全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第2期，2006年4月262
PCR 鉴定时的微量 DNA 快速制备
陈书霞1 姚莲芳2 房玉林3,*
1 西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100；2 河南科技学院园艺系，河南新乡 453600；3 西北农林科技大学葡
萄酒学院，陕西杨凌 712100
Quick Preparation for Identification of DNA by PCR
CHEN Shu-Xia1, YAO Lian-Fang2, FANG Yu-Lin3,*
1College of Horticulture, Northwest Science & Technology University of Agriculture and Forestry, Yangling, Shaanxi 712100,
China; 2Department of Horticulture, Henan College of Science & Technology, Xinxiang, Henan 453600, China; 3College
of Enology, Northwest Science & Technology University of Agriculture & Forestry, Yangling, Shaanxi 712100, China
提要 用基因组微量 DNA 快速提取方法，从胡萝卜转化再生株样品中快速提取了基因组 DNA，并以此为模板进行胡萝
卜转化再生株的 PCR 快速检测的结果表明，这是转基因时 PCR 检测的一种快速、简便、有效方法。
关键词 DNA 提取方法；PCR 检测；胡萝卜再生株；转基因植株鉴定
收稿 2006-02-08
资助 西北农林科技大学科研专项基金(05ZR067)。
*通讯作者(E-mail: fangylin@sohu.com, Tel: 029-
87091364)。
在以外源基因对植物的转化与表达的实验
中，常需对转化的植物体进行初步检测。初步检
测转化体为阳性时，才能进一步作外源基因整
合、转录或翻译的检测。P C R 技术具有操作简
便、灵敏度高的特点，在基因工程领域中已广泛
得到应用，尤其是在需要快速检出转基因植株时
常常用到 PCR 检测。PCR 检测的前提是必须提取
基因组 DNA，在需要监测的转化体比较多时，如
何快速、简便、可靠地制备大量不同的植物个体
总 DNA 是快速检出转基因阳性株的关键。目前，
基因组 DNA 的提取方法很多，如 SDS 法(Pich 和
Schubert 1993)、CTAB法(顾红雅和瞿礼嘉1998)、
改良SDS法(江昌俊和陈彦1995)、尿素法(傅荣昭
等 1994)、改良 CTAB 法(王晓武等 1999)等。但
这些提取方法费时费力且纯化程序复杂，均不太
适于与 PCR 相配套的转基因植株的微量 DNA 提
取。在转化植株量大而又没有报告基因可以利用
时，就要用快速提取的转化植株中的 D N A 进行
P C R 鉴定。虽然现在已经建立了许多种植物总
DNA的简易提取方法(郭景伦等2005a, b；毛国杰
等2001；徐景升等2004)，但大都还需采用液氮
研磨或多步提取，在制备大批量样品 DNA 时仍然
受到一定的限制。为了进一步简化 DNA 的制备方
法，我们在进行胡萝卜转腹泻抗原定居因子 CS3
基因研究的基础上，建立了一种适合于胡萝卜转
基因植株中检测用的 DNA 快速提取方法，并用其
作了 P C R 检测，取得了比较满意的效果。
材料与方法
1 材料
胡萝卜(Daucus carota L.)品种有‘新透心红’
和亲本材料‘A C 9 3 ’、‘A C 1 0 1 ’，由北京市
蔬菜研究中心胡萝卜育种研究室提供。实验所用
材料为转腹泻基因 CTB 及 CS3 的胡萝卜愈伤组织
上再生的胚状体所长成的高约 10 cm 的小苗。
2 方法
2.1 基因组微量DNA快速提取方法 用1.5 mL离
心管压取两小片叶片，放入离心管的底部，加
0.5 mol·L-1 的NaOH 100 mL (Harrison等 1997)，
用自制的玻璃研棒进行研磨，研磨至匀浆(该过程
要求快速)，立即以13 000×g离心1 min，取5 mL
的上清液，转移至分别含有 20、30、35、40、
45、50 mL 100 mmol·L-1 Tris-HCl (pH 8.0)的新离
心管中，混匀后作为 D N A 粗抽提液备用。进行
技术与方法 Techniques and Methods
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DNA质量检测前每管加入RNase (1 U·mL-1) 1 mL，
37℃下保温30 min。对照参照王晓武等(1999)的
改良 C T A B 法提取。
2.2 PCR扩增 PCR扩增霍乱毒素B亚基CTB基因
的特异引物 CTB1 和 CTB2 的序列如下：CTB1，5
ACACCTCAAAATATTACTGATT 3；CTB 2，5
CCATTTGCCATACTAATTGCGG 3。
PCR 扩增腹泻抗原定居因子 CS3 基因的特异
引物 CS31 和 CS32 的序列如下：CS31，5 AGGA-
TCCACACCTCAAAATATTACTGATT 3；CS3 2，
5 AGTCGACTTATTTAATTGTCGAAGTAATTG 3。
PCR产物大小为750 bp。两个PCR反应都在PERKIN
ELMER Gene AmpPCR System 9600 上进行，反
应条件是：94℃ 3 min；94℃ 1 min，54℃ 1 min，
72℃ 1 min，30 个循环；72℃延伸 10 min。PCR
反应使用20 mL 反应体系。PCR 扩增产物用1%琼
脂糖凝胶电泳检测。
结果与讨论
用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量，结果
表明，用基因组微量 D N A 快速提取方法提取的
DNA 有所降解(图 1)，用改良 CTAB 法提的 DNA
质量比较好(对照)。在所做的 20、30、35、40、
45、50 mL Tris-HCl的几个处理中，45 mL的Tris-
HCl 结果比较好，条带比较整齐，较少降解。重
复多次都是如此。因此，在用基因组 D N A 快速
制备法制备 PCR 扩增所需的 DNA 时，以 100 mL
NaOH与45 mL Tris-HCl组合所提的DNA粗提液比
较 好 。
用基因组微量 D N A 提取法提取胡萝卜的转
CTB 基因的转化株DNA，以 CTB 的特异引物进行
PCR扩增，结果可以扩增出特异的目的条带(图2)。
用基因组微量 DNA 提取法提取胡萝卜转 CS3
基因的PCR阳性株(这些植株先前以PCR检测时所
用的模板是用改良的 CTAB 法提取，然后以 PCR
检测筛选出的阳性株)，以验证基因组微量 DNA
提取法提取的 DNA 是否能有效地进行 PCR 扩增，
并能扩增出目的条带。结果表明，用基因组微量
DNA 提取法提取的基因组 DNA 经 CS3 基因的特异
引物进行扩增，能够清晰地扩增出目的基因(图
3)，从而证明基因组微量 DNA 提取法提取的 DNA
完全可以适用于转基因胡萝卜的 PCR 检测。
图3 胡萝卜再生株中CS3基因的PCR检测
M：High DNA Mass Ladder；1：阳性对照；2：空白；
3 ：阴性对照；4 ~ 9 ：阳性植株。
图2 胡萝卜再生株中CTB基因的PCR检测
M ：D N A 分子量标准；1 ：阳性对照；2 ：阴性对照；
3~ 9 ：转化再生株。
图1 胡萝卜再生株中提取的DNA电泳图谱
1：CTAB 法提取的 DNA；2~7：所用的 Tris-HCl 的量分
别为 2 0 、3 0 、3 5 、4 0 、4 5 、5 0 mL 。
近年来，关于 PCR 分析实验中简化植物基因
组提取方法的研究多有报道，除了去污剂法(徐景
升等2004)或高盐低pH法之外，还有热碱法(Virk
等1999)、煮沸法(赫然等2003)。徐景升等(2004)
用去污剂法，操作步骤虽然简洁，但程序还较
多，我们曾试图用热碱法进行提取，但效果不理
想。因此，我们在Harrison等(1997)的方法上进
行了改进，与改良的 CTAB 法相比，提取的植物
基因组 DNA 有些降解，说明 NaOH 对植物基因组
DNA 有水解作用。如果用 NaOH 提取液快速研磨
并立即将上清液转移到适量的Tris-HCl缓冲液中，
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立即进行 P C R 扩增，可以得到理想的结果。此
种提取方法中，用 0.5 mol·L-1 的NaOH 作提取缓
冲液，作用条件比较剧烈，这可能是 D N A 降解
的直接原因(田洁和罗科2004)。与其它的DNA 快
速提取方法相比，本文方法更省时，不需要于液
氮中研磨，费用也比较低，但用此法时，操作
要快速，同时要求配合适量的Tris-HCl缓冲液效
果才较好。
参考文献
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