全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 657
百脉根液泡膜H+-PPase基因的 cDNA克隆与分析
孙艳香 1，王勇 2,*
1廊坊师范学院生物系，河北廊坊 065000；2南开大学生命科学学院，天津 300071
提要：采用 EST电子克隆和 RACE技术从豆科模式植物百脉根中克隆到一个液泡膜 H+-PPase基因的 cDNA，命名为
LcVP1。该 cDNA长为 2 962 bp，含 2 304 bp的完整开放阅读框，编码 767个氨基酸，其推测的氨基酸序列与绿豆、拟南
芥等 I类液泡膜H+-PPase的氨基酸序列同源性在80%以上，且有很高的功能区段保守性。该 cDNA序列已提交GenBank，
登录号为 EF440187。半定量RT-PCR表明，LcVP1在根、茎、叶中的表达不同，叶中表达最多，茎中最少。
关键词：百脉根；液泡膜 H+-PPase；LcVP1
Cloning and Analysis of cDNA Encoding a Tonoplast H+-PPase from Lotus
corniculatus L.
SUN Yan-Xiang1, WANG Yong2,*
1Department of Biology, Teachers College of Langfang, Langfang, Hebei 065000, China; 2College of Life Sciences, Nankai
University, Tianjin 300071, China
Abstract: A tonoplast H+-PPase cDNA, named LcVP1, was cloned from a model legume Lotus corniculatus L.
by EST in silico cloning and RACE. The cDNA contained 2 962 bp with an open reading frame (ORF) of 2 304
bp and encodes 767 amino acids. The deduced amino acid sequence showed more than 80% similarity to
homologues from other plants such as Vigna radiata and Arabidopsis thaliana, and highly conserved func-
tional domains of the gene class. This cDNA has been registered in GenBank with accession number EF440187.
Semiquantitive RT-PCR analysis indicated that LcVP1 expressions were different in roots, stems and leaves,
and richer in leaves, poor in stems.
Key words: Lotus corniculatus L.; tonoplast H+-PPase; LcVP1
收稿 2007-03-05 修定 　2007-06-19
资助 廊坊师范学院博士专项基金项目(LSZB200603)和天津
市科技厅项目(04 3 12 37 1 1)。
* 通讯作者(E-mail：wangyong@nankai.edu .cn；Tel：
02 2-23 50 43 82 )。
液泡膜H+-PPase，又称液泡膜H+转运无机焦
磷酸酶(H+-pyrophosphatase，H+-PPase，EC3.6.1.1)，
是一种广泛存在于植物、少数藻类、原生动物、
细菌以及原始细菌中的独特的H+转运酶(Maeshima
2000；Drozdowicz和 Rea 2001)。在液泡膜上，
液泡膜H+-PPase能将 PPi水解为 2个 Pi，不仅消
弱 PPi浓度过高对胞质中生物大分子合成的影响，
还可用 PPi水解产生的自由能，催化H+由胞质向
液泡的运输，与液泡膜H+-ATPase一起建立跨液
泡膜质子驱动力，为各种溶质分子(如阳离子、阴
离子、氨基酸和糖类等)的跨液泡膜主动运输提供
驱动力(Buchanan等 2000；Blumwald 1987；包
爱科等 2006)。自 1975年 Karlsson在甜菜(Beta
valgaris)根部匀浆中首次发现K+激活的H+-PPase
以来，近年来的生理生化以及分子生物学研究证
明其不仅在植物细胞抗缺氧胁迫、冷胁迫、干旱
和盐胁迫过程中起作用，而且与生长素的极性运
输相关(王延枝 1990；赵利辉和刘友良 1999；王
宝山和邹琦 2000；Karlsson l975；Maeshima
2000；Gaxiola等 1999；Li等 2005)。迄今，人
们已成功地从多种植物中分离到液泡膜H+-PPase
的 cDNA (Sarafian等 1992；Tanaka等 1993；
Sakakibara等 1996；Nakanishi和Maeshima 1998；
Fukuda等 2004；Brini等 2005；Gao等 2006)，其
中一些已通过基因工程手段用于植物抗盐和耐旱能
力的改良研究并取得显著效果(Gaxiola等 2001；
Park等 2005；Gao等 2006)。
百脉根为一种世界范围内广泛种植的多年生
豆科牧草，在西方国家还经常作为路旁和庭院观
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月658
赏植物。因其具有基因组小、植株再生容易以及
易于遗传转化等特点，近几年已用来作为豆科中
的模式植物进行分子生物学研究(Jiang和Gresshoff
1997)。至今尚未见关于百脉根中液泡膜H+-PPase
的报道。本文通过 EST电子克隆并结合 RACE技
术扩增到百脉根液泡膜H+-PPase基因cDNA序列，
定名为 LcVP1，并对该基因表达产物的特征进行
了预测分析。
材料与方法
百脉根(Lotus corniculatus L.)种子采自南开大
学试验田。植株种植于温室中，取其顶部幼嫩叶
片为试材提取总 R N A。R N A 提取试剂盒为
TIANGEN公司的“RNAplant植物RNA提取试剂
盒”，提取的总 RNA经DNase (TaKaRa公司)处
理后取1 µg用于反转录合成 cDNA第一链。cDNA
合成试剂盒购自 Promega公司，dNTP和 Taq plus
DNA聚合酶购自上海生工，引物合成和DNA测
序委托上海生工完成。
RT-PCR扩增百脉根液泡膜H+-PPase的cDNA
中间片段时，首先根据已报道的绿豆( V i g n a
radiata)液泡膜H+-PPase基因VVP2 (GenBank登录
号AB009077)对NCBI中EST数据库进行Blast分
析，比对结果发现一条登记号为 CB828572、功
能尚未鉴定的百脉根 EST序列。以此 EST序列为
种子序列，再次对NCBI中 EST数据库进行 Blast
分析并进行电子延伸，最后在对 6条 EST电子克
隆基础上得到了一条长为 2 109 bp的 cDNA片段
序列信息。据此设计 2个 PCR引物，P1：5-CCA-
TCAACCTGTTCCAGA-3；P2：5-CGTCATCA-
TCAACCAACC-3。以反转录合成的 cDNA第一
链为模板，反应体系为 5 µL 10×缓冲液；2.5 µL
2.5 mmol·L-1 dNTP；2.5 µL 4 µmol·L-1 P1引物；
2.5 µL 4 µmol·L-1 P2引物；2.5 µL cDNA第一链模
板；Taq plus DNA聚合酶 2 U；最后以蒸馏水
补足体积至 50 µL。反应条件为：94 ℃预变性 4
min，94 ℃变性 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃延伸
1.5 min，30个循环，然后 72 ℃延伸 10 min。PCR
产物经 0.8%琼脂糖凝胶电泳检查后，切下目的条
带，用 PCR产物纯化试剂盒回收DNA。与 pGM-
T Vector (TIANGEN公司)连接，转化大肠杆菌
(Escherichia coli) DH5α，鉴定并测序。
为了得到百脉根液泡膜H+-PPase基因全长编
码序列，根据测序得到的序列信息，采用
Clontech公司SMARTTM RACE Kit进行cDNA第一
链的合成及 RACE实验。在 3 RACE过程中合成
2个基因特异引物：GSP1，5-TATTGGTTCTGC-
TGCCCTTGTGTC-3；NGSP1，5-TGGTGACA-
CCATTGGAGACCCTC-3，后者用于Nest-PCR。
在 5 RACE实验中设计 2个基因特异引物，分别
为：GSP2，5-GAGAGGGTACAGCATGGCAGT-
AAAC-3；NGSP2，5-CCCCAACATTGTCACC-
AACATTATCAGC-3，后者用于Nest-PCR。严格
依试剂盒说明进行操作。PCR扩增产物的回收、
连接、转化和测序同上。
获得全长 cDNA序列信息后设计引物用于开
放阅读框(ORF框)片段的扩增。为了后续实验的
方便在上下游引物的5端分别引入2个限制性内切
酶的酶切位点，引物名称和序列如下：
PCR反应体系和扩增程序同上。PCR扩增产
物回收、连接、转化后正反向测通。
测序结果用DNAMAN软件进行分析并通过国
际生物技术信息中心网站(http://www.ncbi.nlm.nih.
gov/BLAST/)分析其基因同源性。应用 EBI 的
ClustalW软件(http://www.ebi.ac.uk/clustalW/)在线
进行多序列比对。
分析 LcVP1在各组织中表达时，挑选饱满整
齐的百脉根种子，经表面消毒后放入无生长调节
剂的MS培养基中，培养 21 d后分别取其根、茎、
上游引物，S1，5-TTAGGTACCCCCGGGATGGGTGCAGTCCTTC-3
KpnI SmaI
下游引物，A1，5-GGCTCTAGAGGATCCTTAGATCTTGAAGAGTAAGC-3
XbaI BamHI
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 659
叶提取总 RNA，用中间编码区引物 LcSD1 (5-
GGGCTTATCATTGGATTTGTAACTG-3)和LcSD2
(5-GAACCTCCTCAACCATCTTCAG-3)进行RT-
PCR，分析 LcVP1在各组织中的表达差异。PCR
扩增条件同上，循环数改为 25，目的片段长度为
582 bp。反转录产物稀释 50倍后用于内参泛素基
因的扩增，引物为 LcUB1(5-GGGAGGTATGCA-
GATCTTTGTG-3)和LcUB2 (5-CCTTCCAACTTA-
GAATCCAC-3)，循环数为 25，目的片段长度为
249 bp。本文中显示的结果经过 3次自 RNA提取
开始独立的重复实验，结果一致。
实验结果
1 百脉根液泡膜H+-PPase基因 cDNA序列信息的
获得
根据 EST电子克隆得到的百脉根 cDNA片段
信息设计特异引物 P1和 P2，通过 RT-PCR扩增得
到一条大约为 1 900 bp的条带，将此条带回收、
克隆并测序，测序结果与预期的目的片段序列相
似(图 1-a)，此片段为百脉根液泡膜H+-PPase基因
的中间部分序列。
根据上述扩增片段的测序结果进行 3 RACE
和 5 RACE实验后分别得到 728 bp和 920 bp的序
列信息(图 1-b、c)，为百脉根液泡膜H+-PPase基
因的 3端和 5端，分别与上述中间序列存在 377
bp、237 bp的交叠区。
将上述 3个片段的序列进行拼接，最终得到
一具有完整开放阅读框的 cDNA序列信息。再进
一步依据所得到的序列信息用引物S1和A1扩增(图
1-d)并测序后，得到长度为 2 304 bp ORF框序列，
与预期的序列完全一致。
2 百脉根液泡膜H+-PPase基因 cDNA序列分析
拼接后得到的 cD N A 全长序列如图 2。该
cDNA全长为 2 962 bp，包含一个长 2 304 bp的
开放阅读框，起始于序列的 56 bp，终止于 2 359
bp，5端非编码区长度为 55 bp，3端非编码区
长度为 603 bp，在 poly(A)上游 42 bp处有典型的
真核生物基因 poly(A)的加尾信号序列AATAA。
用DNAMAN软件分析其推断的编码产物为一
长 7 6 7 个氨基酸的多肽链，理论分子量为 8 0
kDa，等电点为 5.02。Multiple Alignent分析其与
拟南芥(Arabidopsis thaliana)、小麦(Triticum
aestivum)、绿豆(Vigna radiata)、大麦(Hordeum
vulgare)、水稻(Oryza sativa)等其他植物中功能已
鉴定的液泡膜H+-PPase的同源性，显示其与同属
于 I 类(K +激活型)的 VVP2 (GenBank登录号
AB009077)、AVP1 (GenBank登录号M81892)、
HVP1 (GenBank登录号 AB032839)、HVP2
(GenBank登录号D13472)、OVP1 (GenBank登录
号D45383)、OVP2 (GenBank登录号D45384)及
TVP1 (GenBank登录号 AY296911)的同源性为
85.7%~93.5%，而与属于 II类(K+迟钝型) AVP2
图 1 百脉根液泡膜H+-PPase基因 cDNA的 PCR扩增
Fig.1 PCR products of tonoplast H+-PPase gene cDNA in Lotus corniculatus
a：RT -PC R 产物；b：3 RAC E PC R 产物；c：5 RAC E PC R 产物；d：O R F 框。1：中间扩增片段；2：3 RAC E 片
段；3：5 R A C E 片段；4：O R F 框片段；M：分子质量标准。
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月660
图 2 LcVP1的 cDNA序列和推导的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide acid sequence and deduced amino acid sequence of LcVP1 cDNA
* 处为终止密码子，加框处为加尾信号。
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 661
(GenBank登录号AF182813) (Drozdowicz等 2000)
的同源性仅为 26.6% (图 3)，暗示着本文中克隆
得到的 cDNA序列编码 I类液泡膜H+-PPase，因
此将获得的 cDNA命名为LcVP1并提交GenBank，
获得登录号为 EF440187。
3 LcVP1编码产物的功能位点分析
在分析 LcVP1编码产物同源性过程中发现，
LcVP1与绿豆、拟南芥中的同源产物相似，也具
有“254DVGADLVGKVE264”结构模序。在陆生
植物的可溶性 PPase和H+-PPase中，该模序高度
保守，推测为 P P i 水解过程中的底物结合位点
( L y n d o n 1 9 9 0 ) ; 同时存在另一个功能模序
“425EYYTS429”，该模序也高度保守，负责 H+的
转运(Drozdowicz和 Rea 2001；Yokoi等 2002); 此
外，已有的研究指出，在所有植物的液泡膜 H+-
PPase中均包含着一个非常保守的 E (拟南芥中为
E229)，该残基在偶联 PPi的水解和H+的跨膜转运
过程中发挥作用(Zhen等 1997)，本文中该残基为
LcVP1的 227位氨基酸。根据上述分析，我们认
为本文中获得的 cDNA是编码百脉根液泡膜 H+-
PPase的。
4 百脉根基因组中LcVP1基因结构分析
以获得的LcVP1 cDNA为信息探针在GenBank
中进行Blast分析，找到一个与之高度匹配的基因
组 DNA序列，该序列来自百脉根的变种 Lotus
cornicu latus var . japonicus第 4号染色体的
AP006375.1克隆。基因结构分析的结果为 LcVP1
在百脉根基因组中为一个包含8个外显子和7个内
含子的基因(图 4)，其外显子与内含子连接区符合
经典剪拼序列的GT⋯G规则，表明本文中获得的
基因是一个客观存在的核基因。
5 LcVP1的组织表达分析
分别取百脉根组培苗的根、茎、叶提取总
RNA，用中间 582 bp编码区代表目的基因，采
用半定量RT-PCR的方法分析LcVP1在各组织中表
达差异的结果(图 5 )显示，正常生长条件下，
LcVP1在叶片中表达量最高，根中次之，茎中最
低。这说明在未受胁迫的情况下不同组织中的
LcVP1均有一定的基础表达水平，且其表达具有
组织特异性。
图 3 百脉根 LcVP1蛋白序列与其他植物同源蛋白序列的
进化树分析
Fig.3 Homology-tree analysis of LcVP1 with homologous
proteins from other plants
L c V P 1 来源于百脉根( L o t u s c o r n i c u l a t u s ) ; V V P 2
(AB009077)来源于绿豆(Vigna radiata ); AVP1 (M81892)和
AVP2 (AF182813)来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana); HVP1
(AB032839)和HVP2 (D13472)来源于大麦(Hordeum vulgare);
TVP1 (AY296911)来源于小麦(Triticum aestivum); OVP1 (D45383)
和 OVP2 (D45384)来源于水稻(Oryza sativa)。
图 4 百脉根基因组中 LcVP1基因结构
Fig.4 The structure of LcVP1 gene in L. corniculatus
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月662
讨 论
本文通过 EST电子克隆并结合 RT-PCR及
RACE技术得到了百脉根液泡膜H+-PPase基因具完
整编码区的 cDNA序列信息。该 cDNA全长为 2
962 bp，其中 5端非编码区长度为 55 bp，开放
阅读框长度为 2 304 bp，3端非编码区长度 603
bp，编码产物长度为 767个氨基酸。该 cDNA编
码的氨基酸序列与绿豆、拟南芥等植物中 I类(K+
激活型)液泡膜H+-PPase的氨基酸序列同源性较高
(>80%)，而与拟南芥 II类(K+迟钝型)液泡膜H+-
PPase同源性较低(<30%)，据此推测 LcVP1是一
个 I类液泡膜H+-PPase基因。
正常生长条件下，百脉根 LcVP1基因在不同
组织中均有一定的表达，这与 Fukuda等(2004)、
Brini等(2005)在大麦和小麦中的研究结果一致，
暗示液泡膜H+-PPase对植物体维持正常的生理生
化反应是必不可少的，其可能是通过维持细胞内
离子平衡、渗透平衡、参与蔗糖的合成和生长素
的极性运输等多个方面发挥功能的(Buchanan等
2000；Blumwald 1987；包爱科等 2006)。
此外，已有的研究显示，各种逆境条件(如
低温、缺氧、盐渍和干旱胁迫等)都影响植物中
的液泡膜H+-PPase活性(赵利辉和刘友良 1999；
Maeshima 2000)。这种与植物多种抗逆性相关的
特性在农作物的抗逆育种中具有潜在的应用价值。
因此，本文中百脉根液泡膜H+-PPase基因 LcVP1
的克隆对进一步揭示其在抗逆生理中的作用以及进
行液泡膜H+-PPase基因工程操作来说，可能是有
意义的。
参考文献
包爱科, 张金林, 郭正刚, 王锁民(2006). 液泡膜H+-PPase与植物
耐盐性. 植物生理学通讯, 42 (4): 777~783
王宝山, 邹琦(2000). NaCl胁迫对高粱根、叶鞘和叶片液泡膜ATP
酶和焦磷酸酶活性的影响. 植物生理学报, 26: 181~188
王延枝(1990). 植物液泡膜上的焦磷酸酶. 植物生理学通讯, (4):
73~76
赵利辉, 刘友良(1999). 液泡膜 H+-PPase及其对逆境胁迫的反应.
植物生理学通讯, 35 (6): 441~445
Blumwald E (1987). Tonoplast vesicles for the study of ion
transport in plant vacuoles. Physiol Plant, 69: 731~734
Brini F, Gaxiola RA, Berkowitz GA, Masmoudi K (2005). Cloning
and characterization of a wheat vacuolar cation/proton
antiporter and pyrophosphatase proton pump. Plant Physiol
Biochem, 43: 347~354
Buchanan BB, Gruissem W, Jones RL (2000). Biochemistry and
Molecular Biology of Plants. Rockville, MD: American So-
ciety of Plant Physiologists, 637~638
Drozdowicz YM, Kissinger JC, Rea PA (2000). AVP2, a sequence-
divergent K+-insensitive H+-translocating inorganic pyro-
phosphatase from Arabidopsis. Plant Physiol, 123: 353~362
Drozdowicz YM, Rea PA (2001). Vacuolar H+-pyrophosphatases:
from the evolutionary backwaters into the mainstream.
Trends Plant Sci, 6: 206~211
Fukuda A, Chiba K, Maeda M, Nakamura A, Maeshima M, Tanaka
Y (2004). Effect of salt and osmotic stresses on the expres-
sion of genes for the vacuolar H+-pyrophosphatase, H+-AT-
Pase subunit A, and Na+/H+ antiporter from barley. J Exp Bot,
55 (397): 585~594
Gao F, Gao Q, Duan XG, Yue GD, Yang AF, Zhang JR (2006).
Cloning of an H+-PPase gene from Thellungiella halophila
and its heterologous expression to improve tobacco salt
tolerance. J Exp Bot, 57 (12): 3259~3270
Gaxiola RA, Li J, Undurraga S, Dang LM, Allen GJ, Alper SL, Fink
GR (2001). Drought- and salt-tolerant plants result from
overexpression of the AVP1 H+-pump. Proc Natl Acad Sci
USA, 98: 11444~11449
Gaxiola RA, Rao R, Sherman A, Grisafi P, Alper SL, Fink GR
(1999). The Arabidopsis thaliana proton transporters, AtNhx
l and Avp1 can function in cation detoxification in yeast.
Proc Natl Acad Sci USA, 96: l480~1485
Jiang Q, Gresshoff PM (1997). Classical and molecular genetics of
the model legume Lotus japonicus . Mol Plant-Microbe
Interact, 10 (1): 59~68
Karlsson J (1975). Membrane-bound potassium and magnesium
ion-stimulated inorganic pyrophosphatase from roots and
cotyledons of sugar beet (Beta vulgaris L.). Biochim Biophys
Acta, 399: 356~363
Li J, Yang H, Peer WA, Richter G, Blakeslee J, Bandyopadhyay A,
Titapiwantakun B, Undurraga S, Khodakovskaya M, Richards
EL et al (2005). Arabidopsis H+-PPase AVP1 regulates auxin-
mediated organ development. Science, 310: 121~l25
Lyndon RF (1990). Plant development: the cellular basis. In: Black
图 5 百脉根 LcVP1基因在不同组织中的表达
Fig.5 Tissue-specific expression analysis of LcVP1 in
L. corniculatus
植物生理学通讯 第 43卷 第 4期，2007年 8月 663
M, Chapman J (eds). Topics in Plant Physiology. London:
Unwin-Hyman Ltd, 165~189
Maeshima M (2000). Vacuolar H+ pyrophosphatase. Biochim
Biophys Acta, 1465 (1): 37~51
Nakanishi Y, Maeshima M (1998). Molecular cloning of vacuolar
H+-pyrophosphatase and its developmental expression in
growing hypocotyl of mung bean. Plant Physiol, 116:
589~597
Park S, Li JS, Pittman JK, Berkowitz GA, Yang HB, Undurraga S,
Morris J, Hirschi KD, Gaxiola RA (2005). Up-regulation of
a H+-pyrophosphatase (H+-PPase) as a strategy to engineer
drought-resistant crop plants. Proc Natl Acad Sci USA, 102
(52): 18830~18835
Sakakibara Y, Kobayashi H, Kasamo K (1996). Isolation and
characterization of cDNAs encoding vacuolar H+-pyrophos-
phates isoforms from rice (Oryza sativa L.). Plant Mol Biol,
3l: 1029~1038
Sarafian V, Kim Y, Poole RJ, Rea PA (1992). Molecular cloning
and sequence of cDNA encoding the pyrophosphate-ener-
gized vacuolar membrane proton pump of Arabidopsis
thaliana. Proc Natl Acad Sci USA, 89: 775~779
Tanaka Y, Chiba K, Maeda M, Maeshima M (1993). Molecular
cloning of cDNA for vacuolar membrane proton-translocat-
ing inorganic pyrophospha tase in Ho rde um vulgar e .
Biochem Biophys Res Commun, l90: 1110~1114
Yokoi S, Quintero FJ, Cubero B, Ruiz MT, Bressan RA, Hasegawa
PM, Pardo JM (2002). Differential expression and function
of Arabidopsis thaliana NHX Na+/H+ antiporters in the salt
stress response. Plant J, 30: 529~539
Zhen RG, Kim EJ, Rea PA (1997). Acidic residues necessary for
pyrophosphate-energized pumping and inhibition of the
vacuolar H+-pyrophosphatase by N, N’-dicyclohexylcarbo-
diimide. J Biol Chem, 272: 22340~22348