全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 1期，2004 年 2 月 83
收稿 2003-04-21 修定 2003-11-21
* 通讯作者（E-mail:zhangzhen_nj@hotmail.com, Tel:025-
4 3 9 5 2 6 6）。
中国李简单重复序列（SS R）反应体系的建立
乔玉山1 章 镇1,* 沈志军1 房经贵1 郭 洪2
1南京农业大学园艺学院, 南京 210095; 2江苏省农业科学院园艺研究所, 南京 210014
Establishment of Simple Sequence Repeat Reaction System in Prunus salicina
QIAO Yu-Shan1, ZHANG Zhen1,*, SHEN Zhi-Jun1, FANG Jing-Gui1, GUO Hong2
1College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095; 2Research Institute of Horticulture, Jiangsu Acad-
emy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014
提要 探讨中国李品种美丽李（Prunus salicina ‘Beauty’）简单重复序列（simple sequence repeat，SSR）反应体系中 5
种主要成分浓度对反应产物的影响。结果表明，引物对中国李有通用性，25 μ L SSR 反应体系中，Taq DNA 酶、Mg2+、
每个引物、模板 DNA 和 dNTPs 等 5 种成分的适宜浓度分别是：1.5 U、2.0 mmol.L-1、0.8 μ mol.L-1、30~40 ng 和
0.16~0.24 mmol.L-1。
关键词 中国李；SSR；反应体系
简单重复序列（simple sequence repeat,
SSR），又称为微卫星 DNA，是一类由 1~6 个碱
基组成的基序（motif）串联重复而成的 DNA 序
列。如：（G A ）n 、（C T ）n 、（G A C ）n 、
（G A T A）n 等重复，其中 n 代表重复次数，n 值
大小在 10~60 之间[1~3]。根据微卫星 DNA 两端序
列多是相对保守序列原理设计一对特异性引物，
采用PCR 技术扩增每个位点微卫星 DNA 序列，再
通过电泳分析核心序列长度的多态性，即为 SSR
多态性标记。SSR 标记多态性百分率高，重复性
好。一般检测到的是一个单一的复等位基因位
点，且呈共显性，因此作为一种遗传标记在植物
遗传育种领域有广阔的应用前景。
SSR 分子标记在遗传育种中应用的基础是引
物的开发，但开发 SSR 引物需要建立基因组 DNA
文库，从中克隆测序[1~3]，这需要一定的时间和
经费。迄今利用相近物种中已开发的引物应用到
另一物种的报道已很多[4~11]，这说明植物近缘种
能 共 享 部 分 引 物 。 核 果 类 果 树 均 属 李 属
（Prunus）植物，已有关于桃（P. persica）SSR
引物用于其他李属果树的报道[ 5 ~ 1 1 ] ，如杏
（P. armeniaca）[5~8,10]、甜樱桃（P. avium）[7,10]、
酸樱桃（P. cerasus）[7,8~10]、P. serotina[9]、中
国李（P. salicina）[10]、欧洲李（P. domestica）[7,10]、
扁桃（P. dulcis）[7,10]和梅（P. mume）[11]等的报
道。基于上述，本文用桃的一对 S S R 引物，试
图建立中国李 SSR 反应体系，以促进中国李 SSR
信息资源开发和应用研究。
材料与方法
1 试材
试材为中国李品种美丽李（Prunus salicina
‘B e a u t y’）。取春季刚萌发的幼芽，用清水冲
洗凉干后置于 -70℃冰柜中贮藏。PCR 扩增和电
泳所用的主要试剂 dNTPs、琼脂糖（Spanish 分
装）、GeneRulerTM 50 bp DNA Ladder Marker 由
南京生兴生物技术有限公司生产或提供；Promega
Taq DNA 酶、10 ×反应缓冲液和 MgCl2 由南京冷
泉港生物技术有限公司提供。引物参照桃基因组
DNA 微卫星位点 UDP98~407 设计[10]，由上海生
物工程公司合成，序列为：P1：5′AGCGGCAGG-
C T A A A T A T C A A 3 ′和 P 2：5 ′A A T C G -
CCGATCA AAGCAAC3′。
2 方法
基因组 DNA 提取同文献 12。在进行单、双
引物实验中，25 μ L 反应体系的组成是：单引
物实验引物浓度为1.6 μmol.L-1，双引物实验每
个引物浓度均为0.8 μmol.L-1，其他成分为：1×
反应缓冲液、Taq DNA酶 1.5 U、Mg2+ 2.0 mmol.
L-1、模板 DNA 40 ng、dNTPs 0.2 mmol.L-1。选
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SSR 反应体系中 4 种主要成分——Taq DNA 酶和
M g 2+、模板 D N A 和引物，分别进行两因素 4 ~ 5
个浓度或用量水平完全组合实验，即25 μL反应
体系中，Taq DNA 酶设置 0.5、1.0、1.5、2.0、
2.5 U 5 个梯度，Mg2+ 设置 2.0、2.5、3.0、3.5
mmol.L-1 4个梯度，共计20个处理（其他成分为：
1 ×反应缓冲液、模板 DNA 40 ng、双引物各为
0.8 μ mol.L-1、dNTPs 0.2 mmol.L-1）；双引物
均设置为0.4、0.8、1.0、1.2、1.6 μmol.L-1 等
5 个浓度梯度，模板 DNA 设置 20、30、40、50
ng 4个含量梯度，共计20个处理（其他成分为：
1 ×反应缓冲液、Taq DNA 酶 1.5 U、Mg2+ 2.0
mmol.L-1、dNTPs 0.2 mmol.L-1）。在上述实验
的基础上对 dNTPs 用量进行单因素实验，设置
0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、
0.36、0.40 mmol.L-1 等 9个处理（其他成分为：
1 ×反应缓冲液、Taq DNA 酶 1.5 U、Mg2+ 2.0
mmol.L-1、模板DNA 40 ng、每个引物0.8 μmol.
L-1）。用 MJ Research Inc. 生产的 PTC-100TM 型
PC R 仪进行 DNA 扩增。反应程序为：94℃预变
性5 min；94℃ 50 s、58℃ 1 min、72℃ 1 min，
40个循环；最后72 ℃再延伸6 min。1× TAE电
极缓冲液、5 V.cm-1、1.8%琼脂糖凝胶电泳60~90
min，0.5 μg.mL-1溴化乙锭染色，用上海复日FR-
200 型紫外与可见光分析系统进行图象扫描。
实验结果
1 单双引物扩增产物的差异
采用近缘物种 SSR 引物扩增另一物种的微卫
星 DNA 前提是扩增片段是否为简单重复序列，这
正是不同物种之间能否共享 S S R 引物关键之所
在。为确定扩增片段是否为简单重复序列，需对
扩增片段进行Southern杂交或克隆测序，这样又
会延长实验周期和增加实验费用。因此我们通过
单双引物实验，试图判断该引物在中国李上的通
用性。从图 1 可以看出，单个引物间以及单引物
与双引物间扩增的结果差异明显，其中一个引物
无任何扩增产物，另一个引物扩增出的片段大小
约为700和400 bp。这与Cipriani等[10]报道的桃该
微卫星位点扩增片段大小相差甚远（该引物在桃
上的扩增片段在 188~212 bp），而用双引物可扩
增出两个150~250 bp之间的片段，与桃的该位点
极为相近，可能也是中国李的微卫星位点。据此,
初步判断该 SSR 引物可在中国李上通用。这一实
验也提示可通过单、双引物 PCR 技术，并参考原
始物种简单重复序列的长短，初步判断共享近缘
物种的 S S R 引物时，扩增片段是否为微卫星位
点 。
2 Taq DNA 酶与 Mg2+ 对 SSR 反应的影响
从图2中 Taq DNA 酶与 Mg2+ 浓度之间完全组
合实验的结果可以看出，S S R 反应体系对 T a q
D N A 酶用量和 Mg 2+ 浓度对扩增反应的影响均较
图2 Taq DNA酶与Mg2+ 浓度对SSR反应的影响
泳道 1~4、5~8、9~12、13~16、17~20: 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 U Taq DNA 酶; 泳道 1、5、9、13、17: 2.0 mmol.L-1MgCl2;
泳道 2、6、10、14、18: 2.5 mmol.L-1 MgCl2; 泳道 3、7、11、5、19：3.0 mmol.L-1MgCl2; 泳道 4、8、12、16、20: 3.5 mmol.
L-1MgCl2；M:分子量标记(从上到下分别为 1 031、900、800、700、600、500、400、300、200、150 bp)。
图1 单、双引物扩增片段的差异显示
P1、P2:单引物, P1/P2:双引物, M:分子量标记(从上到下分别
为 1 031、900、800、700、600、500、400、300、200、
150 bp)。
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大。Taq DNA 酶用量在 0.5 U 时扩增产物较弱，
随着用量的增加，扩增产物渐强且非特异性扩增
增多。不论 Taq DNA 酶的用量如何，实验设置
的4 个 Mg2+ 浓度的微卫星位点扩增结果一致，即
Mg2+浓度在2.0和2.5 mmol.L-1时，150~250 bp大
小的扩增片段均为2条，Mg2+ 在 3.0和 3.5 mmol.
L-1 时，150~250 bp 大小的片段仅有 1 条。因此
可以说浓度为2.0和2.5 mmol.L-1的Mg2+对微卫星
位点的扩增更为全面，其中又以2.0 mmol.L-1 的
Mg2+ 扩增的产物更为清晰。因此可以认为适宜的
Mg2+ 浓度为 2.0 mmol.L-1。
3 引物和模板DNA浓度对SSR反应的影响
从图3可以看出，在25 μL反应体系中，引
物在实验的浓度范围内对 SSR 反应的影响较大。
双引物各为0.4 μmol.L-1时扩增产物较弱，0.8~1.2
μmol.L-1时微卫星位点的扩增产物较好，但随着
引物浓度的增加非微卫星位点的扩增产物渐强，
从而干扰实验结果。故进行微卫星位点分析时，
图3 引物浓度与模板DNA对SSR反应的影响
泳道 1~4、5~8、9~12、13~16、17~20: 0.4、0.8、1.0、1.2、1.6 μ mol.L-1 引物; 泳道 1、5、9、13、17: 20 ng 模板 DNA;
泳道 2、6、10、14、18: 30 ng 模板 DNA; 泳道 3、7、11、15、19: 40 ng 模板 DNA; 泳道 4、8、12、16、20：50 ng 模板
DNA；M:分子量标记(从上到下分别为 1 031、900、800、700、600、500、400、300、200、150 bp)。
每个引物的浓度均以0.8 μmol.L-1为宜。在同一
引物浓度下，模板 DNA 用量为 20 ng 时，微卫
星等位位点中有1个扩增产物极弱；30~50 ng 之
间时，2 个微卫星位点均有较强的扩增产物，且
模板量的增加对反应影响不大。
4 dNTPs对SSR反应的影响
从图4可以看出，dNTPs浓度在0.08和 0.12
mmol.L-1 时扩增量不足，0.08 mmol.L-1 水平时仅
扩增出1个微卫星位点；dNTPs浓度为0.16~0.40
mmol.L-1时扩增产物均较清晰，且2个微卫星位点
均表现出来。因此从经济角度来说，dNTPs 浓度
以0.16~0.24 mmol.L-1为宜。
讨 论
本文根据桃基因组 D N A 微卫星位点
UDP98~407 设计引物扩增中国李基因组 DNA，初
步证实该引物对中国李通用，而该引物在同为李
属植物杏上却无扩增产物[6]。说明即使是近缘物
种间，引物也存在不能共享的情况，应通过实验
筛选可利用的引物。近缘物种共享微卫星引物已
有很多成功报道[4~11]，其中大多是依据片段大小
判断是否为微卫星位点扩增[5~10]。目前李属植物
上已报道的微卫星位点扩增片段大小为 80~300
bp，且等位位点多态性片段之间差异很小[5~10]，
有的仅有2个碱基的差异[10]。本文也是据此来判
断微卫星位点扩增的，即超出这个大小范围时即
视为非特异性扩增。图 1~4 中都有不同程度地出
现片段大于400 bp的非特异性扩增。这些产物很
可能是由于单个引物 DNA 上有 2 个结合位点，即
在 DNA 相距不远处存在与引物互补的反向重复序
列而导致扩增的结果，这从单引物实验结果中可
得到验证（图 1）。但也不能排除双引物分别结
图4 dNTPs浓度对SSR反应的影响
泳道 1~9: 0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、
0.36、0.40 mmol.L-1dNTPs；M:分子量标记(从上到下分别为
1 031、900、800、700、600、500、400、300、200、150
bp)。
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合在 2个等位位点的上游和下游，导致相距不远
的 2 个等位位点之间的序列与位点同时获得扩
增。解决这一问题的策略是优化 PCR 反应参数，
特别是适当缩短延伸时间，尽量使扩增产物控制
在目的片段大小范围内，这是今后需探讨的问
题。
S S R 多态性标记因同时具多态性百分率
高、重复性好且呈共显性等特点，是一种较为
理想的分子标记技术，在果树种质资源遗传多
样性和基因分子标记等遗传育种领域中已较广泛
应用[4~11，13~16]。筛选 SSR 引物及建立稳定的反
应体系是 SSR 多态性标记应用的基础。本文建立
的中国李SSR 反应体系，即25 μ L反应体系中，
1 ×反应缓冲液、Taq DNA 酶 1.5 U、Mg2+ 浓度
2.0 mmol.L-1、模板 DNA 用量 30~40 ng、每个引
物浓度 0.8 μ mol.L-1、dNTPs 浓度 0.16~0.24
mmol.L-1，可供研究中国李种质资源和遗传育种
时参考。实验过程中还观察到不同引物所需的优
化反应体系略有差异，因此欲获得更全面的微卫
星位点信息，在上述优化体系下，微调某些反应
物的用量，是非常必要的。
SSR 标记虽然多态性百分率高，但每对引物
只扩增几个等位基因[2]。Hormaza[6]用桃的 SSR引
物扩增杏时，每对引物产生的等位基因数平均为
4.1也说明这一点。因此，要想获得尽量多的SSR
多态信息，开发大量的 SSR 引物是基础。很多实
验已证明，近缘物种间甚至同科不同属间的 SSR
引物可部分共享，这为 SSR 的广泛应用提供了强
有力的支撑。本文结果提示我们，通过单、双
引物的 PCR 技术并结合已知信息，可能是不同物
种间SSR 引物互用时分辨扩增产物是否为 SSR 位
点的一个较简便途径，但这还需要通过克隆测序
来进一步验证。需要指出的是，虽然不同物种之
间可共享部分 S S R 引物，但从长远来看，发展
SSR 分子标记，基础还是构建本物种基因组 DNA
文库，这样才可从中筛选出足量的微卫星位点，
以设计出更多的 SSR 引物用于植物种质资源多样
性和基因分子标记的研究。
参考文献
1 陈佩度. 作物育种生物技术. 北京：中国农业出版社，2001.
134~138
2 邹喻苹，葛 颂，王晓东. 系统与进化植物学中的分子标
记. 北京：科学出版社，2001.68~107
3 高志红，章 镇，韩振海. SSR技术及其在果树上的应用.
果树学报，20 0 2，1 9（5）：28 1 ~ 2 8 5
4 Yamamoto T, Kimura T, Sawamura Y et al. SSRs isolated from
apple can identify polymorphism and genetic diversity in pear.
Theor Appl Genet, 2001, 102: 865~870
5 Zhebentyayeva TN, Reighard GL, Gorina VM et al. Simple se-
quence repeat (SSR) analysis for assessment of genetic variabil-
ity in apricot germplasm. Theor Appl Genet, 2003, 106:435~444
6 Hormaza JI. Molecular characterization and similarity relation-
ships among apricot ( Prunus armeniaca L.) genotypes using
simple sequence repeats. Theor Appl Genet, 2002, 104:321~328
7 Dirlewanger E, Cosson P, Tavaud M et al. Development of
microsatellite markers in peach [Prunus persica (L.) Batsch]
and their use in genetic diversity analysis in peach and sweet
cherry (Prunus avium L.). Theor Appl Genet, 2002, 105:127~138
8 Sosinski B, Gannavarapu M, Hager LD et al. Characterization
of microsatellite markers in peach [Prunus persica (L.) Batsch].
Theor Appl Genet, 2000, 101:421~428
9 Downey SL, Iezzoni AF. Polymorphic DNA markers in black
cherry (Prunus serotina) are identified using sequences from
sweet cherry, peach, and sour cherry. J Am Soc Hortic Sci, 2000,
125:76~80
10 Cipriani G, Lot G, Huang W-G et al. AC/GT and AG/CT
microsatellite repeats in peach [Prunus persica (L.) Batsch]:
isolation, characterization and cross-species amplification in
Prunus. Theor Appl Genet, 1999,99:65~72
11 高志红，章 镇，韩振海等. 果梅SSR反应体系的优化. 南
京农业大学学报，20 0 2，2 5（4）：1 9 ~ 2 2
12 乔玉山，章 镇，房经贵等. 李种质资源ISSR反应体系的
建立. 果树学报，2003，20（4）：270~274
13 Lopes MS, Sefc KM, Eiras Dias E et al. The use of microsatellites
for germplasm management in a Portuguese grapevine collection.
Theor Appl Genet, 1999, 99:733~739
14 Lamboy WF, Alpha CG. Using simple sequence repeats (SSRs)
for DNA fingerprinting germplasm accessions of grape (Vitis
L.) species. J Am Soc Hortic Sci, 1998,123:182~188
15 Aranzana MJ, Carbó J, Arús P. Microsatellite variability in
peach [Prunus persica (L.) Batsch]: cultivar identification, marker
mutation, pedigree inferences and population structure. Theor
Appl Genet, 2003, 106:1341~1352
16 Aranzana MJ, Pineda A, Cosson P et al. A set of simple-sequence
repeat (SSR) markers covering the Prunus genome. Theor Appl
Genet, 2003, 106:819~825