全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 6期，2007年 12月 1025
收稿 2007-07-05 修定　 2007-09-24
资助 国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAI06A12-04)。
* 通讯作者(E-mail：zzwang@snnu.edu.cn；Tel：029-
8 5 3 1 0 2 6 )。
丹参中病程相关蛋白基因 SmSTH-2的生物信息学分析
曹晓燕 1,2，刘丛玲 2，王 之 1,2,*
1药用植物资源与天然药物化学教育部重点实验室，西安 710062；2陕西师范大学生命科学学院，西安 710062
提要：对丹参 cDNA文库的表达序列标签(EST)序列进行BLAST分析显示，其中一条序列与病程相关蛋白基因 STH-2有
较高的同源性。该序列全长 691 bp，包含 1个长 483 bp的开放阅读框(ORF)，编码 160个氨基酸，命名为 SmSTH-2。生
物信息学分析显示：SmSTH-2所编码蛋白的分子质量为 17 990 Da，等电点为 5.15，富含谷氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丝氨
酸，无信号肽，属于稳定类蛋白。与NCBI注册的其他6种植物来源的病程相关蛋白基因编码的氨基酸序列的同源性在
42%~46%之间。实时荧光定量PCR的方法检测丹参不同组织部位中SmSTH-2表达和病原菌对该基因诱导表达的影响的
结果表明：SmSTH-2在植物的根、茎、叶中均有不同程度的表达，其表达丰度为根>叶>茎；丹参叶片接种黄瓜细菌性角
斑病病原菌后，4 d内可诱导该基因的表达量持续增加。用PCR方法从基因组水平克隆到SmSTH-2的DNA序列，测序表
明 SmSTH-2的编码序列在DNA水平上含有一个 71 bp的内含子，DNA序列注册号为 EF621486。
关键词：病程相关蛋白；丹参；实时荧光定量 PCR；生物信息学
Pathogenesis-Bioinformatics Analysis of Pathogenesis-related Protein Gene
SmSTH-2 in Salvia miltiorrhiza Bge.
CAO Xiao-Yan1,2, LIU Cong-Ling2, WANG Zhe-Zhi1,2,*
1Key Laboratory of Ministry of Education for Medicinal Plant Resource and Natural Pharmaceutical Chemistry, Xi’an 710062,
China; 2College of Life Sciences, Shaanxi Normal University, Xi’an 710062, China
Abstract: cDNA library of Salvia miltiorrhiza was constructed. All the sequences of expressed sequence tags
(EST) were analyzed by BLAST approach of NCBI. One of these sequences which showed high homology with
pathogenesis-related protein STH-2 was found. The sequence is 691 bp, containing a 483 bp open reading frame
(ORF) and encoding 160 amino acid-peptide, and is named SmSTH-2. Bioinformatics analysis showed that the
calculated molecular mass is 17 990 Da, theoretical isoelectric point is 5.15, the deduced amino acids are rich in
glutamic acid, lysine, glycin and serine; STH-2 is a stable protein without signal peptide. Amino acid homology
of the SmSTH-2 compared with those submitted to NCBI in other six plants ranged from 42% to 46%. Real-time
fluorescent quantitative PCR was used to detect the expression of SmSTH-2 in different organs of S. miltiorrhiza
and different time on pathogen inoculation. The result showed that the expression of SmSTH-2 is the most
abundant in root, followed by in leaf, and the least in stem. The expression of SmSTH-2 increased within 4 d
after pathogen inoculation. Meanwhile, the DNA sequence of the STH-2 was cloned by PCR and the result
showed that there is a 71 bp intron in the encoding region. GenBank accession number of the DNA sequence is
EF621486.
Key words: pathogenesis-related protein; Salvia miltiorrhiza; real-time fluorescent quantitative PCR; bioinformatics
病程相关蛋白(pathogenesis-related protein，
PRP)是植物在病理或与病理相关的环境下诱导产
生的一类低分子量蛋白，广泛存在于植物体中。
研究证实，病程相关蛋白的产生与植物系统获得
抗性发生密切相关(王海燕等 2007)。在有些植物
中，还有人用病程相关蛋白的表达量作为植物抗
病反应的生化指标(臧威等 2006)。
目前，已分离到多种病程相关蛋白基因，
并对它们的结构和功能进行了广泛的研究，它们
己成为植物抗性改良工程中的基因资源(Van Loon
和 Van Strien 1999)。本文用 BLAST分析丹参
cDNA文库的表达序列标签(expressed sequence
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tags，EST)序列时，观察到其中一条序列与一
些生物的病程相关蛋白STH-2基因有较高的同源
性。用生物信息学分析方法分析丹参( S a l v i a
miltiorrhiza)、马铃薯(Solanum tuberosum)、欧
洲甜樱桃( P r u n u s a v i u m )、垂枝桦( B e t u l a
pendula )、辣椒(Caps icum ch inense )、豇豆
(Vigna unguiculata)和毛葡萄(Vitis quinquangularis)
的病程相关蛋白的同源性和理化性质，用实时荧
光定量 PCR检测丹参根、茎和叶中 STH-2基因
的表达和以黄瓜细菌性角斑病病原菌接种丹参叶
片后，观察植物病原菌接种丹参叶片后诱导丹参
STH-2基因的表达情况，为此基因的进一步研究
和应用提供参考。
材料与方法
丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)种子经灭菌处
理，接种在含MS固体培养基的三角瓶中，放在
人工气候箱(宁波江南仪器厂，型号为RXZ-500D)
中萌发，温度 25 ℃，湿度 48%，光照强度 216
µmol·m-2·s-1，光照时间 12 h·d-1，待长出 6片真叶
时备用。Biozol试剂购于BioFlux公司；Bio RT逆
转录试剂盒购于杭州博日科技有限公司；SYBR
Premix Ex Taq购于宝(TaKaRa)生物公司；PCR产
物回收试剂盒购自北京天为时代科技有限公司；
克隆载体 pGEM-T Easy Vector购自Promega公司。
黄瓜细菌性角斑病病原菌(Pseudomonas lachrymans)
菌株购于北京农业科学院，培养于KB (金氏)培养
基(20 g蛋白胨、1.5 g K2HPO4、1.5 g MgSO4、
20 g琼脂，加水至 1 L，pH为 7.0~7.2)，于 28 ℃
下培养活化。cDNA文库的构建方法见参考文献
(王铭楷等 2004)。
马铃薯( A c c e s s i o n：P 1 7 6 4 2 )、甜樱桃
(Accession：AAS47035)、垂枝桦(Accession：
CAA54696)、辣椒(Accession：CAI48023)、豇豆
(Accession：BAA92224)和毛葡萄(Accession：
ABD78555)病程相关蛋白的氨基酸序列来自National
Center for Biotechnology Information (NCBI)。根据
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.cbs.dtu.
dk/、http://cn.expasy.org/网站提供的各类生物信息
学软件进行在线分析。氨基酸序列的组成成分分
析、理化性质分析、开放阅读框(open r eading
frame，ORF)的查找和翻译用 Prot Param、ORF
Finder在线工具进行；氨基酸序列的同源性比对用
BLASTX在线工具完成；蛋白质信号肽的预测、
跨膜结构域、亲水性 / 疏水性、二级结构和三维
结构的分析用在线工具 S i gn a l P、T M H M M、
ProtScale、SOPMA、SWISS-MODEL完成。
取长出 6 片真叶时的丹参完整植株，采用
CTAB法提取丹参总DNA。设计一对PCR特异性
引物(包含整个ORF)：上游引物为 5 TATGGAT-
CCATCAAGCAAAAATGGGTGTGAAGAG 3，下
游引物为 5 AAACTGCAGGTTGGTTGAAGAAAA-
GCAAACACAG 3。以丹参总DNA为模板进行PCR
反应，反应程序为：94 ℃变性 3 min；94 ℃变
性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，30
个循环；72 ℃延伸 10 min。PCR 产物回收与
pGEM-T Easy Vector连接。用TSS法转化DH5α，
将细菌涂布于含 α-氨基苄青霉素 /IPTG/X-Gal的
LB固体培养基上，在 37 ℃下培养过夜，于 24 h
内挑取白色单菌落；经菌落 PCR检测为阳性的菌
落由北京澳科生物技术有限公司测序。
挑取处于指数生长期的黄瓜细菌性角斑病病
原菌菌落，用 10 mmol·L-1 MgCl2液悬浮制成菌悬
液，测得波长 600 nm处光的吸收值为 0.231，接
种于生长健壮的丹参叶片上，并用接种环适当在
叶表面造成创伤，丹参放入人工气候箱中继续培
养，分别在接种后 24、48、72、96 h取样，样
品置于液氮中冷冻后放在 –80 ℃冰箱中保存。以
不作处理的丹参幼苗为对照。
用 Biozol试剂分别提取丹参根、茎、叶及不
同处理的总RNA，以1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA
质量。以提取的总 RNA为模板，按照 Bio RT逆
转录试剂盒说明合成丹参cDNA第一链，以cDNA
第一链为模板进行荧光定量 PCR。对所得的反转
录产物用丹参GAPDH基因的引物检测，上游引
物：5 CCACCGTCCACTCCATCACT 3，下游引
物：5 GGGAACTCGGAACGACATAC 3，反应体
系为 20 µL (1 µL cDNA、10 µL 2×Taq mix、引物
各 1 µL、7 µL水)。反应条件：95 ℃变性 3 min；
95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40个循环。产物用 2%
琼脂糖凝胶电泳检测。
SmSTH-2进行实时荧光定量PCR检测时，以
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丹参GAPDH基因为内参，进行 STH-2基因的荧
光定量分析，上游引物：5 TCAAGGCTTTGGT-
GACAGAATC 3，下游引物：5 GGTCGATCTC-
GTCCACTCTG 3，采用Takara公司的SYBR Premix
Ex Taq，反应体系 20 µL (1 µL cDNA、10 µL
SYBR、引物各 0.2 µL、8.6 µL水)。反应条件：
95 ℃变性 3 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，40个
循环，60~95 ℃每上升 0.5 ℃收集一次荧光，每
次 10 s，绘制融解曲线，每个样品重复 3 次。
结果与讨论
1 SmSTH-2编码的氨基酸序列及同源性比对
对丹参cDNA文库的EST序列进行BLAST分
析的结果显示，一条序列与病程相关蛋白 STH-2
基因有较高的同源性。与已注册的其他 6种植物
来源的病程相关蛋白基因编码的氨基酸序列同源性
分别为马铃薯 46%、甜樱桃 44%、垂枝桦 45%、
辣椒 44%、豇豆42%、毛葡萄42%。用ORF Finder
在线工具查找确定其 ORF和编码氨基酸序列(图
1)，该序列全长 691 bp，包含 1个长 483 bp的
ORF，编码 160个氨基酸，将其命名为 SmSTH-2。
2 不同植物 STH-2的对应氨基酸序列组成和理化
性质分析
根据 http://cn.expasy.org/网站提供的 Prot
P a r a m 分析丹参、马铃薯、甜樱桃、垂枝桦、
辣椒、豇豆和毛葡萄 7种植物中病程相关蛋白的
氨基酸序列的结果(表 1)表明，这几种植物的病程
相关蛋白分子量基本一致，均富含赖氨酸和谷氨
酸，是一类酸性蛋白，都为稳定类蛋白。
3 丹参中 STH-2蛋白的亲水 /疏水性、信号肽及跨
膜结构域的预测
蛋白质亲水 /疏水性的预测和分析，是进行
图 1 SmSTH-2的 cDNA序列及编码的氨基酸序列
Fig.1 The cDNA sequence and deduced amino acid sequence of SmSTH-2
方框内为 O R F。
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蛋白质二级结构预测以及功能域划分的一个必要过
程。用 ProtScale预测丹参 STH-2蛋白的氨基酸序
列疏水性 /亲水性的结果显示，最低值为 –2.367，
最高值为 1.700，总体表现为亲水性。
信号肽是一段引导新合成的肽链进入细胞器
的识别序列。因此，信号肽的预测与分析对了解
蛋白质的亚细胞定位与功能作用途径和机制有一定
的意义(韩立敏和王喆之 2006)。用 SignalP 3.0
Server工具预测丹参 STH-2蛋白信号肽的结果显
示，该蛋白无信号肽。
用 TMHMM 2.0 Server预测丹参 STH-2氨基
酸序列的跨膜结构域的结果显示，该蛋白无跨膜
区域。初步推测该蛋白在核糖体中合成后不进行
转运，属于胞质蛋白，在细胞质中起作用。
4 SmSTH-2编码氨基酸的高级结构预测
用SOPMA预测SmSTH-2编码氨基酸序列的二
级结构的结果显示，α-螺旋、不规则卷曲、β-折
叠是丹参病程相关蛋白 STH-2最大量的结构元件。
统计表明，丹参中病程相关蛋白STH-2的二级结构
由 32.50% 的 α- 螺旋、30.00% 的不规则卷曲、
27.50%的 β-折叠和 10.00%的 β-转角组成。这些
结果在马铃薯、甜樱桃、辣椒、垂枝桦、豇豆和
毛葡萄的病程相关蛋白 STH-2中也有相同的表现。
用SWISS-MODEL预测该基因所编码氨基酸的
蛋白质三级结构并结合MolMol软件得到的蛋白质三
维结构(图 2)显示，三维结构中含有 3个α-螺旋和
7个β-折叠。我们同时对马铃薯病程相关蛋白STH-
2的空间结构进行了预测，结果显示，马铃薯与丹
参中病程相关蛋白STH-2在空间结构上具有很高的
相似性，同样含有 3个 α-螺旋和 7个 β-折叠。
表 1 不同植物中病程相关蛋白的理化性质比较
Table 1 Comparison on physical and chemical characters of pathogenesis-related proteins among different plants
氨基酸 分子量 / 理论 酸性氨基酸 碱性氨基酸 蛋白质
残基数 Da 等电点 比例 /% 比例 /% 不稳定性指数
丹参 160 17 990.5 5.15 谷氨酸 10.0，赖氨酸 11.2， 17.0 12.5 37.09
甘氨酸 7.5，丝氨酸 7.5 (属于稳定类蛋白)
马铃薯 155 17 294.7 5.66 赖氨酸 11.0，谷氨酸 8.4， 15.0 12.0 26.46
亮氨酸 8.4，缬氨酸 8.4 (属于稳定类蛋白)
甜樱桃 160 17 350.5 4.98 赖氨酸 10.0，甘氨酸 8.8， 16.0 11.0 20.05
异亮氨酸 8.8，谷氨酸 8.1 (属于稳定类蛋白)
垂枝桦 160 17 421.7 5.74 甘氨酸 10.0，赖氨酸 10.0， 14.0 11.0 25.55
异亮氨酸 9.4，谷氨酸 9.4 (属于稳定类蛋白)
辣椒 156 17 170.5 5.22 赖氨酸 10.9，缬氨酸 11.5， 17.0 12.0 23.10
谷氨酸 9.6，亮氨酸 8.3 (属于稳定类蛋白)
毛葡萄 159 17 419.8 6.06 异亮氨酸 10.1，赖氨酸 10.1， 14.0 12.0 35.25
甘氨酸 8.8，谷氨酸 8.2 (属于稳定类蛋白)
豇豆 160 17 339.7 4.93 丙氨酸 10.6，谷氨酸 10.0， 17.0 11.0 23.82
赖氨酸 10.0，亮氨酸 9.4 (属于稳定类蛋白)
图 2 SmSTH-2编码氨基酸的三维结构预测
Fig.2 Predicted 3-D structure of the deduced
amino acid sequence of SmSTH-2
5 内含子检测
以丹参总DNA为模板进行 PCR扩增，扩增
到一条 600多 bp的特异性条带。对扩增片段进行
测序，测序结果与 cDNA序列进行比较分析，发
现该基因在DNA序列上存在一个 71 bp的内含子
(图 3)。将该基因的DNA序列在GenBank上注册，
植物 含量丰富的氨基酸 /%
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登陆号为 EF621486。
6 SmSTH-2的实时荧光定量 PCR反应
以GAPDH基因为内参，进行 SmSTH-2基因
的荧光定量分析，并根据每一样品的扩增曲线的
Ct值计算目的基因表达量的结果显示，SmSTH-2基
因在根中的表达量最高，叶和茎中次之(图 4)。丹
参叶片接种黄瓜细菌性角斑病病原菌后的 4 d内
SmSTH-2基因表达量逐渐升高，96 h时达到最高
值，为未接种病原菌的 8.9倍(图 5)。
及其他一些双子叶植物中的研究显示，植物抗病
性产生前后，细胞中积累大量病程相关蛋白(臧威
等 2006)。如分别用不同诱导剂处理烟草(杜良成
和王钧 19 90 )，番茄斑枯萎病菌( Ve rt ic i l l i um
tricorpsis)和角斑病菌诱导黄瓜(Uritani 1971)，以
及瓜类刺盘孢菌(Colletotrichum orbiculare)诱导哈
密瓜后(李冠等 1989)，在这些植物细胞中都可分
离到病程相关蛋白。
总之，病程相关蛋白 STH-2基因的研究还比
较少，在此种基因功能分析中，只有Constabel等
(1993)将病程相关蛋白 STH-2基因转入马铃薯，
并用病原菌X感染转基因马铃薯，观察到转基因
的马铃薯对病原菌并不表现出抗性，推测此蛋白
图 4 SmSTH-2在根、茎、叶中的表达量
Fig.4 Expression of SmSTH-2 in the root, stem and leaf
图 5 黄瓜细菌性角斑病病原菌诱导 SmSTH-2
不同时间后的表达量
Fig.5 Expression of SmSTH-2 after infected by P. lachrymans
病程相关蛋白的表达在植物的抗病反应中具
有重要意义，成为近年来植物抗病研究领域的一
个热点(萨其拉等 2001)。许多研究表明，病程相
关蛋白在植物体受到病原菌侵染后，植物细胞内
会大量积累病程相关蛋白。烟草、黄瓜、棉花
图 3 DNA测序结果
Fig.3 DNA sequence
方框内为内含子序列。
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在植物防御系统中可能不起主导作用。至于此基
因在植物抗病中的确切作用、起作用途径以及与
植物抗病性有关的其他蛋白，如脂质体转移蛋
白、硫素蛋白等之间的关系均待进一步研究。
参考文献
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