全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月 329
NtDREB2-PDI融合蛋白的纯化及与DRE 元件结合能力的检测
冯锋，刘卫群 *
河南农业大学生命科学学院，郑州 450002
提要：将从普通烟草(Nicotiana tobaccum)‘K326’中克隆得到的转录因子基因NtDREB2，采用PCR去除NtDREB2基因的
终止密码子，酶切后构建入PDI/pET28a融合表达载体。取测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)，经 IPTG诱导，
SDS-PAGE检测表达后，用Ni-NTA纯化融合蛋白，获得了高效表达的可溶性目的蛋白。凝胶滞留(EMSA，electrophoresis
mobility shift assay)实验表明融合蛋白具有结合 DRE (dehydration-responsive element)元件的能力。
关键词：NtDREB2；蛋白质二硫键异构酶；融合蛋白；诱导表达；纯化；凝胶滞留
Purification of NtDREB2-PDI Fusion Protein and Function Analysis of Bind-
ing to DRE Element
FENG Feng, LIU Wei-Qun*
College of Life Sciences, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China
Abstract: The transcription factor gene NtDREB2 is cloned from tobacco (Nicotiana tobaccum) ‘K326’. The
stop codon of the NtDREB2 gene is deleted with PCR, and we construct the gene into the PDI/pET28a fusion
expression vector after enzyme digestion. The E. coli BL21 (DE3) is transformed with the recombinant plasmid
whose sequence is verified, then induced with IPTG. After SDS-PAGE detection of the expression we acquire
the high-expressing soluble protein with the Ni-NTA purification method. EMSA experiment suggests that the
fusion protein is capable of binding to the DRE element.
Key words: NtDREB2; protein disulfide isomerase; fusion protein; induce expression; purification; EMSA
收稿 2007-11-05 修定 2008-02-21
资助 河南省科技攻关项目(0 62 405 00 12 )。
* 通讯作者(E-mai l：l iuweiqu n20 04@126 .com；Tel：
0 37 1-63 5 58 72 2)。
脱水应答元件结合蛋白(dehydration-responsive
element binding protein, DREB)转录因子对提高植物
抗干旱、高盐和低温等非生物胁迫的耐受性起着
关键的作用(Liu等 1998)。有关这方面的研究主要
集中于 DREB 信号通路所介导的转录调控机制
(Thomashow 等 2001；Zhao 等 2006)，而对于
DREB蛋白性质及其与其他蛋白质相互作用的报道
较少。在此项研究中，如何纯化并获取大量可溶
性DREB蛋白至关重要。
然而，在用大肠杆菌重组表达外源蛋白时，
往往会由于一些蛋白质的不正确折叠而形成包涵
体。目前已有很多方法用于避免或减少包涵体的
形成，如低温诱导，降低 IPTG 浓度，与 G S T
融合表达或是选择合适的真核表达系统，但这些
方法往往导致蛋白表达量下降或提取成本增大，
即使如此，仍不能彻底消除包涵体的存在(Liu 等
2005；Georgiou和Valax 1996；Chalmers等1990)。
Liu 等(2005)和Kajino等(2000)发现，采用人蛋白
二硫键异构酶(protein disulfide isomerase，PDI)与
目的蛋白融合，在短芽孢杆菌和大肠杆菌中表
达，可以有效避免包涵体，提高目的蛋白的可溶
性和产量。PDI是一个多功能蛋白，它能够催化
二硫键的形成、还原和异构化的限速反应；还可
以分子伴侣的形式帮助多肽链的折叠，减少包涵
体的形成(Freedman等 2002)。
本文将从普通烟草‘K326’中克隆的转录
因子基因 NtDREB2构建到 PDI融合表达系统中，
得到高表达量的融合蛋白，并用Ni-NTA分离纯化
了此融合蛋白，再通过凝胶滞留实验进一步证明
此融合蛋白中的NtDREB2仍然具有结合WDRE元
件的能力，说明 PDI融合表达系统是有效的。
技术与方法 Techniques and Methods
植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月330
材料与方法
1 材料与试剂
含有从普通烟草(Nicotiana tobaccum)品种
‘K326’中克隆的转录因子基因(NtDREB2)的质
粒 NtDREB2 /pBluescr ipt I I SK+、大肠杆菌
(Escherichia coli)菌株 DH5α和表达菌株 BL21
(DE3)以及融合有人PDI基因的原核表达载体PDI/
pET28a均来自清华大学分子酶学实验室。
Pfu DNA聚合酶、DNA Marker (D2000)和
DNA回收试剂盒购自北京天根公司； BamHI和
HindIII限制性内切酶购自TaKaRa公司；T4-DNA
连接酶购自 Promega公司；卡那霉素、IPTG等
购自北京经科公司；N i - N T A a ga r os e 购自
QIAGEN 公司；Ultr afree-15 浓缩离心管来自
Millipore公司；其他试剂均为国产分析纯。
2 引物设计
根据NtDREB2基因序列设计引物，去除基因
编码区最后一位的终止密码子 TAA，并分别在上
下游引物中加入 BamHI和HindIII位点(下划线表
示)，引物斜体部分为保护碱基。For：5-CCGC-
GGATCCATGGAAATGTGTCGAAGCTATTA-3；
Rev：5-TATCAAGCTTAATAGAATAACTCCA-
CAAAGG-3。
根据报道的野生型脱水应答元件(wide-type
dehydration-responsive element,WDRE)和突变型脱
水应答元件(mutated dehydration-responsive element,
MDRE)序列，合成双链元件WDRE：5-AGC-
TACCGACATAAGGC-3 和MDRE：5-AGC-
TATTTTCATAAGGC-3，以上所有引物均由上海
生工生物技术有限公司合成。
3 NtDREB2融合表达载体的构建
由于要将 NtDREB2基因与 PDI基因融合表
达，因此必须去除 NtDREB2的终止密码子 TAA。
以构建好的 NtDREB2/SK+质粒为模板，用引物
NtDREB2-For和 NtDREB2-Rev进行 PCR扩增，产
物经1.2%琼脂糖凝胶电泳回收后用BamHI/HindIII
酶切。同时，将融合有人 PDI基因的原核表达载
体 PDI/pET28a也用 BamHI/HindIII进行酶切，电
泳回收大片断。将酶切处理的载体和 PCR产物用
T4-DNA 连接酶连接，这样目的基因就处于 PDI
的 5端，得到重组质粒 NtDREB2-PDI/pET28a。
融合基因的构建见图 1。
连接产物分别转化新鲜制备的DH5α感受态
细胞，随机挑取单克隆培养后提取质粒，用
BamHI和HindIII酶切鉴定筛选阳性克隆，送上海
英骏生物技术有限公司测序。
4 NtDREB2融合蛋白的诱导表达
将测序正确的重组质粒转化大肠杆菌表达菌
株 BL21 (DE3)，挑取阳性单菌落于 3 mL含卡那
霉素(50 µg·mL-1)的 LB液体培养基中， 37 ℃下培
养过夜至稳定期，按1:100转移至上述相同培养基
中，相同条件培养至OD600值为 0.6~0.8，取出100
µL培养物于 4 ℃中保存，作为诱导前样品；剩
余培养物加入 IPTG (终浓度为 1 mmol·L-1)继续培养
3~4 h，再取出 100 µL培养物作为诱导后样品。
分别取诱导前与诱导后样品 20 µL，各加入 5 µL
5×蛋白样品处理液(0.5 mol·L-1 Tris-HCl pH 6.8，
4% SDS，0.5 mol·L-1巯基乙醇，40%蔗糖， 0.1%
溴酚蓝)，置于沸水浴中 10 min，后取 15 µL上
样，用 SDS-PAGE检测表达产物(180 V稳压，电
泳 1 h)。
5 NtDREB2融合蛋白的提取纯化
根据 SDS-PAGE的结果，将 IPTG诱导的菌
液于 4 ℃下，以 8 500×g 离心 5 min后，收集菌
体。按照QIAGEN公司的“QIAexpressionist-A
handbook for high-level expression and purification
of 6×His-tagged proteins”手册提取NtDREB2-PDI
融合蛋白。收集的菌体按照培养菌液量的 1/10体
积加入裂解缓冲液(50 mmol·L-1 NaH2PO4，300
mmol·L-1 NaCl，10 mmol·L-1 咪唑，pH 8.0)，将
菌体沉淀充分悬浮并混匀后加入溶菌酶至终浓度为
1 mg·mL-1，置于冰上搅拌 30 min后，超声(60
W，5 s间歇，5 s超声，共超 10 min)以破碎细
胞，于 4 ℃ 下，以 12 000×g离心 20 min，上清
液转移至新的离心管中，加入 1 mL镍离子 -氨三
乙酸(Ni-NTA)琼脂糖树脂，放于 4 ℃中振荡过夜
后取离心管中的混合物转入 20 mL空玻璃管中，
图 1 NtDREB2-PDI/pET28a融合表达载体的构建
Fig.1 The construction of NtDREB2-PDI/pET28a fusion
expression vector
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用裂解缓冲液(50 mmol·L-1 NaH2PO4，300 mmol·L-1
NaCl，10 mmol·L-1 咪唑，pH 8.0)洗脱去除未结
合的蛋白，用GE公司 Pharmacia UV-1紫外检测
仪检测，直至基线走平。使用冲洗缓冲液( 5 0
mmol·L-1 NaH2PO4，300 mmol·L-1 NaCl，20
mmol·L-1咪唑，pH 8.0)冲洗除去杂蛋白，最后用
洗脱缓冲液(50 mmol·L-1 NaH2PO4，300 mmol·L-1
NaCl，250 mmol·L-1 咪唑，pH 8.0)进行洗脱，
收集流出液。对上述提取纯化每一步骤所得到的
溶液进行 SDS-PAGE检测。同时将最终收集的洗
脱液置于30 mmol·L-1的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)透
析后，采用Millipore的 50 mL浓缩离心管浓缩蛋
白，浓缩的蛋白吹打均匀后转移至新的 1.5 mL的
离心管中，置于-80 ℃中保存。蛋白浓度用考马
斯亮蓝法测定(Bradford 1976)。
6 凝胶滞留检测融合蛋白的活性
在原来的实验中(未发表资料)，我们采用酵
母单杂交已经证明NtDREB2能够与WDRE元件结
合，为了鉴定体外融合表达的蛋白NtDREB2-PDI
是否还具有与WDRE元件结合的能力，我们又做
了凝胶滞留实验。即取 0.5 µg的WDRE和MDRE
元件分别与 15 µg的NtDREB2-PDI融合蛋白混匀
后，于室温下放置 20 min，反应达到平衡后，加
入 4 µL 6×上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，40%蔗
糖)，取 15µL点样，用 0.5×Tris-硼酸 -EDTA、
8%的非变性 PAGE电泳。稳压 40 V，待指示剂
跑至距点样孔 3/4处，停止电泳，用溴化乙啶(EB)
染色，并照相记录。
实验结果
1 NtDREB2融合表达载体的鉴定
对阳性克隆NtDREB2-PDI/ pET28a测序结果
表明，NtDREB2基因终止密码子已被去除，目
的基因处于 PDI的 5端并与 PDI基因处于同一读
码框。将得到的重组质粒 N t D R E B 2 - P D I /
pET28a，采用 BamHI/HindIII酶切后进行琼脂糖
凝胶电泳检测，在电泳图谱上也显示有一 650 bp
左右的片段(图 2)，与 NtDREB2基因大小一致，
表明NtDREB2已正确连接在PDI/pET28a原核表达
载体上，融合表达载体构建成功。
2 NtDREB2融合蛋白的原核表达
经SDS-PAGE检测诱导前后NtDREB2-PDI融
图 2 重组质粒的酶切鉴定图谱
Fig.2 The restriction endonuclease analysis of
the recombinant plasmid
1：BamHI和HindIII双酶切重组质粒；M：D2000 DNA标准。
合蛋白表达图谱显示：诱导后有一相对分子量约
为 80 kDa的特异性蛋白质表达带(图 3)，与 Nt-
DREB2-PDI融合蛋白的理论值相符(PDI大小为57
kDa，NtDREB2大小 23 kDa)，表明融合蛋白可
以在大肠杆菌中完整表达。
图 3 NtDRB2-PDI融合蛋白的 IPTG诱导表达
Fig.3 The fusion protein NtDREB2-PDI was induced
expression by IPTG
M ：低分子量蛋白标准；1 ：诱导前；2 ：诱导后。
3 NtDREB2融合蛋白的亲合纯化
对上述提取纯化每一步骤所得溶液经 8%的
S DS - P AG E 分析，电泳图谱结果(图 4 )显示：
NtDREB2-PDI主要以可溶性表达存在于超声破细
胞后离心的上清中，沉淀中没有明显的包涵体存
在，经过 3个分离纯化步骤后，杂蛋白已被大量
去除，因而得到的是纯化的NtDREB2-PDI融合蛋
白。表明NtDREB2-PDI/pET28a原核表达系统基
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本上可避免包涵体的形成，并且也说明预设优化
的纯化方案是正确的。
4 NtDREB2融合蛋白的活性检测
为了验证所获得的融合蛋白是否能与WDRE
顺式作用元件结合，我们采用体外凝胶滞留实验
检测了融合蛋白与WDRE顺式作用元件结合的能
力。结果(图 5)显示，NtDREB2-PDI融合蛋白能
够与WDRE元件特异性结合(泳道 2)，但 PDI既
不能结合WDRE元件(泳道 4)，也不与MDRE元
件结合(泳道 3)，表明融合蛋白中的NtDREB2转
录因子的 DNA结合域不受 PDI的影响，可以正
常地与 DRE顺式作用元件结合。
讨　　论
在融合蛋白的纯化方法中，一般常用His-tag
和GST融合蛋白，这是因为它们具有成熟的表达
与纯化系统，但His-tag仅仅作为纯化时的标记使
用而不能改善目的蛋白的溶解性质，致使此系统
表达的重组蛋白在大肠杆菌体内往往形成不可溶的
包涵体。而 GST虽然有高度可溶性，有助于目
的蛋白的溶解，但当目的蛋白具有大量二级结构
或存在二硫键重排时，此系统也不能帮助目的蛋
白正确折叠(Fernando等 1999)。
PDI融合表达系统是通过 PDI的分子伴侣性
质来辅助目的蛋白折叠的，具有广泛的适用性与
稳定性，可以减少或避免包涵体形成，是一种改
进的在大肠杆菌中表达外源蛋白方法( L i u 等
2005；Freedman等 2002)。此外，不同融合模
式产生的 PDI融合蛋白有不同的稳定性。如果目
的蛋白被连接在 PDI肽链的 C末端，产生的融合
蛋白同样是不稳定的(Liu等 2005)。这可能是由于
置于 PDI 的 C端目的蛋白影响了 PDI折叠，改变
了 PDI分子的构象。而使其失去分子伴侣的功能
所致(Kajino等 2000)。
本文将NtDREB2转录因子基因连接在PDI基
因的 5端，可形成融合表达系统。结果显示表达
出的蛋白质可避免包涵体的形成，采用Ni-NTA亲
和纯化系统可以获得高纯度的NtDREB-PDI融合蛋
白，EMSA分析表明，所提纯的 PDI融合蛋白能
够与WDRE元件结合。酵母单杂交实验也显示其
具有转录激活调控功能(未发表资料)。表明PDI融
合表达系统产生的融合蛋白具有与目的蛋白相似的
活性和生物学特性。
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图 4 NtDREB2-PDI的提取纯化
Fig.4 Identification and purification of the fusion protein
NtDREB2-PDI
1：I P T G 诱导后细胞进行超声离心后的上清；2：超声
离心后的沉淀；3：裂解缓冲液洗脱液；4；冲洗缓冲液洗
脱液；5 ：洗脱缓冲液洗脱液；M：低分子量蛋白标准。
图 5 EMSA 分析NtDREB2-PDI的转录因子活性
Fig.5 EMSA analysis of the transcription factor activity of
fusion protein NtDREB2-PDI
1：N t D R E B 2 - P D I 融合蛋白和 M D R E 元件混合；2：
NtDREB2-PD I 融合蛋白和WDRE元件混合；3：PD I 蛋白和
M D R E 元件混合；4：P D I 蛋白和W D R E 元件混合。
植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月 333
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