全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月888
转入HPT1 基因的油菜种子中维生素E 含量的提高
黄智明1,2 翁海波2,* 席宇2 韩绍印2 王时征2
1 南京大学生命科学学院，南京 210093；2 郑州大学生物工程系，郑州 450001
提要 尿黑酸植基转移酶(HPT)是天然维生素 E 合成途径中的关键酶，拟南芥中编码 HPT 的基因 HPT1 转入油菜种子特
异表达后得到转基因油菜。初步的检测发现，其种子中的维生素 E 含量有所提高。
关键词 油菜；维生素 E；HPT1 基因
Increase of Vitamin E Content in the Seeds of Brassica napus L. with Expres-
sion of HPT1
HUANG Zhi-Ming1,2, WENG Hai-Bo2,*, XI Yu2, HAN Shao-Yin2, WANG Shi-Zheng2
1School of Life Sciences, Nanjing University, Nanjing 210093, China; 2Department of Bioengineering, Zhengzhou University,
Zhengzhou 450001, China
Abstract The committed step in vitamin E biosynthesis was catalyzed by the homogentisate phytyltransferase
(HPT). HPT1 which encoded HPT in Arabidopsis thaliana was specifically expressing in the seeds of Brassica
napus L.. Primary results showed that vitamine E content was higher in transgenic B. napus than that in the
control.
Key words Brassica napus L.; vitamin E; HPT1
收稿 2006-04-21 修定 　2006-08-24
*通讯作者(E-mail: hbweng@163.com, Tel: 0371-
65038081)。
尿黑酸植基转移酶(homogentisate phytyltrans-
ferase，HPT)是叶绿体中的一种膜结合蛋白酶，
催化维生素E (vitamin E，VE)合成途径中的尿黑
酸盐(homogentisate, HGA)和植酸盐(phytyl-
diphosphate, PDP)的缩合反应。编码 HPT 的
slr1736 和 HPT1 的基因已分别从蓝细菌集胞藻
(Synechocystis sp. PCC 6803)和拟南芥中得到克隆
(Savidge等 2002; Collakova和DellaPenna 2001，
2003)。业已证实，拟南芥叶中的 HPT 活性制约
VE 的合成，是 VE 合成中的关键酶。拟南芥植物
组织中的 HPT 酶活性对生育酚合成有限制性作用
也已得到证实，拟南芥中HPT 过量表达的叶中VE
含量增加4.4倍，种子中增加1.4倍(Collakova和
DellaPenna 2003)。油菜(Brassica napus L.)是仅次
于大豆的第二大植物油脂来源，油脂中VE含量与
食用油的抗氧化活性有关，它可增加油的储藏时
间和稳定性。油菜与拟南芥同属于十字花科植
物，有很高的同源性。如果能将拟南芥中与 V E
合成有关的 HPT1 基因转入油菜，以提高油菜种
子中 V E 的含量，其意义是不言而喻的。为此，
本文对此问题初步作了探讨，现报道如下。
材料与方法
双低油菜优良品种‘沪油-15’ (Brassica napus
L. cv. Huyou-15)由上海农业科学院提供；哥伦比
亚型拟南芥(Arabidopsis thaliana)为郑州大学生物
工程系保存植株。大肠杆菌菌株 J M 1 0 9 和
HB101、根癌农杆菌菌株 LBA4404、植物表达载
体pCAMBIA3301 由郑州大学生物工程系保存。限
制性内切酶、高保真DNA聚合酶Primerstar、Taq
DNA 酶、逆转录酶以及载体 pMD18-T 购自大连
Takara 生物工程有限公司。DL-a- 生育酚(VE)购
自 Sigma公司；FeCl3 和 1,10-邻菲啰啉购自上海
生工生物技术服务有限公司。
构建植物双元转化载体 p3301-HPT1 时，以
油菜 DNA 为模版，PCR 扩增 Napin 启动子。扩
增引物为Napin-F：5 GGGTCTAGATCTTCATCGG-
GATTGATTCC 3；Napin-R：5 GGCCATGGAT-
C CT GT AT G TT TT TA A TC TT GT T TG T 3。装入
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pMD18-T 载体，测序鉴定。提取拟南芥总 RNA，
RT-PCR 扩增 HPT1 基因。扩增引物 HPT1-F：5
A A A G G A T C C A T G G A G T C T C T G C T C T C T A G T T C -
TTCTC 3；HPT1-R：5 AAAGAGCTCTCACTT-
C A A A A A A G G T A A C A G C A A G T A C 3 。装入
pM D 1 8 - T 载体，测序鉴定。
以 pCAMBIA3301 为骨架，构建植物双元转
化载体。 XbaI 和 BamHI 双酶切装入 pMD18-T 的
Napin 启动子，与同酶切的 pCAMBIA3301 载体连
接。以BamHI和 SacI酶切pMD18-T载体上的HPT1
基因，装入同酶切的主载体上。以SacI 和 EcoRI
酶切pBI121上的Nos终止子(nopaline synthase
terminator)，装入主载体HPT1 基因后面，构建
成载体 p3301-HPT1，质粒图谱见图 1。
转化油菜用三亲杂交法(Draper等1988)，质
粒转化农杆菌 LBA4404。叶柄转化法转化油菜，
农杆菌侵染后，转入含有3 mg·L-1 草胺膦(PPT)、
250 mg·L-1羧苄青霉素(Cb)的MS分化培养基(MS+2
mg·L-1 6-BA+0.15 mg·L-1 IBA+3.5 mg·L-1 AgNO3)
上。出现抗性愈伤组织和长出绿芽后，切下转入
含相同抗生素的 MS 培养基中继代培养。当芽长
成 2~3 cm 高的小苗时，转入含相同抗生素的 1/
2 M S 生根培养基诱导生根。
获得T0 代转基因油菜后，PCR 初步检测转基
因植株，提取转基因植物 D N A ，用限制性内切
酶HindIII 完全酶切，随机引物法探针标记，a-
P32-dCTP 标记 HPT1 基因为探针，Southern 杂交
分析，采用 Sambrook 等(1989)的杂交方法。检
测阳性植株进行 G U S 染色检测，分析标记基因
GUS能否正常表达。采用Jefferson (1987)的染色
方法，将剪成小块的油菜叶片浸泡在100~200 mL
染色液中，于 25~37℃中保温 3~4 h 或过夜。然
后，转入 70% 乙醇中脱色 2~3 次，阳性显蓝色，
阴性样品无色或白色。
VE 含量分析采用分光光度法(刘云等 2005；
邢志等 1999)。取转基因油菜，每株取 5 g，研
磨后溶于 10 mL 无水乙醇，非转基因油菜作为对
照。每份种子的乙醇抽提液，快速风干浓缩后马
上加入 350 mL 乙醇充分溶解，然后加入 50 mL
6.0013 mmol·L-1的1,10-邻菲啰啉和50 mL 1.0011
mmol·L-1 的FeC13 溶液，显色15 s 后立即加入50
mL 4.0125 mmol·L-1的H3PO4溶液终止显色，于510
nm处测定吸光度，与DL-a-生育酚作成的标准曲
线对比，计算含量。
结果与讨论
1 转化油菜p3301-HPT1载体的构建
以 pCAMBIA-3301 为骨架，在多克隆位点先
后加上Napin启动子、HPT1基因和Nos终止子(图
1 )。测序鉴定正确，酶切鉴定如图 1。
2 转基因油菜的获得
获得 T 0 代转基因油菜后，P C R 初步检测，
Southern杂交做进一步分析，HindIII完全酶切，
HPT1 为探针。在 65 株转化植物中，有 16 株杂
交为阳性，部分杂交结果如图2。取 16 株转基因
油菜叶子进行 GUS 染色，12 株染色为阳性，染
图1 p3301-HPT1质粒图谱与酶切鉴定
Fig.1 Digram of p3301-HPT1 vector and its identification of restriction sites
酶切：EcoRI 和 HindIII 双酶切鉴定；Mw：DNA Marker (lDNA/EcoRI+HindIII)。
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图2 部分T0代转基因油菜株系Southern杂交图谱
Fig.2 The graph of southern blot hybridization of
some T0 transgenic strains of B. napus
N ：非转基因油菜；B 2 、B 5 、B 6 、B 7 和 B 1 2 ：T 0 代
转基因油菜。
色结果未显示。
3 转基因油菜中的脂肪酸含量分析
用DL-a-生育酚作成了标准曲线，回归方程
为y=0.0097x-0.0043，一致性系数为0.9972 (资料
未列出)，x为VE的质量浓度(mg·mL-1)，y为吸光
度。取非转基因油菜 5 株，测定新鲜种子中 V E
含量的结果表明，每克种子 V E 含量约为 2 . 4 2
mg；12 株 T0 代转基因油菜，测定种子中 VE 含量
的结果表明，每克种子VE含量约为3.27 mg (图
3)。由此可见，在特异表达 HPT1 基因的转基因
油菜籽中，VE 含量明显提高，约增加 1/ 3。
本文中分析的是T0代转基因的油菜种子，由
于性状分离，有些种子可能没有转基因的性状。
因此，从总体上讲，VE 含量可能低于实际转基
因种子的含量。
参考文献
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图3 非转基因与转基因油菜籽中VE的含量
Fig.3 VE contents in non-transgenic and transgenic seeds of B. napus
ferase activity is limiting for tocopherol biosynthesis in
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