全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月 501
天麻 rDNA ITS区的PCR-RFLP分析
谢渊 1，张小蕾 2,*，李毅 1，张婷 1，单可人 1
贵阳医学院 1分子生物学重点实验室，2医学检验系，贵阳 550004
提要：对来源于贵州大方(DF)、黎平(LP)、台江(TJ)、雷山(LS)、乌当(WD)及云南(YN)的鲜品天麻进行核糖体 DNA内
转录间隔区(ITS)的PCR扩增，并用限制性内切酶BamHI、HincII、HeaIII进行酶切分析的结果显示，天麻 ITS区长度约为
750 bp，PCR产物经HeaIII酶切后YN、DF和WD株的 RFLP图谱基上一致，TJ2、LP和 LS株的RFLP图谱基本上一致，
而TJ1株则显著不同；经BamHI酶切后，LP、TJ和LS株的RFLP图谱相同，除DF3外，YN、DF1、DF2和WD株的RFLP
图谱基本上一致；经HincII酶切后，除DF3和 TJ1 RFLP的图谱显著不同外，其余样本RFLP图谱均表现一致。表明天麻
的遗传变异特征与其地域分布有一定的联系。
关键词：天麻；内转录间隔区；PCR-RELP
PCR-RFLP Analysis of rDNA ITS in Gastrodia elata Bl.
XIE Yuan1, ZHANG Xiao-Lei2,*, LI Yi1, ZHANG Ting1, SHAN Ke-Ren1
1Key Laboratory of Molecular Biology, 2Department of Laboratory Science, Guiyang Medical College, Guiyang 550004, China
Abstract: PCR-RFLP and restriction enzyme digestion were used to analysis the ITS regions of Gastrodia elate
from Guizhou Dafang (DF), Liping (LP), Taijiang (TJ), Leishan (LS), Wudang (WD) and Yunnan (YN). The
ITS length of Gastrodia elata totally was about 750 bp. After digested by HeaIII, the strains of YN, DF and WD
had the identical elecrophoresis maps, TJ2, LP and LS had identical elecrophoresis maps, but TJ1 was different
with other. After digested by BamHI, the strains of LP, TJ and LS had the identical elecrophoresis maps, YN,
DF1, DF2 and WD had the other identical elecrophoresis maps, whereas DF3 was different. After digested by
HincII, except DF3 and TJ1, the other strains had the same elecrophoresis maps. So we considered that the
genetic variations of Gastrodia elata were related with their geographical regions.
Key words: Gastrodia elata; ITS; PCR-RFLP
收稿 2007-12-26 修定 2008-03-21
资助 贵州省中药现代化专项[(2003)22号]和贵州省科学技术
基金[20 05 ]2 06 9号。
* 通讯作者(E-mail：xiaolei0501@sohu.com；Tel：0851-
67 52 81 4-80 00 )。
天麻是在我国已有上千年药用历史的名贵中
药材，其块茎主要含天麻素，有多种疗效(邓士
贤和莫云强1979)。它在形态上虽然呈现出一定的
差异，如块茎抽苔后茎和花的颜色，但就天麻的
药用部位块茎而言，并没有明显的区别。天麻产
区生态环境分析表明，海拔、地势、气温、水
分和土壤均是影响天麻生长及品种质量的因素(李
梁等2004)，其医药品质仅根据产地的不同进行划
分。而作为一段高度重复且有较高进化速率的核
酸序列的内转录间隔区(internal transcribed spacer，
ITS)，有种内多态性，位于核糖体 rDNA的 18S
RNA基因和28S RNA基因之间，其侧翼片段均为
保守序列，近年来已广泛用于植物药材的分子鉴
定研究(杨志业等 2006；张君毅等 2006；刘春生
等 2005；武莹等 2004)。本文利用限制性片段长
度多态性分析( r e s t r i c t i on f r a gment l eng t h
polymorphism，RFLP)方法。对不同产地天麻样
本的 nrDNA ITS扩增产物进行了分析，以期能为
天麻的分类和系统发育关系提供分子生物学证据。
材料与方法
取鲜品天麻(Gastrodia elata Bl.)地下块茎或鹦
哥嘴嫩芽洗净，刮弃表皮，以避免共生蜜环菌污
染，留其核心成分提取天麻基因组 DNA，材料
来源见表 1。
仪器：有 E p p e n d o f f 梯度 P C R 扩增仪、
Beckman台式高速离心机、UVP GDS8000成像仪
等。试剂：引物采用 I T S 通用引物 I T S 5 ( 5
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3)、ITS4 (5
TCCTCCGCTTATTGATATGC 3) (White等 1990)
(上海生工生物工程有限公司合成) ；Taq DNA聚
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合酶(Promega 公司) ；限制性内切酶 Ba mHI、
HincII、HeaIII (Promega公司)。
基因组DNA的提取采用我组改进的 CTAB/
SDS方法(李毅和张小蕾 2005)。
rDNA ITS的 PCR扩增体系为 25 µL，含 2.5
µL 10×PCR 缓冲液(50 mmol·L-1 KCl；10 mmol·L-1
Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol·L-1 MgCl2；0.1%
明胶)、1 µL DNA样品、ITS4和 ITS5 (10 µmol·L-1)
各 0.5 µL、1.5 µL MgCl2 (25 mmol·L-1)、2 µL
dNTP (2.5 mmol·L-1)、0.1 µL Taq DNA酶(5 U·µL-1)，
加双蒸水至 25 µL。反应条件为 95 ℃ 5 min；94
℃ 30 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 60 s，共 30个循
环，最后于 72 ℃下延伸 7 min。
rDNA ITS的 PCR扩增产物电泳时，取 6 µL
PCR产物在 1.5%琼脂糖凝胶电泳，DL2000为标
准分子量参照，200 V 30 min。溴化乙锭染色后
用凝胶成像处理系统观察拍照，记录电泳结果。
rDNA ITS区的RFLP份析反应体系共 20 µL，
其中含 8 µL rDNA ITS区 PCR产物、0.5 µL限制
性内切酶(10 U·µL-1)、2 µL酶切缓冲液、加双蒸
水至 20 µL。置于 37 ℃水浴中酶切反应 12 h。
RFLP的电泳时取8 µL酶切反应产物以1.5%
琼脂糖凝胶进行电泳，以DL2000为标准分子量参
照，200 V 30 min。溴化乙锭染色后用凝胶成像
处理系统观察拍照，记录电泳结果。
实验结果
天麻标本 ITS序列 PCR扩增产物长度在 750
bp左右，但不同来源样本之间有一定差异(图 1-
a)。PCR产物经HeaIII酶切(图 1-b)，YN、DF1、
表 1 天麻材料的产地
Table 1 Origin of G. eleta used in the study
样品编号 品种 产地
YN 未知 云南
L P ‘ 红 杆 ’ 贵州东南部黎平县野生
DF1 ‘ 乌 杆 ’ 贵州西部大方县野生
DF2 ‘ 乌 杆 ’ 贵州西部大方县野生
DF3 ‘ 红 杆 ’ 贵州西部大方县人工栽培
WD ‘ 红 杆 ’ 贵州中部贵阳乌当区人工栽培
TJ1 ‘ 红 杆 ’ 贵州东南部台江县野生
TJ2 ‘ 乌 杆 ’ 贵州东南部台江县野生
LS ‘ 乌 杆 ’ 贵州东南部雷山县野生
图 1 天麻 rDNA ITS区 PCR扩增和RFLP图谱
Fig.1 PCR amplification results and RFLP analysis of ITS sequence in G. elata
a、b、c、d 分别为 P C R 扩增、B a m H I、H i n c I I、H e a I I I 内切酶的酶切图谱；M 为标准分子量参照( D L 2 0 0 0 )。
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DF2、DF3和WD的RFLP图谱基本上一致，TJ2、
LP和 LS的 RFLP图谱基本上一致，而 TJ1则显
著不同；经 BamHI酶切(图 1-c)，LP、TJ1、TJ2、
LS的 RFLP图谱相同，除 DF3外，YN、DF1、
DF2和WD的 RFLP图谱基本上一致；经HincII
酶切(图 1-d)，除DF3和 TJ1 RFLP图谱有显著不
同之外，其余的 RFLP图谱均表现一致。
讨　　论
贵州有着得天独厚的气候和丰润的降雨优
势，森林资源丰富，为天麻生长提供了优越的自
然环境，因而成为中国的主要产区之一。一般传
统中药材讲究地道药材，地道药材是指在一特定
自然条件、生态环境的地域内所产的药材，以致
较同种药材在其他地区所产者品质佳、疗效好。
贵州天麻向来以品质好、药效高而享誉国内外。
天麻品种从茎、花的颜色和块茎的形状可分为
‘红杆’天麻、‘绿杆’天麻和‘乌杆’天麻(丁锐
2005)，而在贵州以‘红杆’和‘乌杆’天麻最为常
见。本文试对来源于 6个地区的‘红杆’和‘乌
杆’两个品种共 9份天麻的 rDNA ITS区进行PCR
扩增的结果显示，各天麻均可扩增出 1条 750 bp
左右的清晰条带。RFLP 分析表明在 BamHI 与
HincIII酶切图谱中，来源于贵州中部、西部和
云南地区的 YN、DF1、DF2、DF3和WD天麻
株与来源于贵州东南部的 LP、TJ1、TJ2和 LS株
的 RFLP图谱之间存在明显的差异，而在 HeaIII
酶切图谱中DF3与TJ1显著不同。分析天麻 rDNA
ITS区间的 RFLP，仅凭一个内切酶的酶切结果进
行种间差异分析是不适合的，如DF3在BamHI的
酶切结果和 YN、DF1、DF2、WD 的 RFLP图
谱一致，并不表现出种间差异，而在 HincII 与
HeaIII的酶切结果则表现出明显的差异。TJ1在
HincII酶切与 LP、TJ2和 LS的图谱一致，而在
BamHI和 HeaIII的酶切结果则表现出明显的差
异。我们估计 TJ 1与 TJ 2的图谱差异，DF3 与
DF1、2之间的差异可能同它们的品种不同有关，
这表明在天麻的各群体中可能由于天麻品种的不同
而存在有基因分化的现象。因此认为作 RFLP分
析时，必须根据多个酶切结果在总体上反映出共
同的规律时，作出的结论才是可靠的。因此根据
3个酶的酶切分析，供试天麻大致可以按东南部
和中西部分为两大支系，而DF3和 TJ1各在其支
系里形成分支系。由此我们可以推测天麻的 ITS
序列特征可能与其地域分布有一定的联系。
此外，我们还试图从一些存放时间较长的干
燥天麻或经加工处理后的商品药材中提取DNA，
结果很难获得DNA，而且根本扩增不出条带。 因
此天麻抽提时均采用新鲜天麻的地下块茎或鹦哥
嘴嫩芽。而市场上的商品天麻大多是经过一系列
的加工处理制成的干品，其DNA大部分已受到破
坏或降解，这给商品天麻的分子鉴定带来较大的
难度，因此如何从干品天麻中提取 DNA，并寻
找一段合适的基因序列进行研究，应该是今后值
得考虑的课题。
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