全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月862
根癌农杆菌介导的雪莲冷诱导蛋白基因对薰衣草遗传转化的初步研究
邢文超1,2 贠强1,* 赵民安1 曹旭1
1 中国科学院新疆理化技术研究所，乌鲁木齐 830011；2 中国科学院研究生院，北京 100039
提要 预培养 6 d 的薰衣草下胚轴在添加 100 µmol·L-1 乙酰丁香酮(AS)的根癌农杆菌重悬液中浸染 10 min 后共培养 2~3 d，
再经过 7~10 d 的恢复培养之后用包含 10 mg·L-1 潮霉素 B 和 200 mg·L-1 头孢霉素的筛选培养基进行筛选是较为理想的遗传
转化条件。通过GFP观察和GUS染色以及对筛选得到的抗性芽的PCR检测证明，外源目的基因(雪莲冷诱导蛋白基因scp)
已整合到薰衣草基因组中，阳性率为 40%。
关键词 薰衣草；根癌农杆菌介导；遗传转化；下胚轴
Genetic Transformation of Lavandula angustifolia cv. Munstead by Way
of Cold-inducible Protein Gene (scp) from Saussurea involucrata Mediated by
Agrobacterium
XING Wen-Chao1,2, YUN Qiang1,*, ZHAO Min-An1, CAO Xu1
1Xinjiang Technical Institute of Physics & Chemistry, Chinese Academy of Sciences, Urumqi 830011, China; 2Graduate University
of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039, China
Abstract The factors, including precultivation time, immersion time, cocultivation periods and concentration
of acetosyringone (AS), were thoroughly investigated so as to establish the high efficient transformation sys-
tem mediated by Agrobacterium tumefaciens of Lavandula angustifolia cv. Munstead. The optimized transfor-
mation protocol was obtained when hypocotyls explants precultured for 6 d on regeneration medium were
immersed into the diluted Agrobacterium suspension containing 100 µmol·L-1 AS for 10 min and then were co-
cultured for 2–3 d with Agrobacterium and finally were subcultured on selection medium after reinforcing
cultivation for 7–10 d on the regeneration medium containing 200 mg·L-1 cefotaxime alone. Evidence for stable
integration was obtained by GUS staining assay, GFP observation and PCR assay, and the positive rate was
40%.
Key words Lavandula angustifolia cv. Munstead; Agrobacterium-mediated; transformation; hypocotyl
收稿 2006-02-24 修定　 2006-08-29
资助　 中国科学院西部行动高新技术项目(KGCX2-SW-506)和
中科院百人计划项目(2002)。
*通讯作者(E-mail: yunq@ms.xjb.ac.cn, Tel: 0991-3838277)。
薰衣草(Lavandula angustifolia cv. Munstead)
是唇形科薰衣草属多年生半阴性亚灌木，有强烈
芳香气味，原产于地中海(姚雷和张少艾 2002)，
广泛应用于医药﹑食品和化妆品生产中(孙捷和范
为宇2004；王玉芹等2004)。新疆是我国薰衣草
主要的生产基地，但与地中海地区不同的是，新
疆地处欧亚大陆腹地，荒漠面积大，气候干旱，
昼夜温差和季节温差大。环境的差别导致新疆地
区种植的薰衣草种质退化，精油质量下降，影响
了其国际市场竞争力。另外，根癌农杆菌介导的
遗传转化方法由于具有操作简单、培养周期短、
导入的外源基因插入的拷贝数低、插入的目的基
因完整、外源基因的整合率和表达率高等优点，
是常用的转化手段(于景华等 2002)，迄今所获得
的200种转基因植物中80%以上是用根癌农杆菌转
化系统产生的。而目前国内外关于薰衣草遗传转
化的研究报道还非常少。1999 年，Dron n e 等
(19 9 9 )最先报道根癌农杆菌介导大薰衣草(L.
angustifolia Mill×L. latifolia Medic.)的遗传转化是
可行的，2000年，Nebauer等(2000)又报道了根
癌农杆菌介导的宽叶薰衣草(L. latifolia)遗传转
化方法。但这些研究大多以证明根癌农杆菌介导
的薰衣草遗传转化方法的可行性为目的，并没有
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使用任何有意义的目的基因，而且以薰衣草叶盘
为外植体建立的遗传转化体系也存在着转化周期长
和转化率低等缺点。基于这些，本文以薰衣草下
胚轴为外植体材料，以雪莲冷诱导蛋白基因
(Saussurea involucrata cold-inducible protein, scp)为
目的基因，根据各种影响根癌农杆菌介导薰衣草
下胚轴外植体遗传转化频率因素的预备实验结果，
建立了薰衣草高效的遗传转化体系，为进一步改
良薰衣草抗逆性建立基础资料。
材料与方法
薰衣草(Lavandula angustifolia cv. Munstead)
品种‘法国孟士德’的种子由新疆芳香科技有限
公司提供。挑取饱满的薰衣草种子，于40℃温水
中浸泡，水凉后继续浸泡24 h。将经过浸泡的薰
衣草种子，流水冲洗30 min，75%的乙醇漂洗30
s，无菌水冲洗 1 次后，用 0.2% 的优氯净溶液浸
泡20 min，再用无菌水冲洗4~5次。然后将种子
接种于 MS 固体培养基中，置于(25±1)℃，每天
8 h光照(光照强度为30 µmol·m-2·s-1)、16 h暗培
养条件下培养。
用种子萌芽的无菌苗的下胚轴(苗龄10 d)为外
植体材料进行遗传转化研究。
采用热激转化法把pCAMBIA1304/scp转入根
癌农杆菌菌株 EHA105 中，该质粒含有 CaMV35S
启动的 scp、b-葡萄糖苷酸酶基因(gus)、绿色荧
光蛋白基因(gfp)和CaMV35S启动的潮霉素磷酸转
移酶基因(hptII)，其编码产物对潮霉素B具有抗
性。质粒 pCAMBIA1304/scp 由本实验室构建。
外植体预培养时，取种子萌发的无菌苗的下
胚轴剪成0.5 cm大小的茎段接种于直接分化出芽
培养基(MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA)上进行
预培养。
准备菌液时，挑取含有质粒 pCAMBIA1304/
scp的农杆菌EHA105接种于含有50 mg·L-1卡那霉
素的液体YEP培养基(10 g·L-1蛋白胨+10 g·L-1酵
母浸膏+5 g·L-1牛肉浸膏)中，于28℃下、置于160
rpm 的摇床上振荡培养过夜，菌体以 3 500×g 离
心 10 min 后重悬于 MS 液体培养基中[附加 100
µmol·L-1乙酰丁香酮(acetosyringone, AS)]，调整
OD600至0.3~0.6之间，并于28℃中，置于160 rpm
的摇床上振荡培养1 h 后备用。
将经过预培养的下胚轴浸入菌液中，轻轻摇
晃数分钟。用无菌滤纸吸干外植体上的菌液，接
入共培养培养基(MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-
BA)中进行共培养，共培养时间为 2~5 d。经过
共培养的外植体，接入恢复培养基[MS+0.5 mg·L-1
IAA+2.0 mg ·L-1 6-BA+200 mg ·L-1 头孢霉素
(cefotaxime, cef)]中进行恢复培养，恢复培养时间
为7~10 d。经过恢复培养的外植体接入筛选培养
基(MS+0.5 mg·L-1 IAA+2.0 mg·L-1 6-BA+10 mg·L-1 潮
霉素B+200 mg·L-1 cef)中进行筛选培养，每15 d
继代 1 次。
以上所有培养基中均加 3% 的蔗糖、0.6% 的
琼脂，pH 5.85~5.95。
GUS 染色分析时，分别取经过 5 d 恢复培养
的外植体材料和30 d筛选培养的抗性芽，按王关
林和方宏筠(2002)介绍的方法略有改动，进行
G U S 染色分析。
GFP 检测时，取经过 60 d 筛选培养的抗性
芽，在倒置荧光显微镜(Leica Microsystem Wetzlar
Gmbh)下观察 gfp 的表达情况。
P C R 检测时，取经过潮霉素 B 筛选的抗性
芽，按照CTAB 法(闫新甫 2003)提取植物基因组
D N A，以其为模板进行 P C R 扩增。P C R 引物由
上海生工合成。引物序列分别为：F，5 TTAAC-
C A T G G G G A G C A G T G C G G C T C G C A G G G C 3 ；
R，5 GGTTACTAGTCTATGCGAACGGCCTCTG-
GTATGTAC 3。
PCR 反应体系：PCR 反应缓冲液(10×) 5
µL，MgCl2 (25 mmol·L-1) 3 µL，引物 1和引物2
(10 pmol·L-1) 2 µL，dNTP (10 mmol·L-1) 1 µL，模
板(0.1 µg·mL-1) 2 µL，Taq DNA聚合酶(5 U·µL-1)
0.5 µL，最后加水至50 µL。PCR反应条件：94℃
预变性10 min；94℃变性40 s，55℃复性1 min，
72℃延伸 90 s，共 35个循环；最后72℃延伸 10
m i n。
Southern 杂交检测时，用HindⅢ酶切转化及
对照植株的基因组 DNA。酶切完全后，在 1.0%
的琼脂糖凝胶上进行电泳，再转移到硝酸纤维素
膜上。参考奥斯伯等(1999)的步骤进行杂交和检
测。所用探针为随机引物标记系统标记的scp基因
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片段，约600 bp。探针制备方法参考宝生物工程
(大连)有限公司的随机引物标记试剂盒操作说明
书，略有改动。
结果与讨论
1 转化条件的优化
在遗传转化操作中预培养时间、浸染时间、
共培养时间以及AS浓度等因素都会影响遗传转化
的效率，本文考察了其对遗传转化效率的影响，
最终确定了最佳的遗传转化条件为预培养6 d的薰
衣草下胚轴在添加100 µmol·L-1 AS的农杆菌重悬
液中浸染10 min后共培养2~3 d，再经过7~10 d
的恢复培养之后用包含10 mg·L-1 潮霉素 B和 200
mg·L-1 cef的筛选培养基进行筛选培养。另外，由
于农杆菌对植物带来的损伤较大，若直接用农杆
菌对植物材料进行浸染，会导致大量外植体死
亡。经过一定时间的预培养使植物材料对创伤部
位有所适应和反应对提高农杆菌的转化率十分重要
(于景华等 2002)。表 1~3 的结果显示：
(1) 预培养时间对薰衣草下胚轴的转化率有很
大的影响。当预培养时间小于 3 d 时，外植体大
量死亡；预培养时间大于 9 d 时，薰衣草下胚轴
的再分化已经启动，转化率明显降低。因此认为
预培养时间以6 d为宜(表1)。
需要确定合适的浸染时间，使其既能实现农杆菌
对外植体的转化又不会对外植体产生较强的毒害作
用。表 2 表明，随着浸染时间的增加，gus 基因
的瞬时表达率也随之增加(表 2)。浸染时间为 15
min的 gus瞬时表达率最高(90%)，但随着浸染时
间的延长，在后续培养过程中很难控制农杆菌的
生长，外植体由于农杆菌的毒害而很难成活。因
此，我们确定最佳的浸染时间为10 min，这既能
得到较高的转化效率，又不会由于后续培养中农
杆菌过度生长而导致外植体死亡。
表2 不同浸染时间对gus基因瞬时表达率的影响
Table 2 Effect of infection time on
transient expression of gus gene
浸染时间/min gus基因瞬时表达 gus基因的瞬 的外植体数/个 时表达率 /%
3 20 66.7
5 22 73.3
7 24 80.0
10 26 86.7
15 27 90.0
　　
(3) 共培养时间的长短也是影响转化效率的一
个重要因素。由于农杆菌附着后不能立即转化，
需要经过一段“细胞调节期”后才能诱发 T-DNA
的转移，一般的“细胞调节期”为 16 h，因此
共培养时间必须长于 16 h；但共培养时间太长，
农杆菌过度生长使植物细胞受到毒害而死亡。所
以合适的共培养时间是一个好的转化系统所必需的
(王关林和方宏筠2002)。本文结果表明，共培养
时间以 2~3 d 为宜；共培养时间为 5 d 时由于农
杆菌的过度生长，外植体因缺氧而软腐，很难再
恢复生长。
另外，共培养之后外植体的生长能力变弱，
如果直接对其进行筛选培养，已经转化的细胞由
于生长能力变弱而导致对抗生素抗性变弱而死亡。
因此，共培养之后将外植体接入不含筛选剂的培
养基上进行一段时间的恢复培养是必要的，待外
植体恢复正常生长能力后，再转移到筛选培养基
上进行筛选培养。本文中以恢复培养7~10 d的效
果为最好。
(4) 植物和菌株相互作用的基础是细菌具有趋
表1 预培养时间对gus基因瞬间表达率的影响
Table 1 Effect of precultivation time on
transient expression of gus gene
预培养时间/d gus基因瞬时表达 gus基因的瞬 的外植体数/个 时表达率 /%
3 11 36.1±0.5
6 25 83.3±0.7
9 20 66.7±0.3
12 12 40.0±0.4
　　每个实验的外植体均为30 个，实验结果为3 次实验的平均
值。下表同此。
(2) 农杆菌对外植体的浸染时间直接影响转化
的频率和外植体的生长情况。浸染时间太长或太
短都不利于农杆菌的转化。浸染时间太短影响农
杆菌的附着效果，导致转化率降低；浸染时间太
长，外植体常因农杆菌的毒害缺氧而软腐。因此
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化性，即菌株对植物细胞所释放的化学物质产生
趋化反应。研究表明，根癌农杆菌对一些酚类化
合物具有趋化性。根癌农杆菌Ti质粒的Vir区基
因对T-DNA 的转移起介导作用，而这些酚类化合
物正是Vir 区基因活化的诱导物。其中，AS被证
明是诱导能力最强的酚类化合物(于景华等2002)。
本文测定不同浓度AS下的gus基因的瞬时表达率
结果(表3)表明，添加100 µmol·L-1 AS的gus瞬间
转化效率提高 6 4 %，进一步提高 A S 浓度( 2 0 0
图1 薰衣草下胚轴和抗性芽的GUS染色
Fig.1 GUS staining of hypocotyls and resistant shoots of L. angustifolia
　　a：肉眼观察的下胚轴 G U S 染色；b：显微镜下观察的下胚轴 G U S 染色；c：肉眼观察的抗性芽 G U S 染色；d：显微镜下
观察的抗性芽 G U S 染色。
表3 AS浓度对gus基因瞬间表达率的影响
Table 3 Effect of AS concentration on
transient expression of gus gene
AS浓度/ gus基因瞬时表达 gus基因的瞬
µmol·L-1 的外植体数/个 时表达率/%
0 7 23.3±0.4
100 25 83.3±0.7
200 25 83.3±0.6
　　
图2 薰衣草抗性芽和PCR检测
Fig.2 The resistant shoots and PCR test of L. angustifolia
a：抗性芽；b：P C R 检测结果。1 ~ 1 1：转化植株；-：阴性对照(非转基因植株)；+：阳性对照(质粒)；M：D N A 标准分子量。
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µmol·L-1)对转化效率的影响不明显。
2 gus基因的表达
取恢复培养基上生长 5 d 的下胚轴，经 GUS
染色后观察，发现 gus 基因在切断处瞬时表达强
烈(图 1-a)。显微镜观察显示，gus基因不仅在切
口断面处瞬时表达强烈，而且在组织内部也有较
强的瞬时表达(图 1-b)。
取经过30 d筛选培养后得到的抗性芽进行GUS
染色后，观察 gus 基因在组织内部的表达情况。
结果表明，gus基因能够稳定表达(图 1-c)，显微
镜观察显示，gus 基因已整合进植物基因组 DNA
中(图 1-d)。
3 gfp基因的表达
取经过60 d筛选培养的抗性芽，在倒置荧光
显微镜可以观察到抗性芽中的绿色荧光(结果未列
出)。说明外源基因已经进入外植体中，并且可
以稳定地表达。
4 抗性芽的PCR检测
随机抽取经过60 d筛选培养的抗性芽20株(图
2-a)，提取总 DNA 进行 PCR 检测，其中 8 株得
到了与阳性对照相同的片段(图 2-b)，阳性率为
4 0 % 。
5 抗性芽的Southern杂交检测
PCR 检测灵敏、快捷，可对转基因植株进行
快速检测，但 P C R 检测易出现假阳性，只能作
为初筛。而 Southern 杂交可清除操作过程中的
DNA 污染和转化中的质粒残留所引起的假阳性信
号，准确度高，特异性强，是目前检测转基因
植株最权威的方法。因此，本实验取 P C R 检测
呈阳性的植物基因组DNA经 HindⅢ酶切消化后以
scp基因片段为探针进行Southern杂交，结果(图
3)表明，外源基因已经稳定整合进入薰衣草基因
组中，且都为单拷贝。
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图3 抗性芽的Southern杂交检测
Fig.3 Southern blotting analysis of resistant
shoots of L. angustifolia
　　1~ 1 0：转化植株的基因组 DN A；1 1：阴性对照(非转化
植株的基因组 DN A)；1 2：阳性对照(目的基因的 PCR 产物)。