全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 461
外源腐胺对石刁柏愈伤组织胚性能力的影响
陈小飞 1，萧浪涛 1,*，鲁旭东 1,3，刘素纯 1,2
湖南农业大学 1湖南省植物激素与生长发育重点实验室，2食品科技学院，长沙 410128；3孝感学院生命科学技术学院，
湖北孝感432000
提要：石刁柏胚性愈伤组织继代过程中，添加浓度为 10 mg·L-1的外源腐胺能有效地保持愈伤组织的胚胎发生能力，并
减少愈伤组织的褐化，但不能提高愈伤组织的体细胞胚的诱导率。腐胺处理过的胚性愈伤组织的内源腐胺含量明显提高。
这可能是外源腐胺保持细胞胚性、降低褐化程度的原因。
关键词：石刁柏；愈伤组织胚胎发生能力；褐化；内外源腐胺
Effects of Exogenous Putrescine on Embryogenic Competence in Asparagus
officinalis L. Calli
CHEN Xiao-Fei1, XIAO Lang-Tao1,*, LU Xu-Dong1,3, LIU Su-Chun1,2
1Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones and Development, 2College of Food Science and Technology, Hunan Agri-
cultural University, Changsha 410128, China; 3School of Life Science and Technology, Xiaogan College, Xiaogan, Hubei 432000,
China
Abstract: Asparagus officinalis embryogenic calli, subcultured on media with 10 mg·L-1 exogenous putrescine,
exhibited longer embryogenic competence and less browning. However, induction of somatic embryos was not
promoted by application of exogenous putrescine. Compared with the non-putrescine treatment (control),
embryogenic calli pretreated with putrescine exhibited a high level of the endogenous putrescine. It is suggested
that exogenous putrescine could prompt calli embryogenic competence and reduce calli browning due to the
accumulation of endogenous putrescine.
Key words: Asparagus officinalis; callus embryogenic competence; browning; exogenous and endogenous
putrescine
收稿 2007-02-13 修定 2007-03-28
资助 教育部留学生基金(教外司 1999363)和国家自然科学
基金(3 05 4 0 0 19 )。
* 通讯作者(E-ma il：l tx ia o@hu nau .net；T el：07 31 -
46 35 25 9-80 01 )。
石刁柏的组培、器官发生、胚状体发生和
生化组成等生理生化问题的研究已多有报道(赵洁
和程井辰 1 99 2；赵洁等 1 99 2；蒋琳和陆仕华
1996；李可峰等 2006)。石刁柏因品种和基因型
不同，离体培养条件要求差异较大。我们实验室
从美国引入石刁柏优良品种 ‘UC800’ (Asparagus
officinalis L. cv. UC800)，并建立了稳定的体细
胞胚(简称体胚)发生培养体系(陈小飞等 2006；鲁
旭东等 2006)。此外，多胺在植物体内参与细胞
增殖、分化、衰老、抗逆和形态发生等一系列
生理生化反应(Martin和 Ames 1962；Martin-
Tanguy 2001)。石刁柏离体培养过程中，我们观
察到石刁柏继代培养基中添加一定浓度的外源腐
胺(putrescine，Put)可保持继代胚性愈伤组织的
胚性，且能有效地降低愈伤组织的褐化现象，现
报道如下。
材料与方法
石刁柏(Asparagus officinalis L.)胚性愈伤组织
(embryogenic callus，EC)的诱导参照陈小飞等
(2006)和鲁旭东等(2006)文中的方法。初始愈伤组
织和胚性愈伤组织的诱导培养基分别为MS+KT
0.5 mg·L-1 (单位下同)+2.4-D 2和MS+NAA 0.5+2.4-
D 10。胚性愈伤组织继代培养基为：MS+NAA
0.5+2.4-D 10+Put 0~15。诱导出的胚性愈伤组织
在加有 Put 20~40的MS培养基上诱导体胚发生，
7 d后转入不加生长调节物质的MS培养基。以不
加 Put的为对照。用体视显微镜观察体胚的发育
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过程，定期取样检测。内源多胺含量检测参照刘
俊等(2002)文中的方法。
实验结果
1 外源 Put对石刁柏胚性愈伤组织胚胎发生能力
的影响
胚性愈伤组织在继代培养基上继代后转入胚
胎发生培养基上诱导体胚的结果表明，胚性愈伤
组织经几次继代后体胚发生能力逐渐降低，继代
5次后体胚发生能力基本丧失(表 1) ；而在培养
基中加入一定浓度的 Put，继代 5次后部分愈伤
组织仍可产生体胚，添加 10 mg·L-1 Put的愈伤
组织在继代5次后仍有41.7%的胚性愈伤组织可产
生体胚，说明外源 Put能保持胚性细胞的胚性。
在添加Put的培养基中继代的胚性愈伤组织色
泽鲜亮、颗粒大小均匀(图 1-a)。继代 6次后，不
加 Put培养的胚性愈伤组织褐化明显，质地疏松
(图 1-b)，甚至产生粘液，这种愈伤组织转移到
分化培养基后不能诱导出体胚。在继代培养基中
加有 Put的愈伤组织，经过继代后其褐变的程度
低于不添加的(表 1)，能诱导出体胚(图 1-c)，说
明 Put在一定程度上能够防止愈伤组织褐变。
2 外源 Put对胚性愈伤组织体胚诱导率的影响
为了探讨体胚诱导过程中外源Put处理是否对
体胚诱导率有影响，以在含有 10 mg·L-1 Put的MS
培养基上继代不同次数的胚性愈伤组织为材料诱导
体胚。统计体胚诱导率的结果表明，诱导体胚时
培养基中Put浓度在 20~35 mg·L-1范围内添加与否
的诱导率相差不大(表 2)，而且当 Put浓度达到 40
mg·L-1时，体胚发生率低于不加 Put的，说明高
浓度 Put对体胚发生有抑制作用。
3 外源 Put对胚性愈伤组织内源多胺含量的影响
为了验证外源Put是否通过调节内源多胺保持
细胞胚性，检测继代次数不同的胚性愈伤组织中
的内源多胺含量。结果显示，胚性愈伤组织中内
源 Put和亚精胺(spermidine，Spd)含量在继代过程
中逐渐下降(图 2)，2种多胺在C0和C6中的含量差
异非常明显(超过 50%)，而精胺(spermine，Spm)
表 1 不同浓度 Put对石刁柏胚性愈伤组织胚胎发生能力的影响
Table 1 Effects of putrescine treatment at various concentrations on callus embryogenic competence in A. officinalis
Put浓度 /mg·L-1 接种数量 /瓶
产生体胚的比例 / % 愈伤组织褐变率 /%
C1 C2 C4 C5 C6
0 1 2 58.3 50.0 8.3 0 66.7
5 1 2 66.7 58.3 25.0 16.7 41.7
1 0 1 2 91.7 75.0 58.3 41.7 16.7
1 5 1 2 83.3 75.0 33.3 33.3 25.0
C 1、C 2 和 C 4~ C 6 分别表示继代 1、2 和 4 ~ 6 次的胚性愈伤组织。
图 1 胚性愈伤组织(a)、逐渐褐化的胚性愈伤组织(b)和成熟的体胚(c)
Fig.1 Embryogenic callus (a), embryogenic callus browned gradually (b) and mature somatic embryos (c)
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含量变化不大。经外源 Put处理过的胚性愈伤组
织中内源 Put含量在继代过程中都高于不加 Put
的，在 C2、C4和 C5中内源多胺含量差异分别为
23.5%、42.5%和 47.2%；但 Spd和 Spm含量受
外源 Put的影响很小。
4 外源Put对体胚诱导过程中内源多胺代谢的影响
在含有 10 mg·L-1 Put的MS培养基上继代1次
的胚性愈伤组织，转入加有 25 mg·L-1 Put的MS
培养基上诱导体胚发生，7 d后转入不加生长调节
物质的MS培养基上继续培养，每周取样检测内
源多胺含量。如图 3 所示，在体胚诱导过程中，
愈伤组织中内源Put含量一直呈下降趋势，28 d时
降到最低值。Spd和 Spm含量在培养的 35 d内，
有一个下降、上升、再下降的过程。与不加 Put
的相比，经Put处理的愈伤组织中 3种内源多胺含
量除 Put高于不加 Put的以外，Spd和 Spm含量变
化规律不明显，在体胚接近成熟时(35 d)不加 Put
的内源 Spd和 Spm含量比加 Put的高。
讨 论
胚性愈伤组织的质量是体胚诱导的关键因
素，继代培养胚性愈伤组织是种质资源离体保存
的一条重要途径；但胚性愈伤组织继代保存往往
表 2 Put处理对石刁柏体胚诱导的影响
Table 2 Effects of putrescine treatment on somatic
embryogenesis induction in A. officinalis
Put浓度 /mg·L-1
产生胚状体数 /个 ·g-1 (FW)
C0 C1 C4 C6
0 1 8 1 3 3 0
2 0 1 9 1 2 4 0
2 5 2 2 1 4 5 3
3 0 2 0 1 3 4 3
3 5 1 8 1 1 5 1
4 0 1 0 8 2 0
C 0 表示不继代的胚性愈伤组织；C 1、C 4 和 C 6 分别表示继
代 1、4 和 6 次的胚性愈伤组织。
图 3 体胚诱导过程中外源 Put对愈伤组织内源多胺含量的影响
Fig.3 Effects of putrescine treatment on endogenous polyamine contents during somatic embryo induction
图 2 胚性愈伤组织继代过程中外源 Put对内源多胺含量的影响
Fig.2 Effects of putrescine treatment on endogenous polyamine contents during embryogenic callus subculture
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伴随着胚性的丧失(黄璐和卫志明 1999)。石刁柏
胚性愈伤组织在继代过程中用Put处理后一定程度
上延缓了胚性的丧失。内源多胺含量检测显示，
Put可提高胚性愈伤组织中内源 Put含量。Yadav
和 Rajam (1998)在茄子离体培养中曾观察到，高
胚性的叶原基顶端区域的多胺尤其是Put的含量高
于胚胎发生能力低的叶基部区域，经 Put处理 4~7
d的叶原基能明显改善其胚胎发生能力，这暗示
外源 Put可能通过提高内源Put含量促进细胞胚性
的获得和保持。最近，Silveira等(2006)报道，3
种外源多胺对南洋杉(Araucaria angustifolia Bert.)
胚性培养物的生长、形态进程和一氧化氮(nitric
oxide，NO)合成有着不同的影响，Put可有效促
进胚性培养物释放 NO，胚性细胞比悬浮细胞积
累更多的 NO。因此，他们推测 Put可能通过调
节NO的生物合成保持胚性悬浮细胞极性(Silveira
等 2006)。
较多的研究认为，外源 Put能促进体胚发生
(胡忠等 2001；Yadav和 Rajam 1997, 1998)。但
也有报道认为，外源 Put并不能提高体胚的诱导
率或促进体胚发生(Meijer和 Simmonds 1988；
Calheiros等 1994)。本文结果也显示，外源 Put对
胚胎发生诱导率的影响不明显。这可能与植物物
种或基因型有关。石刁柏离体培养过程中，外源
P u t 能减少胚性愈伤组织的褐变。在松( Pi n u s
virginiana Mill.)中已经证明，外源Put能促进褐化
培养物转变成正常细胞，并能促进植株再生；褐
化的愈伤组织其 Put、Spd和 Spm含量都远低于非
褐化的愈伤组织(Wei和 Ronald 2004；Wei等
2004)。本文试验也得出相同的结果(图 2中 C0、
C6)，而且经外源Put处理过的胚性愈伤组织中Put
含量远高于未作 Put处理的(最高差距达 47.2%，
降幅也低于未作 Put处理的)。
要进一步阐明Put在保持胚胎发生能力、降低
褐化程度中作用的机制，可从 2个方面着手：一
是将外源多胺处理和多胺生物合成抑制剂处理结合
起来；另一个是用分子手段克隆和表达与 Put合成
和分解代谢相关的基因，如鸟氨酸脱羧酶(ornithine
decarboxylase，ODC)、精氨酸脱羧酶(arginine
decarboxyla se，ADC)、二胺氧化酶(diamine
oxidase，DAO)的基因等，弄清 Put在胚胎发生过
程中的代谢网络，有望揭示 Put的作用机制。
参考文献
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