全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 693
柽柳金属硫蛋白基因(MT2)的过量表达对烟草耐Cd2+性的促进效应
张艳 1,2， 杨传平 1,*，王玉成 1
1东北林业大学林学院林木遗传育种教研室，哈尔滨 150040；2黑龙江省教育学院生物化学系，哈尔滨 150080
提要：将在柽柳(Tamarix androssowii)中克隆的金属硫蛋白基因MT2 (GenBank登录号：AY620987)构建到载体 pROKII
上。用农杆菌介导的叶盘法转化烟草‘龙江 911’，获得了抗卡那霉素的转基因植株。PCR-Southern和Northern blot检测
证明外源基因已整合进烟草基因组并可正常表达。Cd2+抗性实验证明柽柳金属硫蛋白基因(MT2)的表达可提高转基因烟草
的抗 Cd2+性。
关键词：柽柳；重金属；金属硫蛋白；烟草
Stimulation Effect of Overexpression of the Metallothionein Gene (MT2) from
Tamarix androssowii on the Cd2+ Tolerance in Tobacco
ZHANG Yan1,2, YANG Chuan-Ping1,*, WANG Yu-Cheng1
1Laboratory of Forest Genetics and Breeding, College of Forest, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;
2
Depart-
ment of Biochemistry, Heilongjiang College of Education, Harbin 150080, China
Abstract: The MT2 gene from Tamarix androssowii (GenBank accession number: AY620987) was cloned into
vector pROKII. Transgenic tobacco lines were generated using Agrobacterium-mediated gene transferring
method. PCR-Southern and Northern blot analysis indicated that the MT2 gene was indeed integrated into the
tobacco genome and expressed in tobacco. The test of Cd2+ resistance proved that the expression of MT2 gene
enhanced the Cd2+ tolerance in tobacco.
Key words: Tamarix androssowii; heavy metal; metallothionein; tobacco
收到 2007-02-01 修定 2007-06-21
资助 国家“9 7 3”计划( G 1 9 9 9 0 1 6 0 0 0 )。
* 通讯作者(E-mail：yangcp@nefu.edu.cn；Tel：0451-
8 2 1 9 0 6 0 7 )。
1977年，植物金属硫蛋白(metallothionein，
MT)在大豆根中发现后，人们又陆续在拟南芥、
水稻、棉花、玉米、小麦、番茄等植物中检测
到 M T 基因( K a w a s h i m a 等 1 9 9 1；Z h o u 和
Goldsbrough 1995；Hsieh等 1995；Hudspeth 等
1996；de Framond 1991；Lane等 1987；Whitelaw
等 1997)，并克隆了相应的 cDNA或基因组序列。
但在林木中克隆的MT基因数量不多，对其功能
的研究也少。M T 与植物的抗逆反应、胚胎发
育、果实成熟、衰老以及基因调控等过程均有关
系(常团结和朱祯 2002)。目前，对MT的金属结
合能力的研究较多，尤其是MT对重金属的解毒
已越来越引起人们的重视。1987年，Lefebvre等
(1987)证明仓鼠MT基因可以在植物中表达，并可
提高植物的耐 Cd2+力。尔后人们又相继将不同来
源的MT基因导入植物，获得了能耐 Cd和 Cu的
转基因植物(张晓钰等 20 00；安志装等 20 01；
Thomas等 2003；Lee等 2004)。另外，作为荒
漠地区盐渍化沙地上良好固沙造林树种的紫杆柽柳
(简称柽柳)，具有较强的抗盐、旱胁迫和耐高温
等特性(张道远等 2003)。本文将从柽柳中克隆的
MT2基因导入烟草，获得了有较高耐 Cd2+性的转
基因植株，现报道如下。
材料与方法
植物表达载体 pROKII由张慧先生惠赠，大
肠杆菌感受态 T o p 1 0 购自天根公司，农杆菌
EHA105、转化材料烟草(Nicotiana tabacum)‘龙
江 911’为东北林业大学林木遗传育种实验室保
存，柽柳(Tamarix androssowii L.) cDNA文库为
东北林业大学林木遗传育种实验室构建。XbaI、
KpnI、T4 DNA ligase均购自 Promega公司，Taq
酶、DL-2000 marker 购自宝生物工程(大连)有限
公司，d N T P 为上海生工生物技术服务公司产
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品，质粒(小量)提取试剂盒、胶回收试剂盒购自
上海华舜公司，卡那霉素和利福平购自 Sigma公
司，头孢霉素购自北京鼎国生物技术有限责任公
司，苄基腺嘌呤(BA)、奈乙酸(NAA)及其他试剂
均为分析纯。
构建植物表达载体 pRCM时，根据柽柳MT2
基因 cDNA序列，设计并合成引物，以文库质粒
为模板，从柽柳 cDNA文库扩增柽柳MT2基因。
5引物：5-CCTCTAGAGCAAAAATGTCTTCT-
TGTGGAGGAAGT-3；3引物：5-ATGGTAC-
CGTTTACTTAACAAGTACATGGGTCACA -3。反
应条件为：94 ℃预变性 2 min ，94 ℃变性 30 s，
56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30个循环，
最后 72 ℃延伸 7 min。PCR 产物进行琼脂糖凝胶
电泳检测。将柽柳MT2基因PCR扩增片段胶回收
后用 XbaI/KpnI双酶切，与同样用 XbaI/KpnI双酶
切的载体 pROKII 16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌
感受态 Top10，在 Kanr抗性板上筛选转化质粒，
并用 P CR、酶切和测序鉴定。
电击法将植物表达载体 pRCM导入根癌农杆
菌 EHA105中，以 20 d左右苗龄的烟草无菌苗为
实验材料，用农杆菌介导的叶盘法转化烟草，用
卡那霉素进行筛选，得到再生植株。
PCR及 PCR-Southern分析时，以CTAB法提
取转基因植株和非转基因植株叶片的总DNA作为
模板，进行 PCR扩增。反应体积为 20 µL，反
应条件为：94 ℃预变性 2 min，94 ℃变性 30 s，
56 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，30个循环，
最后 72 ℃延伸 7 min。PCR产物经 1%琼脂糖电
泳分离后转至尼龙膜上，用DIG探针合成试剂盒
标记柽柳MT2基因 cDNA为探针，进行杂交。用
DIG CDP-StarTM化学发光检测试剂盒检测杂交条
带。
Northern blot分析时，用 SDS法提取转基因
植株和非转基因植株的叶片总 RNA，取 20 µg总
RNA在 65 ℃变性 5 min，经 1%甲醛变性胶电泳
分离后转至尼龙膜上进行Northern杂交，探针标
记方法及杂交程序与上述 Southern杂交相同。
作转基因烟草抗性实验时，将转基因植株和
非转基因植株无根幼苗分别移到Cd2+浓度为 100、
200和 300 µmol·L-1的MS生根培养基上，每个株
系每个浓度选 10 棵植株，放在(26±1) ℃，40
µmol·m-2·s-1光强，16 h光照 /8 h黑暗条件下培养，
50 d后观察其生长状况，测量其鲜重和株高。
结果与讨论
1 PCR扩增柽柳MT2基因
柽柳MT2基因 cDNA序列长 535 bp，去除载
体和 PolyA后长 517 bp。其 5非翻译区 31 bp，
3非翻译区 267 bp，开放读码框(ORF)长 219 bp，
编码 72 个氨基酸。加入酶切位点及部分上游序列
后，PCR扩增的柽柳MT2基因为 256 bp (图 1)。
2 植物表达载体pRCM的构建和鉴定
将 PCR扩增产物克隆到 pROKII载体上，转
化 Top10，随机挑选菌落用 XbaI/KpnI酶切，得
到 256 bp片段，证明 PCR 扩增片段已克隆到
pROKII载体中(图 2)。阳性克隆测序表明插入片
段的序列是正确的(资料未列出)。
3 转基因烟草的 PCR和 PCR-Southern检测
检测 9个转基因植株及非转基因植株，PCR
的结果图 3表明，9个转基因植株均扩增出与阳性
质粒对照目的片段大小一致的产物，而非转基因
植株则没有扩增出目的片段。为进一步明确扩增
产物是否为目的基因片段，将其中 6个转基因植
株的 PCR扩增产物作电泳分离后用 Southern印记
转移到尼龙膜上进行 PCR-Southern杂交。图 4中
结果表明，经 PCR扩增得到的特异片段的确是目
的基因的扩增产物，证明外源基因已整合到烟草
基因组中。
图 1 PCR产物凝胶电泳
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product
1：柽柳M T 2 基因；2：水对照；3：D L -2 0 0 0 分子量标准。
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4 转基因烟草的Northern blot检测
对 Southern杂交中表现为阳性的 6个转基因
植株进行 Northern杂交，检测的结果图 5表明，
转基因植株中的外源基因都有所表达，但表达量
有所不同。其中，T0-2表达量最高，T0-4和 T0-
5 的表达量较低。
5 转基因烟草的Cd2+抗性分析
将从分化培养基上长出的约2 cm高的幼苗移
入含有不同 Cd2+浓度的MS生根培养基中，生长
50 d后，测量植株的鲜重和株高。比较转基因
烟草和非转基因烟草的鲜重和株高并结合形态观
察，Cd2+浓度为 100 µmol·L-1中的转基因烟草生
长状态正常, 非转基因烟草也可正常生长，但长
势不如转基因烟草；Cd2+浓度为 200 µmol·L-1中
的转基因烟草原有老叶变黄，但新叶鲜绿，根
系较正常植株稍粗短，但仍可生长, 而非转基因
烟草叶片与茎均变黄，根系极短，植株矮化枯
死，明显受到Cd2+毒害；Cd2+浓度为 300 µmol·L-1
中的转基因烟草生长缓慢，叶片发黄，根系短
粗颜色发褐，生长受到抑制。从鲜重和株高的
结果中可以看到，在 200和 300 µmol·L-1 Cd2+胁
迫下，转基因烟草的鲜重分别高于非转基因烟草
95.69% 和 73.77%，株高分别高于非转基因烟草
53.77% 和 41.70%，说明柽柳MT2基因的导入可
减轻 Cd2+对烟草的毒害，提高烟草的耐 Cd性。
比较各转基因株系间生长情况可见，各株系的耐
Cd性不同，其中 T0-2 株系的表现最好，在 200
µmol·L-1 Cd2+下，其鲜重和株高比非转基因烟草
分别提高 1.55倍和 1.05倍，增长显著。各株系
耐 Cd能力的不同，可能是外源基因插入烟草基
因组的位点有异所致。同时生长最好的T0-2株系
在Northern杂交中表达量也最多，说明外源基因
表达量的多少与Cd2+胁迫下的植株生长情况呈正
相关(图 6 )。
总之，柽柳MT2基因编码的MT蛋白能够与
Cd2+结合，说明采用基因工程技术在植物中过量
表达MT基因可以提高植物抗重金属的能力，这
是净化污染土壤和减少食物链中重金属污染的一条
值得考虑的途径。
图 2 载体 pRCM的构建
Fig.2 Construction of vector pRCM
图 3 转基因烟草的 PCR检测
Fig.3 Identification of PCR product of
transgenic tobacco plants
　　1 ~ 9：转基因烟草 P CR 扩增结果；1 0：阳性对照；1 1：
非转基因烟草 P C R 扩增结果；1 2：D L -2 0 0 0 分子量标准。
图 4 转基因烟草的 PCR-Southern杂交检测
Fig.4 PCR-Southern blot analysis of
transgenic tobacco plants
　　1：对照(水作模板)；2：阳性对照( p R C M 质粒作模板)；
3：非转基因对照(非转基因烟草作模板)；4 ~ 9：转基因烟草
株系 T 0-1 ~ T 0-6。
图 5 转基因烟草的Northern杂交检测
Fig.5 Northern blot analysis of transgenic tobacco plants
　　1：对照(非转基因烟草)；2 ~ 7：转基因烟草株系 T 0 - 1 ~
T 0 - 6。
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