全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月1072
花粉离体培养基的优化和苯达松除草剂对敏感型水稻恢复系‘Mc526’
花粉活力的影响
王云生 1,2，谢震 1，陆徐忠 2，宋丰顺 2，李莉 2，杨剑波 2,*
1安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036；2安徽省农业科学院水稻研究所，合肥 230031
提要：建立了适合水稻花粉离体萌发的液体培养基配方，并用花粉萌发和碘 -碘化钾(I2-KI)染色测定法检测了喷施苯达
松后含敏感致死基因的水稻恢复系‘Mc526’的花粉生活力。结果表明，苯达松处理前期(施后 1~4 d)，‘Mc526’花粉
活力与未作处理的接近；处理后期(施后 5~8 d)略低于未作处理的，但差异不显著。苯达松对母本结实率影响不显著。
关键词：水稻；恢复系；苯达松敏感致死基因；花粉活力；液体培养基
The Optimization of Pollen Media in vitro and the Influence of Bentazon on
Pollen Viability of Rice (Oryza sativa L.) Restorer Line ‘Mc526’
WANG Yun-Sheng1,2, XIE Zhen1, LU Xu-Zhong2, SONG Feng-Shun2, LI Li2, YANG Jian-Bo2,*
1College of Life Science, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2Rice Research Institute, Anhui Academy of Agricul-
tural Sciences, Hefei 230031, China
Abstract: A solution medium for pollen germination of rice (Oryza sativa) in vitro was established. After
bentazon treatment, the pollen viability of rice restorer line ‘Mc526’, which included bentazon sensitive lethal
(bsl) gene, was researched by using pollen germination and I2-KI pigmentation. The results showed that in the
early treated period (1–4 d), the pollen viability of ‘Mc526’ was similar to the control. And in the later period (5–
8 d), the pollen viability was a bit lower than the control, but the difference was not obvious. It indicated that
bentazon had no salient influence on the setting rate of sterile line.
Key words: rice; restorer line; bentazon sensitive lethal gene; pollen viability; culture medium
收稿 2007-10-18 修定 2007-11-21
资助 安徽省科技攻关(重大)项目(06003010B)和安徽省教育
厅自然科学研究项目(2 005 KJ 169 )。
致谢 安徽省农业科学院绿色食品研究所朱启升、杨前进和
张德文先生在本文完成过程中曾给予帮助。
　 * 通讯作者(E -ma i l：yj ia nbo@2 6 3 . net；T el：0 5 5 1 -
2 1 6 0 2 1 2 )。
苯达松(bentazon)为苯并噻二唑(benzothia-
diazole，BTH)类除草剂，作用的靶位点为光系统
II的D1蛋白，可阻断非环式光合电子传递链，抑
制光合作用，从而引起敏感型植物死亡(徐志防等
1999；Han和Wang 2002；Wu和Wang 2003)。
其对莎草科杂草有杀除作用，可用于水稻田间除
草(McFadden等 1990；Burton和Maness 1992)。
1 9 8 4 年，M o r i 通过 γ - 射线辐射‘农林 8 号’
( N o r i n 8，N 8 )，发现一个对苯达松敏感致死
(bentazon sensitive lethal，bsl)的突变体‘农林 8
号m’(Norin8m，N8m) (陈忠明等 1999)。bsl基因
作为一种化学致死标记，在杂交水稻中应用价值
表现在：(1)将其转入光温敏雄性不育系，用于杂
交制种，苗期喷施苯达松可清除由于因不育系不
稳定而产生的自交种子，从而确保杂交稻制种的
纯度；(2)将 bsl基因转育到恢复系中，用于父母
本混播制种，抽穗期喷施苯达松除去恢复系，实
现制种机械化(陈忠明等 1999；Zhang等 2002)。
朱启升(2004)将水稻‘农林 8号m’与恢复系材
料杂交，选育出对苯达松敏感且杂种优势强的恢
复系，用于父母本混播制种，从而为应用 bsl基
因革新水稻杂交制种技术奠定了基础。但如果花
期喷施苯达松导致恢复系花粉活力下降，必然对
不育系结实率产生影响，这将不利于制种产量和
质量的提高。因此，此项技术在推广之前，应
研究其可行性。本文以水稻的混制一号杂交组合
[‘M c52 6’(含有 b s l 基因) ב绿 3A’]为材料，
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在优化其花粉离体培养条件的基础上，结合对父
母本结实率的调查，用花粉萌发和碘 - 碘化钾
(I2-KI)染色测定法研究苯达松处理对水稻花粉活力
的影响，以期能为混播制种技术的可行性提供参
考。
材料与方法
材料为水稻[(Oryza sativa L.)混制一号杂交组
合[‘Mc526’(含有 bsl 基因)ב绿 3A’]，由安
徽省农业科学院朱启升先生提供。试验在安徽省
天长市国家丰产工程安徽省示范基地进行。旱育
秧，5月 28日播种，6月 21日人工移栽，父母
本比为 1:5，小区面积 1.67 m×3.99 m，区间间
隔 1 m，重复 3 次。沙质土壤，肥力中等。分
别于现穗期(抽穗 3%~5%)、始穗期(抽穗 10%)、
抽穗期(抽穗 50%)和齐穗期(抽穗 80%) (廖伏明等
2003)，每亩喷施 45 L 3 000 mg·L-1苯达松溶液，
田间定畦定量均匀喷雾，以喷施等量清水作对
照。处理 25 d后，随机取小区中间的 5株，调
查整株的结实率。并于抽穗期，用上述相同方法
进行苯达松处理后，每天鉴定一次花粉活力，连
续 8 d。试验重复 3次。苯达松水剂(25%，V/V)
由江苏绿利来公司生产，其他试剂为国产化学
纯。
由于水稻花粉在离开雄花，即扬粉后仍存有
萌发能力的时间很短，最长只有 10 min (王金祥
和陈良碧 2001；王胜华等 2000)。为了缩短花粉
离体时间，提高花粉的萌发能力，于水稻开花时
将喷施清水的花粉洒落在涂有培养基的载玻片上，
然后将载玻片放置于垫有湿滤纸的培养皿中，在
28 ℃左右的恒温箱中培养30 min (何小弟等2005)。
每种培养液观测 5 个玻片，每个玻片 5 个视野，
以花粉管长度超过花粉粒直径作为萌发标准，萌
发率 =(已萌发的花粉粒数 /花粉粒总数)×100%。
采用正交试验设计，研究蔗糖、硼和钙离子对水
稻花粉萌发的影响。
采用优化的液体培养基培养经苯达松处理后
的‘M c5 26’花粉，统计其花粉总数和萌发花
粉数量，计算花粉萌发率。
I 2 - K I 染色测定时，取经苯达松处理后的
‘Mc526’成熟花药放在载玻片上，加 1滴蒸馏
水，用镊子将花药捣碎，促使花粉粒释放。再
加 1滴 I2-KI溶液，盖上盖玻片。于显微镜下观
察 5个视野，统计花粉的染色率(邹琦 2000)。
采用 SPSS10.0软件统计分析测定数据。
结果与讨论
1 水稻花粉培养基的优化
将蔗糖、H3BO4和CaCl2各分5个水平(蔗糖：
0、50、100、150、200、250 g·L-1；H3BO4：
0、10、20、30、40 mg·L- 1；CaCl 2：0、10、
20、30、40 mg·L-1)，进行正交设计，以初步
确定适合水稻花粉萌发的浓度组合(表 1)。方差分
析表明，差异显著的因子依次为：蔗糖、H3BO4、
蔗糖 ×H3BO4、蔗糖 ×CaCl2。CaCl2在正交试验中
的作用并不显著，而是在蔗糖和H3BO4的主导作
用下起辅助作用。
根据正交试验进一步分析各水平均值的结果
表明：不同蔗糖浓度下水稻花粉萌发率以 100 g·L-1
最高(平均萌发率为 23.48%)、150 g·L-1次之(平均
萌发率为22.58%)，H3BO4以20 mg·L-1的为最高(平
均萌发率为 32.55%)，CaCl2以 40 mg·L-1为最高(平
均萌发率为 20.14%)。据此推测三因子的最佳组
合培养基应为：100或 150 g·L-1蔗糖 +20 mg·L-1
H3BO4+40 mg·L-1 CaCl2。由于以上组合未在正交试
验中出现，为了验证正交试验的结论，进一步做
了确定适合水稻花粉萌发的蔗糖浓度实验。在确
定H3BO4 (20 mg·L-1)和CaCl2 (40 mg·L-1)浓度的基础
上，对蔗糖又做了 100、125和 150 g·L-1 3个浓
度梯度试验。由表 2可知，125与 100和 150 g·L-1
蔗糖之间差异显著，而 100和 150 g·L-1之间差异
不显著，其中最适宜花粉管伸长生长的蔗糖浓度
为 125 g·L-1 (平均萌发率为 62.22%)。据此认为，
适合于水稻花粉生长的液体培养基最佳组合应
为：125 g·L-1蔗糖 +20 mg·L-1 H3BO4+40 mg·L-1
CaCl2。
2 苯达松对‘Mc526’花粉管萌发的影响
采用优化的水稻花粉萌发培养基，观察苯达
松处理后的花粉萌发率。花粉平均萌发率为58.23%，
略低于未经苯达松处理的(60.75%)，尤其是处理
后期(施药后 5~8 d)更加明显，但差异未达显著水
平(P=0.135) (图 1，表 3)。这表明，抽穗期喷施适
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表 1 水稻花粉的萌发率
Table 1 Germination rate of rice pollen
编号 蔗糖浓度 /g·L-1 H3BO4浓度 /mg·L-1 CaCl2浓度 /mg·L-1 花粉总数 花粉萌发数 萌发率 /%
1 0 0 0 1 024 4 0.40d
2 0 10 1 0 1 011 4 1 4.06d
3 0 20 2 0 1 032 105 10.20c
4 0 30 3 0 1 064 3 2 3.05d
5 0 40 4 0 1 211 113 5.34d
6 50 0 2 0 1 184 8 4 4.10d
7 50 10 3 0 1 005 157 15.65b
8 50 20 4 0 1 210 417 34.50ab
9 50 30 0 1 165 208 17.85b
1 0 50 40 1 0 1 100 5 9 5.35d
1 1 100 0 4 0 1 101 184 9.72c
1 2 100 10 0 730 256 35.01ab
1 3 100 20 1 0 1 055 466 44.20a
1 4 100 30 2 0 1 075 237 22.01b
1 5 100 40 3 0 1 115 4 5 6.50cd
1 6 150 0 1 0 1 157 2 4 2.05d
1 7 150 10 2 0 1 004 139 13.85c
1 8 150 20 3 0 1 032 224 40.86a
1 9 150 30 4 0 1 039 556 35.62ab
2 0 150 40 0 1 074 208 20.41b
2 1 200 0 3 0 1 101 9 2 5.31d
2 2 200 10 4 0 1 160 251 15.59b
2 3 200 20 0 1 030 8 9 10.61c
2 4 200 30 1 0 949 105 2.93d
2 5 200 40 2 0 1 077 4 0 3.76d
MS 364.10 418.99 72.96
F 5.17* 5.95** 1.036
　　培养条件为：2 8 ℃，3 0 m in；不同的字母代表差异显著( P< 0 . 0 5 )；*和 **分别代表 0 .0 5 和 0 .0 1 的显著水平。下表同此。
表 2 蔗糖对水稻花粉萌发的影响
Table 2 Effect of sucrose on rice pollen germination
编号 蔗糖浓度 /g·L-1 H3BO4浓度 /mg·L-1 CaCl2浓度 /mg·L-1 花粉总数 花粉萌发数 萌发率 /%
1 100 2 0 4 0 1 024 468 45.67b
2 125 2 0 4 0 950 591 62.22a
3 150 2 0 4 0 930 443 43.30b
　　培养条件为：2 8 ℃，3 0 m i n。
量的 3 000 mg·L-1苯达松溶液对‘Mc526’花粉
萌发没有明显的抑制作用。
3 苯达松对‘Mc526’花粉 I2-KI染色的影响
‘Mc526’成熟花粉的可育率较高(平均可育
率为 95.07%)，败育花粉以典败为主(平均典败率
为 3.71%)。苯达松处理前期(施药后 1~4 d)的花粉
可育率(平均可育率为94.62%)与未经苯达松处理的
差异甚微；而苯达松处理后期(施药后 5~8 d)花粉
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图 1‘Mc5 26’抽穗期花粉萌发的显微观察
Fig.1 Micro-observation of ‘Mc526’ pollen germination at heading period
　　a：对照的第 6 天(放大倍数 1 0 0 × )；b：对照的第 6 天(放大倍数 4 0 0 × )；c：苯达松处理后第 6 天(放大倍数 1 0 0 × )；d：苯
达松处理后第 6 天(放大倍数 4 0 0 × )。
表 3 苯达松对‘Mc526’花粉萌发的影响
Table 3 Effect of bentazon on ‘Mc526’ pollen germination

处理时间 /d
花粉萌发率 /%
对照 处理
1 62.86±1.23 62.47±0.93
2 63.81±0.56 63.78±0.75
3 59.90±2.10 59.00±1.36
4 60.02±1.36 59.47±2.01
5 59.08±0.69 55.60±1.02
6 64.12±2.11 56.53±2.35
7 60.00±2.35 54.76±2.15
8 56.24±1.78 54.26±3.01
　　液体培养基组分为：125 g·L-1蔗糖、20 mg· L -1 H3BO4、
40 mg·L -1 Ca Cl2；培养条件为：28 ℃，30 min。
可育率(平均可育率为 92.84%)有所下降，但差异
不显著(P=0.059) (表 4)。这表明，抽穗期喷施适
量的 3 000 mg·L-1苯达松溶液对‘Mc526’花粉
育性没有明显影响。
4 苯达松对混制一号父母本结实率的影响
由表 5可知，苯达松显著抑制‘Mc526’结
实，不同抽穗期喷施的结实率较未喷施的下降
90.39%。这表明，花期喷施适量苯达松可有效降
低恢复系结实对杂交稻种纯度的影响。而不同抽
穗期喷施苯达松的‘绿 3A’结实率与未喷施苯
达松的差异不显著(P=0.154)，表明花期喷施适量
的3 000 mg·L-1苯达松溶液对不育系结实率无显著
影响。但随着喷施时期的推迟，恢复系结实率不
断提高，如齐穗期施药比现穗期的‘Mc526’结
实率提高 286.84%。
总之，喷施时期的推迟会对杂交稻种纯度产
生影响，不利于机械化制种。为了提高杂交稻种
纯度，应选择水稻抽穗早期施药。此外，抽穗
期喷施苯达松对‘Mc526’花粉活力并不产生显
著影响。这些对用bsl基因实现杂交水稻机械化混
播制种有一定的参考意义。
植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月1076
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表 4 苯达松对‘Mc526’花粉育性的影响
Table 4 Effect of bentazon on ‘Mc526’ pollen procreation

处理时间 /d
对照 处理
不育率
可育率 /%
不育率
可育率 /%
典败率 /% 圆败率 /% 染败率 /% 典败率 /% 圆败率 /% 染败率 /%
1 5.28±0.35 0.28±0.11 0.38±0.12 94.07±0.79 4.78±0.59 0.43±0.21 0.72±0.26 94.06±0.12
2 4.14±0.36 0.53±0.65 0.61±0.35 94.72±0.37 4.38±0.71 0.15±0.55 0.83±0.42 94.62±0.35
3 4.35±0.23 0.54±0.45 0.59±0.46 94.53±0.12 3.32±0.31 1.29±0.24 0.97±0.28 94.42±0.21
4 3.29±0.59 0.64±0.68 0.87±0.31 95.20±0.81 3.31±0.80 0.50±0.32 0.83±0.36 95.36±0.61
5 3.31±0.23 0.50±0.45 0.83±0.40 95.36±0.69 4.80±0.22 0.48±0.41 1.44±0.54 93.29±0.25
6 3.05±0.65 0.81±0.33 0.81±0.61 95.33±0.77 5.32±0.64 0.53±0.45 1.60±0.12 92.55±0.91
7 3.17±0.25 0.74±0.51 0.52±0.25 95.58±0.58 5.12±0.21 1.02±0.36 0.88±0.20 92.97±0.56
8 2.50±0.29 0.61±0.12 1.14±0.39 95.76±0.36 6.02±0.33 0.84±0.25 0.60±0.21 92.54±0.74
表 5 不同抽穗期喷施苯达松对混制一号父母本结实率的影响
Table 5 Effect of spray application of bentazon in different heading stages on the setting rates
of restorer line and sterile line of hybrid rice combination Hunzhi 1

品种
结实率 /%
对照 现穗期 始穗期 抽穗期 齐穗期
‘Mc526’ 81.88±5.81 3.80±1.03 4.10±0.94 8.89±2.13 14.70±3.15
‘绿 3A’ 62.68±3.25 61.94±4.21 62.11±3.13 61.73±4.51 63.05±4.78
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