全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 2期，2008年 4月 307
荷叶铁线蕨的组织培养与快速繁殖
黄芳 1,2，程治英 1，龙春林 1,*
1中国科学院昆明植物研究所，昆明 650204；2云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201
Tissue Culture and Rapid Propagation of Adiantum reniforme L. var. sinense
Y. X. Lin
HUANG Fang1,2, CHENG Zhi-Ying1, LONG Chun-Lin1,*
1Kunming Institute of Botany, Chinese Academy of Sciences, Kunming 650204, China; 2College of Agronomy and Biotechnology,
Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China
收稿 2008-01-28 修定 2008-03-19
资助 科技部国家科技基础条件平台项目(2005DKA21006)。
* 通讯作者(E-mail：long@mail.k ib.ac.cn；Tel：0871-
5 2 2 3 2 3 3 )。
1 植物名称 荷叶铁线蕨(Adiantum reniforme L. var.
sinense Y. X. Lin)，又名荷叶金线草。
2 材料类别 成熟孢子。
3 培养条件 孢子萌发培养基：(1) 1/2MS；(2) 1/MS+
0.5 g·L-1活性炭。原叶体增殖培养基：(3) MS+6-
BA 1.0 mg·L-1 (单位下同)+NAA 0.2；(4) MS+6-BA
1.0+NAA 0.5；(5) MS+KT 1.0+NAA 0.2；(6)
MS+KT 1.0+NAA 0.5。绿色小球(GGB)形成培养
基：(7) MS+6-BA 2.0+NAA 0.5。GGB分化增殖
培养基：(8) MS+6-BA 1.5+NAA 0.5；(9) MS+KT
1.5+NAA 0.5。愈伤组织形成培养基：(10) MS+
6-BA 1.0；(11) MS+KT 1.5。GGB转化培养基：
(12) MS+IBA 0.05；(13) MS+IBA 0.5。孢子体形
成培养基：(14) MS+NAA 1.0；(15) MS+ABA 0.5+
IBA 0.1。生根培养基：(16) 1/2MS+NAA 0.2+活
性炭(AC) 0.5 g·L-1；(17) 1/2MS+IBA 0.2+AC 0.5
g·L-1。以上培养基均含30 g·L-1蔗糖和0.7%琼脂，pH
5.5~5.8。培养温度(26±2) ℃，连续光照 12 h·d-1，
光照强度 20~40 µmol·m-2·s-1。
4 生长与分化情况
4.1 无菌材料的获得 将长有成熟孢子囊的荷叶铁
线蕨叶片小心摘下，正面朝上铺在白纸上，用台
灯光照 1~2 h，孢子囊自然干燥开裂，获得成熟
孢子。将除去杂质的干净孢子用滤纸包好，蒸馏
水浸泡 2 h。在超净工作台上，用 75%酒精灭菌
30 s，再用 0.1%升汞浸泡 5 min，无菌水漂洗 3
次。然后将消过毒的孢子接种于孢子萌发培养基
( 1 )、( 2 )上。
4.2 孢子萌发 经 15~25 d的培养，培养基(1)、(2)
中能见到零星的绿色小点，显微镜检验结果为孢
子萌发；60 d左右可见原叶体形成。荷叶铁线蕨
的原叶体在孢子萌发培养基上生长良好，经过一
段时间，原叶体簇生成团状，其中培养基(2)的萌
发速度比(1)快。
4.3 原叶体的增殖 将孢子萌发形成的原叶体团分
散成小块，每块约 0.5 cm×0.5 cm，接种于原叶
体增殖培养基(3)~(6)上，原叶体能快速增殖，形
成球状油绿色紧密簇生的原叶体团。各培养基中
的增殖速度为(6)>(4)>(3)>(5)。多次继代后，能
形成大量的原叶体团，以2个月3~4倍的速度增长。
4.4 GGB的形成 将增殖迅速的原叶体团接种到
GGB形成培养基(7)上，10 d左右，绿色原叶体
逐渐转浅绿，GGB形成开始启动；20 d左右，原
叶体团顶部形成淡黄晶莹的小颗粒；30 d左右，
小颗粒形成类似兰花原球茎的深色GGB。
4.5 GGB的分化与增殖 将形成的GGB与原叶体
团转入培养基(8)、(9)中，10 d左右，几乎所有
原叶体团转化为松散布于培养基上的GGB颗粒。
培养基(8)转化速度低于培养基(9)，且GGB颜色
深绿，外表密布黄色绒毛；培养基(9)中的 GGB
颗粒嫩绿而晶莹。
4.6 愈伤组织的诱导 将原叶体团接种到培养基
(10)、(11)中，持续生长 3个月，在原叶体边缘
形成大量浅绿色的愈伤组织。
4.7 GGB的转化 将GGB团接种到GGB转化培养
基(12)、(13)，经 10 d左右，颗粒又逐渐转化成
新绿紧密簇生的原叶体小丛。
4.8 孢子体的形成 不断继代增殖的培养基上经 3
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个月也很难长出孢子体；但将成熟原叶体团接种
于孢子体形成培养基(14)、(15)上，约 60 d后长
出幼嫩孢子体(图 1)。培养基(15)上孢子体形成速
度最快，20 d左右，20%~30%的原叶体团形成
孢子体；但培养基(15)上原叶体不再增殖，孢子
体很快就长出小圆叶和成熟的黑色叶柄。培养基
(14)上，60 d左右，原叶体团上方抽苔出幼嫩孢
子叶，同时原叶体仍能继续增殖；90 d左右，全
部长成孢子体，绿色幼嫩叶柄才成熟变黑。
三峡一带(万县、石柱)，海拔高度 200~400 m，
是国家二级保护植物(王诗云等 1995；许天全等
1987)。其根状茎短而直立，单叶簇生，叶片圆
肾型，叶柄亮黑，小巧别致，可供观赏；还具
有重要的药用价值，对黄疸肝炎、泌尿系统感
染、中耳炎等疾病有较好疗效(谢宗强 1993)。然
而荷叶铁线蕨自然繁殖能力弱，数量稀少。三峡
工程建成之后，其原来的生境受到破坏，有关部
门已采取措施进行异地保护，但通过无性繁殖扩
大其个体数量、确保该濒危物种长期保存，仍是
十分必要和及时的，对于该植物的回归引种尤其
重要(谢宗强 1993)。采用无菌播种和组织培养快
速繁殖技术，可极大提高其繁殖系数，并保持该
种的特性。目前同属其他种植物的组织培养已有
报道(曾宋君等 2005；罗顺元和王任翔 2007)，但
荷叶铁线蕨的组织培养和快速繁殖的报道迄今未见。
参考文献
罗顺元, 王任翔(2007). 假鞭叶铁线蕨孢子的组织培养. 植物生理
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王诗云, 赵子恩, 彭辅松, 蒋祖德编著(1995). 华中珍稀濒危植物
及其保存(第一册). 北京: 科学出版社, 14~15
谢宗强(1993). 三峡工程对库区特有濒危植物荷叶铁线蕨的影响
与对策. 生物多样性, 1 (1): 16~18
许天全, 郑重, 金义兴(1987). 论荷叶铁线蕨的分布特点. 武汉植
物学研究, 5 (3): 247~252
曾宋君, 陈之林, 段俊(2005). 楔叶铁线蕨的离体快繁. 植物生理
学通讯, 41 (4): 499
4.9 生根与移栽 将已分化出茎、叶的丛生小苗分
成小团转入生根培养基(16)、(17)中，30~40 d可
生根(图 2)出瓶，生根率达 100%。当培养瓶内所
有原叶体几乎都长出高约 5 cm的孢子体时，打开
瓶盖，放于温暖、湿润、通风的环境中炼苗
15~20 d。植株叶片伸展，将生根苗小心取出，
洗去根部琼脂，移栽在温暖且不蓄水的消毒水苔
或珍珠岩中(图 3)，盖塑料膜保湿，保持环境温
度约 25 ℃。定植初期应注意喷雾保湿和保温，4
周后小苗可定植生长，成活率可达 90%。2周后
可浇 0.05%尿素水肥，每周 1次。4个月后再分
株上盆种植，3~4株一盆(图 4)。
5 意义与进展 荷叶铁线蕨为铁线蕨科铁线蕨属的
多年生常绿草本状蕨类植物，仅分布于我国长江
图 3 荷叶铁线蕨的移栽苗
图 4 荷叶铁线蕨的分株小苗
图 1 荷叶铁线蕨的孢子体
图 2 荷叶铁线蕨的生根苗