全 文 ：园 艺 学 报 2013，40（5）：989–996 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2012–11–06；修回日期：2013–04–15
基金项目：广东省科技项目（2009B020401006）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：chunpingyou@sina.com）
红掌根腐病病原鉴定及其 PCR 检测方法
周晓云 1，游春平 2,*
（1 广州花卉研究中心，广州 510360；2仲恺农业工程学院农学院，广州 510225）
摘 要：利用真菌通用引物 ITS1 和 ITS4 扩增红掌根腐病菌转录间隔区并进行序列测定，通过序列
比较，设计了 1 对红掌根腐病菌的特异引物 SF1/SR2，对 30 个红掌根腐病病原菌、8 种其它真菌和 2 种
细菌基因组 DNA 进行 PCR 扩增。结果表明，只有红掌根腐病菌获得 572 bp 的特异带。使用引物 SF1/SR2
对华丽腐霉进行 PCR 扩增，其检测灵敏度在 DNA 水平上可达 1 pg。运用设计的引物从红掌根腐病菌基
因组 DNA 以及人工接种和自然发病的红掌植株中扩增到 572 bp 的特异片段，实现了对红掌根腐病菌的快
速可靠的检测。
关键词：红掌；根腐病菌；ITS 分析；PCR 检测
中图分类号：S 682.2 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2013）05-0989-08

Identification and PCR Detection of the Pathogen Causing Root Rot of
Anthurium andraeanum
ZHOU Xiao-yun1 and YOU Chun-ping2,*
（1Guangzhou Flower Research Center，Gangzhou 510360，China；2Zhongkai University of Agriculture and Engineering，
Guangzhou 510225，China）
Abstract：Based on the difference in internal transcribed spacer（ITS）sequences of Pythium splendens
and other Pythium spp.，a specific pair of primers SF1/SR2 was designed. Among 30 P. splendens isolates
causing root rot of Anthurium andraeanum，and other eight fungi and two bacteria species，the primer pair
amplified a single 572 bp product from all isolates of P. splendens，but not from any other isolates tested.
The sensitivity of detection of the pathogen P. splendens with primers SF1/SR2 was 1 pg genomic DNA. It
could amplified a specific single product from natural infected A. andraeanum plants，that was not
amplified from healthy tissue. The results showed that the PCR protocol provides a rapid，sensitive and
reliable tool routine detection and identification of P. splendens. In addition，this study is beneficial to
control root rot disease of A. andraeanum.
Key words：Anthurium andraeanum；Pythium splendens；ITS analysis；PCR detection

随着红掌（Anthurium andraeanum）生产规模的不断扩大，其病虫害也相继发生，其中由疫霉
（Phytophthora sp.）、腐霉（Pythium sp.）、镰孢菌（Fusarium sp.）和立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）
引起的根茎腐烂病和根腐病（刘素青和赵丽芳，1999；Hutton & Edman，2002；欧文军 等，2002；

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黄江华 等，2008）对生产造成了严重危害。不同时期、不同年份，引起根腐病和根茎腐烂病的病原
种类不同，根据作者多年的调查，目前广东省红掌根腐病主要是由华丽腐霉菌（Pythium splendens）
引起。由于根据病原菌形态特征，在种水平上很难鉴定腐霉菌，因此利用分子技术（核糖体 DNA-ITS
序列分析）进行真菌鉴定已经被广泛应用（Barry et al.，1991；Cullen et al.，2002；Lees et al.，2002；
Kong et al.，2003；陈怀谷 等，2005；Langrell，2005；Luchi et al.，2005；Shen et al.，2005；曹丽
华 等，2007；余仲东 等，2010）。
本研究中比较分析了红掌根腐病菌华丽腐霉与腐霉属其它种的 ITS 序列，通过设计检测华丽腐
霉菌的特异引物，结合 PCR 技术，建立了一套快速、灵敏、稳定可靠的华丽腐霉菌分子检测技术。
1 材料与方法
1.1 材料
腐霉菌（Pythium sp.）（表 1）和红掌苗（高约 12 cm）由广州花卉研究中心提供，于 2010—2011
年在广州花卉研究中心进行致病性测定。此外，镰刀菌（Fusarium oxysporum）、丝核菌（Rhizoctonia
solani）、疫霉菌（Phytophthora parasitica）、瓜果腐霉菌（Pythium aphanidermatum）、终极腐霉菌
（Pythium ultimum）、青霉菌（Penicillium sp.）、曲霉（Aspergillus sp.）、木霉菌（Trichoderma sp.）

表 1 供试菌株来源
Table 1 Isolates of Pythium spp. and other fungal isolates used in the study
寄主或采样部位 Host 序号 No. 菌株编号 Isolates No.
土样分离 Isolated from soil 1 py1
2 py2
3 py3
4 py4
5 py5
6 py6
7 py7
8 py8
9 py9
10 py10
11 py11
08-492-2#红掌 Anthurium andraeanum 08-492-2# 13 py13
红掌后代 Anthurium progeny 14 py14
‘阿拉巴马’红掌 Anthurium andraeanum‘Alabama’ 15 py15
16 py16
17 py17
18 py18
19 py19
20 py20
21 py21
22 py22
23 py23
24 py24
25 py25
26 py26
27 py27
红掌 Anthurium andraeanum 28 py28
108#红掌 Anthurium andraeanum 108# 29 py29
红掌 Anthurium andraeanum 30 py30
5 期 周晓云等：红掌根腐病病原鉴定及其 PCR 检测方法 991

及两种细菌[菊迪卡氏菌（Dickeya chrysanthemi）、茄劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）]由仲恺农
业工程学院植物病理实验室提供。
玉米培养基和马铃薯葡萄糖培养基配方参考方中达（1998）的文献 。
1.2 致病性测定
接种前将红掌植株保湿 1 d，将直径为 5 mm 的腐霉菌（表 1）菌丝块（腐霉菌在玉米培养基上
于 28 ℃下培养 3 d）贴在红掌植株基部（植株基部用消过毒的接种针轻轻刺破表皮），每个菌株接
种 20 株苗，28 ℃下保湿培养 7 d，观察分离物的致病性；再对发病植株进行病菌分离及纯化，观察
病菌菌落形态和颜色；将纯化的菌株再进行致病性测定。
1.3 病原菌的分子鉴定
参考 Chi 等（2009）的方法进行腐霉菌 DNA 提取。
选用 ITS 通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和 ITS4（5′-TCCTCCGCTTAT
TGATATGC-3′）扩增腐霉菌的 rDNA 内转录区。PCR 扩增条件：94 ℃预热 3 min，94 ℃变性 1 min，
57 ℃退火 30 s，72 ℃延长 1 min，30 个循环；72 ℃再延长 10 min。阴性对照用 ddH2O 代替模板 DNA。
PCR 产物由北京六合华大基因测序公司测序。
PCR 产物序列输入 NCBI 网站中进行 BLAST 分析，使用序列分析软件 mega 4.0-clustal W 程序，
采用 neighbor-joining tree（1 000 次重复取样）法以相似序列构建系统进化树，初步确定测试菌株的
分类地位。
1.4 红掌根腐病菌的 PCR 检测
1.4.1 引物特异性验证
参考高新明等（2011）的方法进行病菌 PCR 检测。
用 DNAMAN 软件对测序结果及 GenBank 数据库中已登录的华丽腐霉菌 ITS 序列进行多重同源
性比较，选取差异位点进行引物设计。用合成引物对参试菌株的基因组 DNA 进行扩增，检测其特
异性。用不同的反应体系和循环参数进行 PCR 扩增，选出最佳扩增条件。
反应体系：10 × Buffer 5 mL、2.5 mmol · L-1 dNTPs 4 mL、5 mmol · L-1 引物 1 0.4 mL、5 mmol · L-1
引物 2 0.4 mL、rTaq 0.4 mL、模板 DNA 2 mL，加 ddH2O 至 50 mL。反应程序：95 ℃预变性 5 min；
94 ℃ 1 min、62 ℃ 30 s、72 ℃ 1 min，30 个循环；72 ℃ 10 min。阴性对照用 ddH2O 代替模板 DNA。
扩增结束后取 10.0 mL PCR 产物于含 0.5 μg · mL-1 EB 的 1.5%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像
系统上检测并拍照。
1.4.2 灵敏度检测
用紫外分光光度计测量所提取红掌根腐病菌基因组 DNA 的 OD260值，将浓度调整为 10 μg · mL-1，
并按 10 倍梯度稀释为 10 μg · mL-1、1 μg · mL-1、100 ng · mL-1、10 ng · mL-1、1 ng · mL-1、100 pg · mL-1、
10 pg · mL-1、1 pg · mL-1 备用。PCR 反应体系和反应程序同上。
1.5 大棚红掌根腐病菌的检测
选取具有红掌根腐病症状的组织，从病健交界处挑取小块组织，经 70%酒精溶液消毒 1 min，
用 0.5%次氯酸钠溶液消毒 1 min，再用无菌水清洗。捣碎病组织，用接种环蘸取菌液，接种于玉米
培养基平板上，置于 28 ℃培养。3 ~ 5 d 后检查所接平板。切取根茎部病组织，按 SDS-CTAB 改进
法（刘小勇 等，1997）提取组织中的 DNA，然后分别以提取的 DNA 为模板进行 PCR 扩增。
992 园 艺 学 报 40 卷
2 结果与分析
2.1 菌株的致病性
将所有腐霉菌株分别接种于红掌茎基部，结果显示，供试菌株对红掌都具有致病性，引起红掌
基部产生黑褐色斑块，15 d 后病部呈现腐烂状（图 1）。从病部分离病菌，形态特征与接种菌株一致。

图 1 红掌根茎腐烂病症状
a：田间症状；b：健康对照；c、d：接种症状。
Fig. 1 Symptom of root rot disease of Anthurium andraeanum
a：Field symptom；b：Health；c，d：Symptom caused by inoculation.
2.2 病原菌的鉴定
2.2.1 病原菌的形态特征
腐霉菌株在玉米培养基上菌落边缘整齐，呈棉絮状；气生菌丝生长旺盛；菌丝一般无隔，但老

图 2 腐霉菌（Pythium sp.）形态特征
a：菌丝；b ~ e：菌丝膨大体。
Fig. 2 Morphological characteristics of Pythium splendens
a：Hyphae；b–e：Hyphal swellings.
5 期 周晓云等：红掌根腐病病原鉴定及其 PCR 检测方法 993

化菌丝产生少量隔膜。此菌产生大量菌丝膨大体，大多表面光滑，圆球形，大多顶生，少数间生，
直径为 30 μm。类似孢子囊的菌丝膨大体单独培养或者将菌块放在灭菌水中培养都不能诱导其产生
游动孢子；单性培养不产生有性孢子（卵孢子）（图 2）。
2.2.2 病原菌的分子鉴定
使用真菌核糖体 DNA 间隔转录区间（ITS）通用引物 ITS1 和 ITS4 对红掌根茎腐烂病菌 DNA
进行扩增，结果（图 3）显示，供试的所有菌株都与华丽腐霉（P. splendens Braun）的 ITS 序列相似
度在 98%以上，因此，根据形态特征和分子鉴定结果，供试菌株为华丽腐霉（P. splendens）。

图 3 供试菌株 ITS-DNA 电泳图谱
CK：阴性对照；M：DNA 分子量标记。
Fig. 3 Electrophoresis of ITS-DNA from the tested isolates
CK：Negative control；M：Marker of DNA.The same below.

2.3 红掌华丽腐霉菌的 PCR 检测方法
2.3.1 特异引物
将红掌根腐病菌的 ITS 序列与 GenBank 中登录的腐霉属两个种（华丽腐霉 P. splendens 和终级
腐霉 P. ultimum，登录号分别为 GU983648.1 和 HQ643864.1）的 ITS 序列和其他 7 个近似或相关菌
株的 ITS 序列进行比较，利用 DNAMAN 软件设计了一对华丽腐霉菌特异性引物 SF1：5′-GAGTGA
GCAGGACGAAGGTT-3′，SR2：5′-AAGGCACAAACGGATTCCAC-3′。
以 SF1/SR2 对参试的不同来源华丽腐霉和其它 8 个真菌及 2 种细菌进行 PCR 扩增。结果表明，
只有在两个华丽腐霉菌株中产生 1 条 572 bp 的特异性片段，其他近似或相关参试菌株均无扩增产物
（图 4）。说明该引物具有较强的特异性。



图 4 华丽腐霉与其它真菌和细菌 DNA 经 PCR 扩增后的电泳结果
py2、py4：红掌根茎基腐土样分离的华丽腐霉菌；Fus：镰刀菌；Rhi：立枯丝核菌；Phyt：寄生疫疫霉菌；
Py-a：瓜果腐霉菌；Py-u：终极腐霉菌；Peni：青霉菌；Aspe：曲霉菌；
Tric：木霉菌；Dick：菊迪卡氏菌；Rals：茄劳尔氏菌。
Fig. 4 Electrophoresis of ITS-DNA from two Pythium splendens isolates，eight other fungi and two bacteria
py2，py4：Pythium splendens isolated from soil of Anthurium andraeanum pot；Fus：Fusarium oxysporum；
Rhi：Rhizoctonia solani；Phyt：Phytophthora parasitica；Py-a：Pythium aphanidermatum；
Py-u：Pythium ultimum；Peni：Penicillium sp.；Aspe：Aspergillus sp.；Tric：Trichoderma sp.；
Dick：Dickeya chrysanthemi；Rals：Ralstonia solanacearum.
994 园 艺 学 报 40 卷
2.3.2 引物的灵敏度
将华丽腐霉菌株 phy2 的基因组 DNA，从 100 ng · μL-1 的浓度开始依次按 10 倍梯度稀释至 1
ag · μL-1，从每一个浓度的样品中取 1 μL 为模板分别用特异性引物进行 PCR 扩增，结果显示，在 25
μL 的反应体系中含有 1 pg 的基因组 DNA 时这一对引物仍然可以扩增出 572 bp 的特异性条带。（图
5）。

图 5 灵敏度验证电泳结果
Fig. 5 Electrophoresis of ITS-DNA amplified under different concentration of
DNA from isolate phy2 with primers SF1 /SR2

2.4 从自然发病的红掌茎基组织中检测根腐病菌
红掌根腐病菌在 PDA 平板上生长迅速，菌落白色，蓬松，3 ~ 4 d 可长满平板（直径 9 cm），在
显微镜下可观察到大量孢子囊，依此特征基本能与其它菌区分开。根据此方法可确定红掌茎基部带
有根腐病菌。分别以带菌组织基因组 DNA 和健康红掌茎基组织基因组 DNA 为模板，用引物 SF1
和 SR2 进行 PCR 扩增。以带菌组织基因组 DNA 模板稀释到合适浓度均可扩增到特异性条带（570 bp
左右），以健康红掌茎基组织基因组 DNA 为模板均无扩增条带（图 6），这表明所设计的引物 SFI
和 SR2 可准确检测到红掌根腐病菌。


图 6 自然发病组织和健康组织 DNA 经 PCR 扩增后的电泳结果
D1 ~ D4：接种后发病组织分离的病原菌；H1 ~ H4：健康组织。
Fig. 6 SF1/SR2 electrophoresis of ITS-DNA from natural diseased tissues and healthy tissues
D1–D4：DNA of pathogens isolated from inoculated tissues；
H1–H4：Healthy tissues.
3 讨论
在相近的真菌中，由于 ITS 序列不需要翻译，面临较小的进化选择压，在进化过程中可以将突
变保留积累下来，因而 ITS 包含许多差异序列（Kong et al，2003）；利用真菌核糖体基因内转录间
隔区（rDNA-ITS）序列种内的保守性和科属种间的可变性，通过在核糖体基因内转录间隔区设计特
异性引物进行 PCR 扩增，可快速检测和鉴定病原菌。本研究中用华丽腐霉（P. splendens）特异性
引物对不同来源的菌株进行了特异性测试，只有以根腐病菌基因组 DNA 为模板时扩增到 572 bp 的
5 期 周晓云等：红掌根腐病病原鉴定及其 PCR 检测方法 995

特异性条带，其它菌株（包括引起红掌根腐病的寄生疫霉 P. parasitica、尖孢镰孢菌 F. oxysporum 和
立枯丝核菌 R. solani）均无扩增条带。使用特异性引物 SF1/SR1 从自然感染根腐病的红掌茎基部组
织提取的华丽腐霉菌基因组 DNA 中扩增到 572 bp 的特异性条带，而健康红掌茎基部组织未检测到
根腐病菌。这表明所设计的根腐病菌 DNA 引物适用于红掌根腐病菌的检测。
快速检测病原菌的方法还有 RT-LAMP 检测法、基因芯片检测法、RT-PCR 检测法、EMA-PCR/
qPCR（Ethidium bromide monoAzide PCR/qPCR）检测法、致病相关基因检测法等（郭泽建和李保笃，
2012）。这些方法都需要昂贵的仪器，对于基层单位进行快速检测来说，并不是理想的方法，因此，
有待进一步开发应用于生产实际的病害快速检测方法。

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