全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月852
水稻品种‘沈农 606’抗稻瘟病基因定位和连锁的 SRAP片段分析
姜树坤 1,2，张喜娟 2，张丽 1,*
沈阳农业大学 1辽宁省农业生物技术重点实验室，2辽宁省北方粳稻育种重点实验室，沈阳 110161
提要：选用抗稻瘟病水稻品种‘沈农 606’为抗病亲本与感病品种‘丽江新团黑谷’配制杂交组合。鉴定亲本、F1正反
交及其F2群体的抗病性的结果表明，‘沈农606’的抗性受一对显性基因控制。采用相关序列扩增多态性(SRAP)和简单序
列重复(SSR)标记，以及分离体分组混合分析法(BSA)将该基因定位于8号染色体上，其与SRAP标记m5e1-500的遗传距
离为 2.8 cM，与 SSR标记 RM25的遗传距离为 9.8 cM，暂命名为 Pi-SN606。m5e1-500序列位于 8号染色体上，它能编
码大于 40个氨基酸的阅读框有2个，在NCBI网站上没有比对到同源性序列。
关键词：水稻；稻瘟病；基因定位；SRAP；SSR
Blast Resistance Gene Mapping and Linked SRAP Fragment Analysis of Rice
(Oryza sativa L.)‘Shennong606’
JIANG Shu-Kun1,2, ZHANG Xi-Juan2, ZHANG Li1,*
1Key Laboratory of Agricultural Biotechnology of Liaoning Province, 2Key Laboratory of Northern Japonica Rice Breeding
of Liaoning Province, Shenyang Agricultural University, Shenyang 110161, China
Abstract: The rice (Oryza sativa) blast resistance cultivar ‘Shennong 606’ was crossed to a susceptible
cultivar ‘Lijiangxintuanheigu’. Based on the segregation ratios of resistant and susceptible plant in F2 populations,
it was deduced that the rice blast resistance gene was encoded by dominant gene. We report here the use of
bulked segregate SRAP (sequence-related amplified polymorphism) and SSR (simple sequence repeat) analysis
for rapid identification of DNA markers linked to the resistance gene. Two SRAP markers and one SSR marker
were identified linking to the resistance gene locus. The linkage analysis with three markers using Mapmaker 3.0
software showed that the resistance gene locus was mapped to m5e1-500 (2.8 cM) tightly and RM25 (9.8 cM).
Sequenced the m5e1-500 fragment linked to the resistance gene and compared with the NCBI databases, the
result proved the gene mapped on chromosome 8. Two ORFs (open reading frame) which was larger than 40
amino acids were coded by the m5e1-500 sequence. This region does not align with the other plants in NCBI
website.
Key words: rice; blast; gene mapping; SRAP; SSR
收稿 2007-07-19 修定　 2007-09-14
资助　 辽宁省重点实验室专项资金计划和沈阳农业大学青年教
师基金。
* 通讯作者(E-mail：ququlili2000@yahoo.com.cn；Tel：
02 4-88 48 71 64 )。
稻瘟病是水稻重要病害之一，自1918年日本
左左木最早分析水稻品种抗稻瘟病能力以来(孙漱
沅等1986)，人们已用多种分子标记方法定位了50
多个抗病基因。而且每年都有新的基因发现和定
位(Wang等 1999；Bryan等 2000；Liu等 2002；
吴金红等 2002；Jiang和Wang 2002；陈志伟等
2004；Jia等 2000；Jeoh等 2003；Chanhan等
2002；Liu等 2005；Chen等 2005；张建福等
2006)。‘沈农 606’是我校稻作室培育的超级稻
品种，田间表现出较强的稻瘟病抗性，本文对其
中所含的稻瘟病抗性基因进行了遗传分析和定位，
以期能为今后该基因的克隆以及分子标记辅助育种
建立基础性材料。
材料与方法
材料为抗稻瘟病的超级稻(Oryza sativa L.)品
种‘沈农 606’(本校徐正进先生惠赠)和感病品种
‘丽江新团黑谷’(本校刘志恒先生惠赠)。2 00 4
年，以两品种为亲本配制杂交组合，获得 F1、F2
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 853
代种子。
选用 ZA41菌系，挑取斜面培养的菌接种于
灭菌的高粱粒上，室温(26 ℃)培养 10~14 d，洗
去表面菌丝，平铺于瓷盘上培养 2 d，配成孢子
悬浮液(在 100倍的视野下 30个孢子)。亲本(对
照)、F1 (正、反交)、F2浸种催芽后分别点播于
60 cm×40 cm×8 cm的育苗盘内，育苗盘内铺有
1.5 cm厚的岩棉为基质，播后覆盖 1 cm厚细沙，
常规管理。四叶期时定量喷雾接种，接种后立即
在 26~28 ℃条件下黑暗保湿(相对湿度 95%) 24 h，
然后将育苗盘移至 25~30 ℃、相对湿度>95%的高
湿环境下，8~10 d后调查病斑，进行抗病性评定
及统计分析(王久林等 2000)。
基因组 D N A 的提取采用姜树坤等的方法
(2006) ；相关序列扩增多态性(sequence-related
amplified polymorphism，SRAP)引物采用 Li和
Quir os (20 01)已发表的引物组合：m1~m10/
e1~e11，共计 110对；反应体系参照 Li和Quiros
(2001)。简单序列重复(simple sequence repeat，
SSR)引物按染色体均匀选取共计 84个，扩增程序
参照姜树坤等(2007)文中的方法。扩增产物用 6%
的变性聚丙烯酰胺凝胶分离，电泳缓冲液为 0.5×
TBE。电泳后采用银染法染色(Panaud等 1996)。
生物统计时参照吴建利等(2000)关于稻瘟病抗
性基因遗传分析的适合性 χ2测验方法，计算遗传
距离采用Mapmaker 3.0软件(Lander等 1987)。将
与抗病基因紧密连锁的 SRAP片段m5e1-500用大
连宝生物Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0
试剂盒回收测序。用DNAMAN 5.0软件及NCBI
网站上的相关功能分析序列。
实验结果
1 水稻品种‘沈农 606’抗稻瘟病性的遗传分析
‘沈农 606’ב丽江新团黑谷’的 F 1正反
交各单株均表现抗病，表明其抗性受核基因控
制。F2代群体的抗感分离情况为 632株抗病，196
株感病。χ2测验表明抗、感单株分离符合 3:1分
离比(表 1)，表明‘沈农 606’的稻瘟病抗性受
一对主效基因控制。
2‘沈农 606’抗稻瘟病基因的定位
将亲本间有多态性的35对SRAP引物和16对
SSR引物在抗、感池间进行扩增后，其中有 2对
SRAP引物和 1对 SSR引物呈现出多态性，表明
它们与该抗性基因存在连锁关系。采用这 3对引
物对 112个 F2感病单株利用Mapmaker 3.0软件计
算遗传距离。结果表明，‘沈农 606’抗稻瘟病
基因位于 8号染色体上，与 SRAP标记m5e1-500
(图 1)的遗传距离为 2.8 cM (图 2)，与 SSR标记
表 1 F2群体接种稻瘟病菌 ZA41后的鉴定
Table 1 Identification results of F2 population with ZA41 race
亲本及后代群体 鉴别小种 鉴定株数 抗病株数　 感病株数 期望比 χ2 P0.05，0.01
‘沈农 6 0 6 ’ ZA41 2 0 2 0
‘丽江新团黑谷’ ZA41 2 0
F1 ZA41 1 5 1 5
F2 ZA41 828 632 196 3:1 0.71 3.84~6.63
图 1 SRAP引物m5e1扩增片段在 F2群体中的分离
Fig.1 Segregation of m5e1 amplification fragments in F2 population
P 1：‘沈农 6 0 6’；P 2：‘丽江新团黑谷’；其他为 F 2 感病单株。
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月854
RM25 (图 3)的遗传距离为 9.8 cM (图 2)。
3 连锁的 SRAP片段分析
用DNAMAN 5.0软件对测序后的序列进行开
放阅读框架(open reading frame，ORF)检测的结
果(图 4)显示，m5e1-500序列能够编码大于 40个
氨基酸的阅读框有 2个，即 84个氨基酸和 40个
氨基酸。由于序列太短，无法用NCBI上的BLAST
软件对这两个氨基酸序列进行相似性比对。我们
图 4 m5e1-500的核苷酸序列及推导的氨基酸序列
Fig.4 Nucleotide and deduced amino acid sequence of m5e1-500
a：84 个氨基酸的阅读框；b：40 个氨基酸的阅读框。
图 2 ZA41菌系抗性基因在水稻染色体上的定位
Fig.2 Mapping of blast-resistance gene to
ZA41 race on rice chromosome
图 3 SSR引物RM25扩增片段在 F2群体中的分离
Fig.3 Segregation of RM25 amplification fragments in F2 population
P 1：‘沈农 6 0 6’；P 2：‘丽江新团黑谷’；F 1：杂种 1 代；其他为 F 2 感病单株。
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 855
对该片段的核酸序列进行比对的结果表明，片段
与粳型水稻 8号染色体上的AP008224.2序列同源
性为 100%，这与 SSR定位的结果一致，说明可
以用 SRAP片段测序进行水稻的基因定位。
讨　　论
SRAP是一种新型的基于 PCR技术的分子标
记，可对内含子区域和启动子区域进行特异性扩
增，近年来，已广泛应用于基因定位、基因克
隆、生物多样性、遗传图谱构建、预测杂种优
势、比较基因组学等诸多研究领域(Li和 Quiros
2001；林忠旭 2003；Ferriol等 2003)。与其他
的几种分子标记相比，它的引物设计简单且合成
费用低，扩增产物多态性高，在基因组上分布均
匀，这些特点都可大大降低实验成本和劳动强
度；此外，SRAP标记扩增区域包括开放阅读框
且扩增产物和扩增引物都较长，这就使其扩增产
物更容易克隆测序，也更有利于在网上数据库中
进行比对分析。现在，随着水稻基因组测序的完
成，大量的水稻基因信息都可以通过网络进行查
询和分析，这就使得 SRAP标记在水稻基因定位
和克隆中具有较高的应用价值。
‘沈农 6 0 6’是北方重点推广的超级稻品
种，在田间表现出较强的稻瘟病抗性。本文结果
表明，‘沈农 606’对 ZA41 小种的抗性受一对
显性核基因控制，并将其定位于 8 号染色体上。
此种基因的鉴定和定位为克隆该基因及分子标记辅
助育种奠定了基础。另外，目前定位在 8号染色
体上的抗稻瘟病基因有 Pi-11 ( t)、Pi-36 ( t)和
Pi-33 (t)，本文所鉴定的抗病基因与这 3个基因之
间的关系尚待进一步研究。‘沈农 606’系谱中
有多个亲本具有较强的稻瘟病抗性，如‘藤坂 5
号’、‘塔杜康’、‘福锦’等，这一抗性基
因的具体来源仍需进一步验证。
本文中的测序比对结果虽然不很理想，但我
们正进一步筛选较长的连锁片段进行测序。同
时，根据抗病基因保守区设计固定引物，结合
SRAP标记选择扩增外显子区域的引物，并拟采
用类似靶位区域扩增多态性(target region amplified
polymorphism，TRAP)标记的策略(Hu和Vick 2003)
进行连锁引物的筛选。
参考文献
陈志伟, 郑燕, 吴为人, 赵长江(2004). 抗稻瘟病基因 Pi-2(t)紧密
连锁的 SSR标记的筛选及应用. 分子植物育种, 2 (3): 321~
325
姜树坤, 王政海, 钟鸣, 张丽, 刘少霞(2007). 辽宁省近十五年部
分主栽水稻品种的 SSR多态性分析. 植物生理学通讯, 43 (1):
69~72
姜树坤, 钟鸣, 徐正进, 张丽, 马慧, 刘少霞(2006). RAPD标记进
行水稻籼粳分类的研究. 沈阳农业大学学报, 37 (4): 639~
641
林忠旭, 张献龙, 聂以春, 贺道华, 吴茂清(2003). 棉花 SRAP遗
传连锁图构建. 科学通报, 48 (15): 1676~1679
孙漱沅(1986). 稻瘟病及其防治. 上海: 上海科学技术出版社, 1
王久林, 雷财林, 蒋琬如, 凌忠专(2000). 籼稻品种浙辐 802抗瘟
性遗传研究. 遗传学报, 27 (3): 235~239
吴建利, 庄杰云, 柴荣耀, 樊叶扬, 金敏忠, 李德葆, 郑康乐(2000).
水稻抗穗瘟基因的分子定位. 植物病理学报, 30 (2): 111~
115
吴金红, 蒋江松, 陈惠兰, 王石平(2002). 水稻稻瘟病抗性基因 Pi-
2(t)的精细定位. 作物学报, 28 (4): 505~509
张建福, 凌忠专, 王国英, 谢华安(2006). 籼型恢复系云恢 290稻
瘟病抗性遗传学分析. 分子植物育种, 4 (4): 540~544
Bryan GT, Wu KS, Farrall L, Jia Y, Hershey HP, McAdams SA,
Faulk KN, Donaldson GK, Tarchini R, Valent B (2000). A
single amino acid difference distinguishes resistant and sus-
ceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta. Plant
Cell, 12 (11): 2033~2046
Chanhan RS, Farman ML, Zhang HB, Leong SA (2002). Genetic
and physical mapping of a rice blast resistance locus, Pi-
CO39(t), that corresponds to the avirulence gene AVR1-
CO39 of Magnaporthe grisea . Mol Genet Genomics, 267:
603~612
Chen S, Wang L, Que Z, Pan R, Pan Q (2005). Genetic and
physical mapping of Pi37(t), a new gene conferring resis-
tance to rice blast in the famous cultivar St. No.1. Theor
Appl Genet, 111: 1563~1570
Ferriol M, Pico B, Nuez F (2003). Genetic diversity of a germplasm
collection of Cucurbita pepo using SRAP and AFLP marker.
Theor Appl Genet, 107 (2): 271~282
Hu J, Vick BA (2003). TRAP target region amplifica tion
polymorphi sm: a novel mark er t echnique for pla nt
genotyping. Plant Mol Biol Rep, 21: 289~294
Jeoh JS, Chen D, Yi GH, Wang GL, Ronald PC (2003). Genetic
and physical mapping of Pi5(t), a locus associated with broad-
植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月856
spectrum resistance to rice blast. Mol Genet Genomics, 269:
280~289
Jia YL, Mcadams SA, Bryan GT, Hershey HP, Valent B (2000).
Direct interaction of resistance gene and avirulence prod-
ucts confers rice blast resistance. EMBO J, 19: 4004~
4014
Jiang J, Wang S (2002). Identification of a 118-kb DNA fragment
containing the locus of blast resistance gene Pi-2(t) in rice.
Mol Gene Genomics, 268: 249~252
Lander ES, Green P, Abrahamson J, Barlow A, Daly MJ, Lincoln
SE, Newberg L (1987). MAPMAKER: an interactive com-
puter package for constructing primary genetic linkage
maps of experimental and natural populations. Genomics,
1: 174~181
Li G, Quiros CF (2001). Sequence related amplified polymor-
phism (SRAP), a new marker system based on a simple PCR
reaction: i ts application to mapping and gene tagging in
Brassica . Theor Appl Genet, 103: 455~461
Liu G, Lu G, Zeng L, Wang GL (2002). Two broad-spectrum blast
resistance genes, Pi9(t) and Pi2(t), are physically linked on
rice chromosome 6. Mol Genet Genomics, 267: 472~480
Liu XQ, Wang L, Chen S, Lin F, Pan QH (2005). Genetic and
physical mapping of Pi36(t), a novel rice blast resistance
gene located on rice chromosome 8. Mol Genet Genomics,
274 (4): 394~401
Panaud O, Chen X, McCouch SR (1996). Development of
microsatellite marker and characterization of simple sequence
length polymorphism (SSLP) in rice (Oryza sativa L.). Mol
Gen Genet, 252: 597~607
Wang ZX, Yano M, Yomanouchi U, Iwamoto M, Monna L,
Hayasaka H, Katayose Y, Sasaki T (1999). The Pib gene for
rice blast resistance belongs to nucleotide binding and leu-
cine rich repeat class of plant disease resistance gene. Plant
J, 19 (1): 55~64