全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月 457
水分亏缺条件下玉米根系PIP2-5基因的表达
吴安慧1,2,3 张岁岐1,* 邓西平1 山仑1
1中国科学院水利部水土保持研究所黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国家重点实验室， 陕西杨凌 712100；2中国科学院研
究生院，北京 100039；3 西北农林科技大学植物保护资源与病虫害治理教育部重点实验室，陕西杨凌 712100
提要 在 PEG-6000 模拟水分亏缺条件下，以微管蛋白基因为内参基因，水通道蛋白基因 PIP2-5 为检测基因，采用半定
量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)体系检测PIP2-5基因在玉米根系中的表达的结果表明，人工模拟水分亏缺条件下PIP2-
5 基因表达量高于正常水分条件下的。这暗示，水分亏缺条件下细胞 - 细胞途径对根系吸水的贡献可能增大。
关键词 玉米；根系；水通道蛋白；半定量 PCR
Expression of PIP2-5 in Maize Root Systems under Water Deficit
WU An-Hui1,2,3, ZHANG Sui-Qi1,*, DENG Xi-Ping1, SHAN Lun1
1State Key Laboratory of Soil Erosion and Dryland Farming on Loess Plateau, Institute of Water and Soil Conservation, Chinese
Academy of Sciences, Ministry of Water Resources, Yangling, Shaanxi 712100, China; 2Graduate University, Chinese Academy
of Sciences, Beijing 100039, China; 3Key Laboratory of Plant Protection Resources and Pest Management, Ministry of Education,
Northwest Sci-Tech University of Agriculture and Forestry, Yangling, Shaanxi 712100, China
Abstract To detect the expression of PIP2-5 in maize root systems under water deficit, semi-quantitative PCR
was used. The reference gene was tubulin. Maize seedlings were planted under the condition of hydroponics
culture in growth chamber. Water deficit was simulated by using PEG-6000. The results showed that PIP2-5
was up-regulated under water deficit, which supported the theory that the contribution of cell-to-cell pass-way
for root systems uptake maybe increased under water deficit.
Key words maize; root systems; water channel protein; semi-quantitative PCR
收稿 2005-10-24 修定 　2006-03-13
资助 国家自然科学基金(30571127)、中国科学院知识创新
工程重要方向项目(KZCX3-SW-444)和中国科学院水利
部水土保持研究所学科前沿科研专项经费。
*通讯作者(E-mail: sqzhang@ms.iswc.ac.cn, Tel: 029-
87010897)。
植物根系的抗旱性可以从生理、形态、解剖
三个方面来研究。近年来发现质膜和液泡膜上专
一性、高效性水分跨膜运输的通道——水通道蛋
白(aquaporin, AQP)，它介导细胞或细胞器与介质
之间快速被动的水的运输，是水分进出细胞的主
要途径，一些水通道蛋白是组成型表达，也有一
些受植物体内外在因子调节(如干旱、盐、激素、
蓝光)。Steudle和Henzler (1995)以及Steudle和
Heydt (1997)认为，水通道蛋白可能起阀门的作
用，它能可逆地提高水力导度，并在不利的条件
下促进植物吸水。其水分运输活性有受细胞生理
活动的调节的特点。因此人们对水分跨膜转运应
重新加以认识，这样才可以正确阐明植物的抗旱
机制，也可为改良作物抗旱性开拓新的思路。
玉米水通道蛋白家族由14个质膜水通道蛋白
(plasma membrane intrinsic proteins, PIPs)，13个
液泡膜水通道蛋白(tonoplast intrinsic proteins,
TIPs)，5个NOD26类似物(NOD26-like intrinsic
proteins, NIPs)和3个碱性的小分子量水通道蛋白
(small basic intrinsic proteins, SIPs)组成。但这个
家族基因的表达和调节以及相应的蛋白质功能的信
息依然有限。仅有 4 个玉米水通道蛋白的运输活
性已经得到检验：ZmPIP2-5 和 ZmTIP1-1 表现高
度水分运输活性，而ZmPIP1-1 和 ZmPIP1-2 的水
分运输活性尚未检测到(Gaspar等2003)。本文以
微管蛋白基因(tubulin)为内参照基因，玉米根系
中高丰度表达的水通道蛋白基因PIP2-5为检测基
因，研究人工模拟水分亏缺条件下PIP2-5基因在
玉米根系中的表达情况。
材料与方法
材料为黄土高原主栽玉米(Zea mays L.)品种
植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月458
‘户单四号’(抗旱)，由西北农林科技大学玉米
研究所育种室提供。试剂有Trizol、RNasin、M-
MLV、Taq DNA 聚合酶、凝胶回收试剂盒等主要
购自Promega 公司、Takara 公司和东洋坊公司。
pMD-18T 质粒购自 Takara 公司，受体大肠杆菌
(Escherichia coli) JM109由西北农林科技大学
植物保护资源与病虫害治理教育部重点实验室
保 存 。
挑选外形饱满的玉米种子经0.1%的 HgCl2 溶
液消毒 10 min 后，用自来水反复冲洗，再用蒸
馏水冲洗几遍，在蒸馏水中吸胀 6 h，然后放入
蛭石与石英沙(2:3)混合的培养介质中，在25℃培
养箱萌发。出苗大约3 d，当种子根长至5~6 cm
时，将苗移入高 20 cm，直径 18 cm 的塑料桶中
培养(苗基部用脱脂棉裹住，桶上部用泡膜作支
架)，塑料桶外部用双层黑塑料布遮光。每桶留
苗 3 株，每处理重复 6 次。起初在桶中装入蒸馏
水，植株适应生长24 h后换成营养液。营养液为
1/2Hoagland 全营养液。2 个水分处理：无水分
胁迫(对照)和用-0.2 MPa PEG-6000模拟干旱胁迫。
塑料桶放入日产KG-206SHL-D 型人工气候室
中培养，白天光照为250~300 mmol·m-2·s-1，光暗
周期为1 h/10 h，昼夜温度为27℃/20℃，空气
相对湿度(RH)为 60%~70%。每天用加氧泵向溶液
中通气3~4次，每次60 min，保证根系良好生长。
每48 h换1次营养液。幼苗长到第11天时于当天
上午10点用 -0.2 MPa PEG-6000 模拟干旱胁迫，
处理3.5、4.5 和 5.5 h 后，选取3株生长良好，
颜色鲜白且未接触桶底的对照和 PEG 胁迫植株根
系，快速称取 0.1 g，液氮速冻后，置于 -80℃
冰箱中保存备用(通气适宜、生长良好的根系无论
是主根还是侧根都幼嫩鲜白，活力强)。未胁迫
处理的材料与胁迫4.5 h的材料于同一时间取材，从
正常水分供应植株中选取，取样方法与前面相同。
总RNA的提取按照Trizol说明书进行。0.1%
普通琼糖凝胶电泳检测所提取的 R N A 无明显降
解，紫外分光光度计检测 OD260/280 达到 1.8~2.0
后，进行以下逆转录反应：1 mL oligo-d(T)18
(500 mg·L-1)，2 mg 总 RNA 加水至 12 mL，70℃
加热10 min，冰浴冷却5 min，然后加入4 mL 5×
第一链缓冲液、2 mL 10 mmol·L-1 dNTPs、1 mL
RNasin (30 U·mL-1)和 1 mL M-MLV逆转录酶 (200
U·mL-1)，轻轻混匀，37℃中孵育 60 min；70℃
中加热15 min 后终止反应。
PCR 反应条件及体系的建立参考 GenBank 登
录的序列自行设计引物，引物合成由上海生工生
物工程技术有限公司完成。 PIP2-5基因的引物为：
上游引物，5 CTCGTCTACACCGTCTTCTC 3；下
游引物，5 ATAACGACGCATGGCTAGAGG 3，
产物长度430 bp。微管蛋白基因的引物为：上游
引物，5 ACATCTGCCGCCGCTCCCTT 3；下
游引物，5 GCGCTGTTGGTGATTTCG 3，产物
长度253 bp。然后取 1 mL 上述逆转录产物，加
入上下游引物进行 PCR 反应，于94℃中预变性2
min；94℃变性50 s，56℃退火 40 s，72℃延伸
1 min，共 30个循环；72℃充分延伸10 min，用
于 P C R 扩增。
PIP2-5基因的克隆与测序中的凝胶产物回收
和连接到pMD-18T质粒分别参照Takara公司凝胶
回收试剂盒和 pMD-18T 质粒试剂盒的说明书进
行。感受态大肠杆菌的制备和转化参照《分子克
隆实验指南》(萨姆布鲁克和拉赛尔 2002)操作程序
进行，重组质粒转化至感受态宿主菌 JM10 9 中
后，根据蓝/白斑筛选，挑取白色菌落，菌落PCR
及抽提质粒 PCR 初鉴。阳性菌株测序由上海生工
生物工程技术有限公司进行。
建立半定量PCR 体系时采用上述的 PCR 体系
和循环参数，分别采用 25、28、31 个循环，确
定指数扩增期。再采用 28 个循环，扩增微管蛋
白基因，调整 cDNA 加入量，直至扩增出来的条
带在琼脂糖凝胶上看起来亮度一致为止。在28个
循环条件下，扩增目的基因 PIP2-5。
实验结果
1 PCR扩增片段的克隆与鉴定 　
以 PIP2-5 基因引物进行 PCR 扩增玉米根系
cDNA，得到约 430 bp 的扩增产物(图 1)。切胶
回收扩增产物，连接 pMD18-T 质粒，转化大肠
杆菌 J M 1 0 9 ，阳性克隆经测序证实所扩增的
PIP2-5基因片段与已知基因完全相符(图 2)。
2 微管蛋白基因的PCR扩增
以微管蛋白基因引物进行PCR扩增玉米根系
植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月 459
图1 PIP2-5扩增电泳图谱
Fig.1 Electrophoresis of PIP2-5
1 ：P I P 2 - 5 条带；2 ：分子量标记。
cDNA，得到约 253 bp 的扩增产物，与预期微管
蛋白基因扩增产物长度相符合(图 3)。
3 mRNA 表达的半定量分析
分别在 25、28、31 个循环下扩增，证明 28
个循环处于指数扩增初期(图 4)。在 28个循环数
下扩增，调整 cDNA 加入量，至微管蛋白基因扩
增产物条带达到亮度一致为止，确定扩增目的基
因 PIP2-5 时 cDNA 加入量后，再扩增目的基因
PIP2-5的结果表明：用PEG处理3.5 h后PIP2-5表
达量增长。PEG 处理 4.5 h 的 PIP2-5 表达量进一
步明显增大。PEG处理 5.5 h 的 PIP2-5 表达量有
图3 微管蛋白基因扩增电泳图谱
Fig.3 Electrophoresis of tubulin
1 ：分子量标记；2 ：微管蛋白基因。
所下降，但仍略高于正常供水条件下PIP2-5的表
达量(图 5)。这说明PIP2-5 是水分亏缺条件下根
系吸水有关的水通道蛋白基因，在水分亏缺条件
下其表达量增加，据此认为细胞 - 细胞途径对根
系吸水的贡献可能增大。
图4 不同循环数扩增微管蛋白基因
Fig.4 Amplification of tubulin under different cycles
　　1 ~ 3：2 5 个循环；4 ~ 6：2 8 个循环；7 ~ 9：3 1 个循环。
图5 28个循环下调整模板并扩增PIP2-5
Fig.5 Adjustment of template by tubulin and
amplification of PIP2-5 under 28 cycles
　　1 、2 ：对照；3 、4 ：P E G 胁迫 3 . 5 h ；5 、6 ：P E G
胁迫 4.5 h；7、8：PEG 胁迫 5.5 h。
讨　　论
水分胁迫条件下，细胞和单根水导的调控主
要是通过调节原生质膜上水通道蛋白的密度和活性
图2 PCR扩增获得的PIP2-5基因部分序列分析
Fig.2 Analysis of partial sequence of PIP2-5 amplified from PCR
植物生理学通讯 第42卷 第3期，2006年6月460
实现的，并且这种调节主要发生在具有高丰度转
录物的水通道蛋白中(Zhang 和 Tyerman 1999；
Clarkson等2000；Henzler和Steudle 2000； Lopez
等 2004)。玉米水通道蛋白基因PIP2-5、PIP2-1、
PIP1-1、PIP1-2、PIP1-5 分别为 ZmPIP2 和
ZmPIP1亚族中在根系中高丰度表达的基因(Hukin
等 2002；Lopez等 2003)。Lopez等(2003)的结果
表明，ZmPIP2 亚族对昼夜循环过程中水分跨细
胞运输的昼夜波动起主要作用。本文结果表明，
PEG处理5.5 h的玉米根系PIP2-5表达量略高于正
常供水条件下的PIP2-5 表达量，而PEG 处理 3.5
和4.5 h的PIP2-5表达量明显高于正常供水条件下
PIP2-5的表达量。虽然个别时间点上受PEG 胁迫
的 PIP2-5 表达量也微有增加，但总的来说，人
工模拟的水分亏缺比正常水分条件下的PIP2-5基
因表达量有增加的趋势。这暗示水分亏缺条件
下，细胞 - 细胞输水途径对根系输水的贡献可能
增大，PIP2-5基因是水分亏缺条件下根系吸水有
关的基因，其表达量的高低有可能与根系吸水能
力的强弱以及作物抗旱性的强弱有关，关于这一
点，我们正在作进一步验证。
参考文献
萨姆布鲁克 J, 拉赛尔 DW. 黄培堂译(2002). 分子克隆实验指南.
第3版. 北京: 科学出版社, 96~99
Clarkson DT, Carvajal M, Henzler T, Waterhouse RN, Smyth AJ,
Cooke DT, Steudle E (2000). Root hydraulic conductance:
diurnal aquaporin expression and the effects of nutrient stress.
J Exp Bot, 51: 61~70
Lopez F, Bousser A, Sissoëff I, Gaspar M, Lachaise B, Hoarau J,
Mahé A (2003). Diurnal regulation of water transport and
aquaporin gene expression in maize roots: contribution of
PIP2 proteins. Plant Cell Physiol, 44 (12): 1384~1395
Lopez F, Bousser A, Sissoëff I, Hoarau J, Mahé A (2004).
Characterization in maize of ZmTIP2-3, a root-specific
tonoplast intrinsic protein exhibiting aquaporin activity. J
Exp Bot, 55 (396): 539~541
Henzler T, Steudle E (2000). Transport and metabolic degrada-
tion of hydrogen peroxide in Chara corallina: model calcu-
lations and measurements with the pressure probe suggest
transport of H2O2 across water channels. J Exp Bot, 51:
2053~2066
Hukin D, Doering-Saad C, Thomas CR, Pritchard J (2002). Sensi-
tivity of cell hydraulic conductivity to mercury is coinci-
dent with symplastic isolation and expression of plasmale-
mma aquaporin genes in growing maize roots. Planta, 215:
1047~1056
Gaspar M, Bousser A, Sissoëff I, Roche O, Hoarau J, Mahé A (2003).
Cloning and characterization of ZmPIP1-5b, an aquaporin
transporting water and urea. Plant Sci, 165: 21~31
Steudle E, Henzler T (1995). Water channels in plants: do basic
concepts of water transport change? J Exp Bot, 46:
1067~1076
Steudle E, Heydt H (1997). Water transport across tree roots. In:
Rennenberg H, Eschrich W, Ziegler H (eds). Trees-contribu-
tions to modern tree physiology. Leiden, The Netherlands:
Backhuys Publ, 239~255
Zhang WH, Tyerman SD (1999). Inhibition of water channels in
intact wheats root cells by Hg. Plant Physiol, 120: 849~858