诱导下调表达，
SA不仅在植物防御中起作用，还能提高植物抵抗
非生物胁迫的能力(王利军等2002)。以环割2年
的橡胶树(Hevea brasiliensis)无性系7-33-97为材
料，曾日中等(2003)构建了外源JA刺激下橡胶树
胶乳与未处理橡胶树胶乳差异表达的cDNA消减文
库。他们随机选取 25 个阳性克隆进行测序，在
其中10条 EST片段中可找到碱基序列相似性大于
80% 以上的同源基因序列，其余15 条 EST 为没有
任何功能线索的未知序列。此项研究为开展以JA
调控橡胶树胶乳代谢和橡胶生物合成的分子机制研
究建立了基础。V e r i c a 等( 2 0 0 4 )在可可树
(Theobroma cacao L.)受苯并噻二唑(benzothiadiazole,
BTH)、表面活性剂 Silwet-L77、甲基茉莉酸
(methyl jasmonate, MeJA)诱导的SSH文库中，用
微阵列杂交分析、高通量测序和生物信息分析确
定有无信号分子诱导的基因，并分离得到1 256个
克隆，其中有 330 个代表可可叶防御激发表达的
基因。Wang 等(2002)用硝酸盐处理水稻(Oryza
sativa)，经反转录得到 cDNA，通过正向和反向
筛选确定了37个已知基因和55个新基因在供给硝
酸盐的根中有较强的上调表达，此种已知基因涉
及氮的吸收同化、糖的运输和有机酸代谢、信号
与传导、蛋白质合成与分解、植物防御、激素
代谢和细胞分裂。大多数基因在供给硝酸盐的根
中表达比缺少硝酸盐的根强烈，说明硝酸盐可能
调控这些基因的表达。Chen等(2002)从三十烷醇
诱导水稻的 SSH 文库中分离到受其调控的基因，
测序结果显示，多数上调基因编码光合和光修复
蛋白，2 个下调基因编码 ABA 和与胁迫相关蛋白
及机械伤害相关的蛋白，说明三十烷醇能增强光
合作用，削弱胁迫因素的影响。为了研究植物保
护剂(safener)的分子机制，Rishi等(2004)构建了
由除草剂保护剂 Conc ep - I I I 诱导的杂交杨树
(Populus nigra × P. maximowiczii)的SSH文库，
分离鉴定到Concep-III诱导引起差异表达的基因，
它们编码保护剂所作用的不同阶段的蛋白：氧
化、结合、淬灭，同时还发现新的可能与除草
剂解毒、耐受相关的基因。
3.1.2 外界胁迫的影响 植物在不良环境条件影响
下，基因表达会发生一系列的变化，最终导致植
物体内生理生化的反应，以应答逆境的胁迫。在
不同逆境因子所导致的不同植物的基因差异表达
中，可得到抗逆境胁迫的特异表达基因。
植物受到水分胁迫时能作出多种抗逆性反
应，除气孔关闭和蒸腾下降外，还有渗透调节能
力和抗氧化能力均提高，并产生抗逆蛋白和合成
ABA 等，有的反应需要基因表达实现(杨洪强等
2001)。为了研究水分胁迫引起基因表达的变化，
Zheng等(2004)用 SSH和 cDNA微阵列技术分离了
玉米(Zea mays)苗受水分胁迫诱导的基因，分析了
960 个克隆。通过对差减 cDNA 文库的筛选，确
定了 533 个克隆是受水分诱导表达的，测序后经
聚类分析和 BLAST 比对，得到 190 个特殊的 EST
序列。王转等(2003)以抗旱小麦品种‘旱选 10
号’(‘晋麦 5 号’)为实验材料，水培的幼苗长至
一叶一心后，将其放在20℃生长箱中水培48 h的
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作为驱动组，以 PEG-6000 水溶液胁迫培养 48 h
的作为检测组进行抑制差减杂，以正向和反向差
减杂交后的 cDNA 为探针筛选 SSH 文库，测序后
获得不重复的EST序列101个。Jiang等(2004)从
400 个重组克隆中筛选到21个在甘露醇渗透胁迫
下的梭梭草(Haloxylon ammodendron)差异表达的
cDNA 序列，有2个序列可能是与干旱相关的新基
因。Sahr等(2005)报道在73个拟南芥(Arabidopsis
thaliana)受重金属铯胁迫差异表达的基因中大部分
是防御、解毒、运输、平衡和基础代谢的蛋白
质，以及控制转录和翻译的蛋白质。Liao等(2003)
在用SSH技术构建大豆(Glycine max L. Merr.和G.
soja) NaCl胁迫文库的基础上，结合RACE (5 and
3 rapid amplification of cDNA ends)，克隆到1个
新的基因，即Glycine max purple acid phosphatase-
like 基因(GmPAP3)，通过分子克隆、多基因分
析和基因表达差异研究的结果表明该基因的生理功
能与大豆适应NaCl胁迫有关。Watt (2003)对氧化
胁迫下甘蔗(Saccharum spp. 与 cv. N19杂交)铝应
答基因的鉴定和表达分析所得到的50个上调表达
的 cDNA 序列中，有 14 个参与环境信号传递和基
因表达调控，2 8 个的功能未知。
Cho等(2004)所分离的水稻(Oryza minuta)受到
机械损伤(针扎)的差异表达基因，其主要参与亚
细胞定位、代谢、细胞保卫和防御、转录等生
理活动，这些与抗性相关的 EST 序列可用于水稻
野生品种防御机制的研究，并可能会为研究改进
栽培稻种质提供新的途径。Banh等(2001)从冷处
理的大麦(Hordeum vulgare L.)的SSH文库中分离
到大量的低温诱导基因，获得 160 个大麦低温诱
导(barley low temperature-induced, blti) cDNA克
隆。Northern 杂交分析表明，有的blti克隆在受
到低温、NaCl、脱水和 ABA 处理时呈现表达差
异；其中有一个 944 个核苷组成的具有开放阅读
框的全长cDNA 序列 blti2，它的 492 个核苷编码
164个氨基酸。分析核苷酸序列，没有找到blti2
的同源基因；而所推导的氨基酸序列表明，blti2
含有3个跨膜区，这说明blti2是一个新的受低温
诱导的大麦膜贯通蛋白。
3.2 不同发育阶段的差异表达基因 植物在不同发
育阶段的基因表达会有改变，SSH 技术不仅能得
到大量的差异表达基因，还可以用于分离特定发
育阶段特殊表达的新基因。
3.2.1 营养器官发育过程差异表达基因的分离 在
与根发育相关基因中，Bouton 等(2005)用苜蓿
(Medicago truncatula)胚根萌发前和萌发后的胚轴
构建了 SSH 文库，获得一个编码 132 个氨基酸并
富含脯氨酸蛋白的基因(MtPPRD)。MtPPRD 虽然
在蛋白质水平上与植物脂转移蛋白(LTPs)的同源性
低(21%~23%)，但它具有所有植物 LTP 都有的保
守的 8 个半胱氨酸残基，这是一个与运载疏水分
子相适应的疏水孔结构，该基因在苜蓿胚轴发育
期特异性表达。Bassani等(2004) 在玉米根伸长期
优先表达并与根部伸长相关的基因中分离到150个
非冗余cDNA克隆，Northern 杂交分析得到41个
差异表达和几个候选基因。罗志勇等(2003)在一
年和四年生人参(Panax ginseng C. A. Meye)根组织
中构建了 SSH 文库，对其中筛选到的 40 个阳性
cDNA 克隆进行酶切、PCR、反向 Northern 杂交
鉴定、DNA 测序以及核苷酸序列同源性比较，从
中筛选出 6 个无对应同源基因的差减克隆，显示
它们是代表新的基因序列的。他们又用Northern
印迹杂交验证和半定量 RT-PCR 进一步验证确认，
6 个转录本为根发育阶段的差异性表达基因。从
而提示它们在人参皂苷生物合成中发挥可能作用，
这些结果为克隆上述新基因cDNA全长序列和深入
鉴定其在人参皂苷生物合成中的功能提供了实验基
础。
Faivre-Rampant等(2004)用SSH技术构建富集
马铃薯(Solanum tuberosum)块茎顶芽解除休眠上调
表达基因的 cDNA 文库，得到 385 个代表不同基
因的 cDNA 序列，从中鉴定了一个编码激素应答
基因家族成员的 cDNA (ARF6)，并研究其表达的
结果表明，在休眠芽中该基因不表达。Hinderhofer
和Zentgraf (2001)从拟南芥叶片衰老期间差异表达
的基因中克隆到 WRKY53 基因，其在生长 6 周的
叶片中表达量最高，一直持续到 7 周，到 8 周时
该基因的表达开始减弱，表明 WRKY53 基因是在
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叶片衰老早期表达的，因而他们认为它可能在叶
片衰老早期起调控作用。
3.2.2 繁殖器官差异表达基因的分离 刘军等(2000)
从水稻幼穗分生组织 SSH 文库的 EST 序列中得到
2 个已知的水稻基因的克隆、11 个有较高同源序
列和18个无同源序列的克隆，据此他们认为，繁
殖器官有与营养器官不同的特异基因表达。为了
获得大麦麦粒发育过程中分子水平的信息，Jang
等(2003)以受精14 d的大麦为检测子，受精5 d的
为驱动子构建了 SSH 文库，分离到 1 个与水稻中
一种特殊钙结合蛋白同源的克隆，经 cDNA 文库
筛选，得到 2 个编码钙结合蛋白的克隆，每一个
都含有EF-hand motif，定名为大麦Ca结合蛋白
1 (Hordeum vulgare calcium binding protein 1,
HvCaBP1)，Northern杂交显示，其在受精8 d的
麦粒中表达最强。Kim等(1999a)分离到受香石竹
(Dianthus caryophyllus)花成熟诱导(flower matura-
tion-induced, CFMI) 的差异表达的cDNA克隆，其
中的CFMI-3基因的全长序列与动物分泌的磷脂酶
A2 (PLA2)相似，即含有一个PLA2的活性位点——
钙离子结合区和 12 个丝氨酸残基，这是 PLA2 特
有的结构。另外还确定了 5 个受香石竹花成熟诱
导的CFMI 基因，其中CFMI-5 与半胱氨酸蛋白酶
抑制剂有很高的同源性，显示它参与花的成熟调
控(Kim 等 1999b)。
3.2.3 转基因植物或突变体基因的克隆 为阐明水
稻抗稻瘟病的机制，寻找抗稻瘟病相关的基因，
Han等(2004)从分离鉴定的水稻抗稻瘟病突变体的
诱导表达基因中，分离到26个受稻瘟病浸染高表
达的 cDNA。其中包含 3 个不同的病程相关蛋白 5
(pathogenesis-related proteins 5, PR5)和4个不同的
蛋白酶抑制剂的两组抗性相关蛋白，这些基因在
突变体中均高表达。此外，他们还分离到编码信
号传递和调控蛋白的基因(包括翻译起始因子eIF5A
和 C2 区域 DNA 结合蛋白)。
Ranjan等(2004)将 SSH技术用于鉴定不同发
育阶段组织和转基因的美洲山杨( P o p u l u s
tremuloides Michx.)，随着4-香豆素辅酶A链接
酶(4-coumarate: coenzyme A ligase，4CL1)表达的
下调和生长加强的基因差异表达，他们从顶芽、
幼茎幼叶和根尖的SSH 文库中总共得到11 308 个
表达序列标签，代表了5 028不重复的转录表达序
列标签，编码 4 224 个独立的蛋白。大约 14% 的
EST 序列在现有的 Populus EST 数据库中没有记
录。蔡应繁等(2003)采用 SSH 构建了棉属突变体
‘湘棉 18’种子萌发过程中腺体发育形成前后的
2 个不同时期的 SSH 差减文库。通过差示筛选及
反式Northern检测，获得的色素腺体形成时期特
异表达或优势表达的 cDNA 片段的结果表明，这
些 c D N A 所涉及的基因，多数是棉属中新发现
的，它们与发育调控、细胞凋亡和蛋白质合成密
切相关。
3.3 不同自然生态环境中植物基因表达的差异 廖
斌等(2004)将SSH技术用于研究生长在2种生态环
境(古铜矿山和正常土壤)中的鸭跖草(Commelina
communis)基因表达差异。他们以生长在铜矿山鸭
跖草作为检测子，非铜矿山上生长的鸭跖草为驱
动子，建立了生长于铜矿山生态环境中鸭跖草的
差异表达 cDNA 文库，此 cDNA 文库代表铜矿山
的鸭跖草中特异表达 cDNA。通过反式 Northern
杂交筛选出 3 个阳性克隆并进行测序，序列分析
表明其中 1个 cDNA 为 CaM-like 基因。他们进一
步对此基因进行反向Northern分析的结果初步表
明，此基因可在生长于古铜矿山上的鸭跖草中上
调表达。
3.4 外界生物因素的诱导
3.4.1 病原菌的诱导 植物受到病原菌侵染时，会
产生一系列的反应，采用 SSH 方法可以在短时间
得到多个受病原菌侵染的植物差异表达基因，这
为克隆抗病相关的新基因建立了技术基础。骆蒙
等(2002)以小麦抗白粉病品系‘百农3217×Mardel’
为材料，构建了白粉病菌诱导的抑制消减杂交文
库，得到与已知抗病相关的 EST 序列 199 条。其
中系统获得性免疫基因(SAR)最多，其余为有关
SA信号传递系统和丝裂素活化蛋白(mitogen-acti-
vated protein, MAP)相关的信号传递系统，这一结
果表明，上述三类基因参与小麦抗白粉病过程。
田振东等(2003)在研究分离到的与马铃薯晚疫病
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(phytophthora infestans)相关的基因中，以接种马
铃薯晚疫病菌48 h的马铃薯为材料，构建了基因
差异表达的SSH 文库，从中随机抽取150 个 cDNA
克隆杂交的结果表明，26个克隆在抗性反应中表
达活跃，其中有 7 个不同的表达片段与晚疫病诱
导的马铃薯叶的 EST 序列具有很高的同源性，这
与来自番茄、烟草和拟南芥的 cDNA 部分片段相
同，4 个是无同源性的 cDAN 片段。这些基因可
能是参与病害反应过程的新基因。Degenhardt等
(2005)用SSH法，以苹果抗病(Malus domestica cv.
Remo)和易感病(M. domestica cv. Elstar)的品种感
染苹果黑心病菌(Venturia inaequalis)的叶片为材
料，构建基因差异表达文库时发现编码与植物防
御有关的基因b-1,3葡聚糖酶(b-1,3-glucanase)、
类核糖核酸酶(ribonuclease-like 10, PR10)、半胱氨
酸蛋白酶抑制剂(cysteine protease inhibitor)、内切几
丁质酶(endochitinase)、亚铁螯合酶(ferrochelatase)
和ADP-核糖基化因子(ADP-ribosylation factor)等
与病程相关蛋白的基因在品种‘Rem o’中高表
达，而与活性氧解毒相关的基因如超氧化物歧化
酶(superoxide dismutase)在‘Elstar’中高表达。这
表明病程相关蛋白基因的高表达可保护‘Remo’
不受病原菌的侵害。Kong等(2005)研究由镰刀霉
菌(Fusarium graminearum)诱导的小麦基因差异表
达时，以接种分生孢子的小麦为材料，得到正向
和反向的SSH文库，并分离到24个只在正向差减
文库中存在的序列。
3.4.2 共生菌与植物间的相互作用 为了研究寄主
植物对菌根真菌附着发育应答的基因表达变化并获
得特殊表达的基因，Wulf等(2003)用以枝菌根真
菌(Glomus intraradice)接种3周的苜蓿根的cDNA
为检测组，与2个病原菌丝束霉菌(Aphanomycew
euteiches)和苜蓿根瘤菌(Sinorhizobium meliloti )、
未感染的磷酸盐培养的 4 种苜蓿根混合 RNA 转录
的 cDNA 为驱动组进行差减杂交，得到 1 805 个
克隆，它们的插入序列主要在 300~1 500 bp 之
间。经分析，在 20 个受丛枝菌诱导表达的 cDNA
序列中，有11个的氨基酸序列与其它植物的蛋白
有着很高的同源性，主要是编码植物血凝素、磷
酸盐转运子、硝酸盐转运子、谷胱甘肽 -S- 转移
酶(glutathione-S-transferase, GST)等基因，另外9
个是无同源基因。Brechenmacher等(2004)以接种
摩西球囊霉菌(Glomus mosseae)后20 d的苜蓿根为
材料，采用 SSH 技术、表达谱研究和 EST 测序
鉴定了苜蓿与摩西球囊酶菌间共生并相互作用的 12
个植物和 6 个真菌的基因，结果是所有植物基因
和 3 个真菌基因在共生组织中表达水平高。只有
3个基因即类胚蛋白(germin-like protein)、GST、
PR10 有过报道，其余 15 个基因在菌根中是首次
报道，2 个是新的序列。6 个苜蓿基因在根表面
形成附着胞时表达活跃，说明其在菌根初期形成
过程中起作用。同时，另有 6 个基因只在菌根后
期诱导表达，这些可能与共生结合体的形成和功
能有关。磷酸盐对这些植物基因表达没有明显影
响。摩西球囊霉菌基因表达谱分析的结果表明，
有2个与根上附着胞的发育有关，1个与菌根的形
成和功能有关，另外 3 个菌的基因在摩西球囊霉
菌的生活期间均表达。
总之，由于 SSH 综合了 DD-P CR 和 cDNA -
RDA 2 种技术的特点，具有高阳性率、高灵敏度
和高效率等特点，这项技术已在植物、动物和人
类的基因克隆中得到了应用。相信随着 SSH 技术
的日臻完善以及这项技术与其它技术的结合(如与
Northern 杂交技术、cDNA 微阵法等)的结合使
用，SSH 技术必将在生物差异表达基因的分离中
得到进一步发展和更广泛的应用。
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