全 文 ：武汉植物学研究 2007，25(2)：173～177
Journa／of Wuhan Botanical Research
荷叶铁线蕨孢子的不同贮藏时间与培养条件
对配子体和孢子体形成的影响
潘利 ，叶其刚 ，黄宏文h
(1．中国科学院武汉植物园，武汉 430074；2．中国科学院研究生院，北京 100049)
摘 要：研究了荷叶铁线蕨(Ad~mum r~niform,e var．$inel~e)的不同贮藏时间与培养条件对其配子体发育和孢子体
形成的影响，结果表明：荷叶铁线蕨孢子为不含叶绿素孢子，在室温下保存 5年 以上时间依然具有活力 ，但不同的
贮藏时间对配子体和孢子体的形成具有显著的影响。其中，室温贮藏7 d的配子体形成的时间为29 d，而贮藏5年
的为 38 d；贮藏 7 d的孢子体形成的时间为 96 d，贮藏 4个月的为 105 d。在培养室[(25±1)cC恒温和每天 2000—
2500 k 12 h光照]沙基质中，从孢子播种到形成孢子体时间最短 ，为 87 d；沙基质比腐殖土更利于孢子体的形成 ；
配子体密度在不超过 3株／cm 的情况下 ，密度越高越有利于孢子体的形成。
关键词：荷叶铁线蕨；贮藏时间；培养条件；配子体；孢子体
中图分类号：Q945．51 文献标识码：A 文章编号：1000．470X(2007)02．0173．05
Efects of Spore Storage Time and Culture Conditions on the
Formation of Gametophyte and Sporophyte of
Adiantum reniforme var．sinense
PAN Li ，YE Qi．Gang ，HUANG Hong．Wen
(1．Wuhan Botanicaz Garden，The Chinese Academy ofSc／ences，Wuhan 430074，China；
2．Graduate School ofthe Chinese Academy D，Sciences，Beijing 100049，China)
Abstract：The efect of diferent spore s~rage time and cultivate conditions on the formation of gameto-
phyte and sporophyte in Adiantum renifo丌 var．sinense was investigated in present study．The results
showed that the spores of A．r~nifo丌 Va．F．sinense was non-chlorophylous spores and could remain viable
in ambient storage for at least five years，but diferent storage time has a significant efect on formation
time of both gametophytes and sporophytes，with that 7 days ambient s~rage resulting gametophyte forma-
tion in 29 days prolonged five year ambient storage resulting sporophyte formation in 38 days，whereas 7
days amb ient s~rage resulting sporophyte formation in 96 days prolonged four month storage resulting spo-
rophyte formation in 105 days．Th e culture condition(controled temperature and light：(25±1)oC and
2000-2500 lx for 12 h／day)in sand media resulted in a sho~est sporophyte formation time，87 days af-
ter spo raphyte was inoculated．The sand medium is more favorable than peat soil for sporophyte formation
an d hi gh density of gam etophytes enhanced the spo rsphyte formation．
Key words：Adiantum renifo胱 Var．sinense；Storage time；Culture conditions；Gametophyte；Sporo．
phyte
近几十年来，对蕨类植物孢子的保存越来越受
到人们的重视，因为蕨类植物的孢子有许多适合于
迁地保存的特征，如孢子容易获得、数量大、占用空
问小以及在简单的培养基中就能很快地萌发等。相
对于种子植物的种子保存来说，有关蕨类植物孢子
贮存时间长短对孢子活力影响的研究甚少。Lloyd
和 Klekowski⋯系统地比较了含叶绿素的孢子和不
含叶绿素的孢子在不同的贮藏时问其孢子维持活力
的差别，发现从几天到数十年不等，不含叶绿素的孢
子具有更长的活力(平均 1045 d)，但需要更长的时
间(4—210 d，平均 9．5 d)才能萌发，且形成配子体
所需的时间也更长。
荷叶铁线蕨(Adiantum renifo，7 ．var sinense)又
名荷叶金钱草l2 ，属铁线蕨科(Adiantaeeae)铁线蕨
收稿 日期：20064)9-20，修回日期：2006—12一l1。
基金项目：中国科学院知识创新工程重要方向性项 目(KSCX2一Yw—N-032)。
作者简介 ：潘利(1977一)，女，湖北罗田人，在读研究生，主要从事植物保育和遗传育种研究。
·通讯作者(Author for corespondence．E—mail：hongwen@wbgcas．el1)。
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174 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
属(Adiantum L．)，1978年首次发现于我国四川省
万县(现重庆市万州区) 】，为我国特有的珍稀濒危
蕨类植物，列为国家二级保护植物 J。荷叶铁线蕨
植株形体小巧、别致优美，叶片形似荷叶，自发现以
来，其不仅作为第四纪孑遗植物引起了植物学家的
关注，还作为一种新型的观赏植物引起了园林学家
的重视 J。研究表明，在过去的近 2O年中，一方面
因为荷叶铁线蕨具有重要的药用价值而遭到当地居
民过度地非法采集，另一方面由于三峡工程修建导
致原生境的栖息地减少和片断化 ’ ，使得荷叶铁
线蕨的野生资源急剧减少，使该物种面临着野外绝
灭的风险，同时，生长周期长是荷叶铁线蕨珍稀濒危
的原因之一 J。因而对其进行迁地保护和孢子育
苗是挽救该濒危物种的必须措施。本研究在查明荷
叶铁线蕨孢子是否含有叶绿素的基础上 ，探讨不同
贮藏时间对荷叶铁线蕨孢子萌发、配子体和孢子体
发生及不同培养条件对孢子体产生时间的影响，以
期为该物种的孢子保存和建立快繁体系提供科学依
据，并与徐惠珠等 的研究结果进行了比较。
1 材料与方法
1．1 材料准备
荷叶铁线蕨(Adiantum renifo册e var sinense)植
株是 1987年从重庆万州原产地引种到武汉植物园，
经过孢子繁殖得到的后代。单因子随机区组实验所
用的孢子分别采集于2000年9月(贮藏5年)、2005
年 6月(贮藏 4个月)及 2005年 9月(贮藏 1周)；
裂区实验所用的孢子来源于2005年9月采集的孢
子。所有叶片采后置于纸袋中室温保存，并于 2005
年 9月 21 13播种，播种和培养参照徐惠珠的方
法-9 J，播种时孢子无消毒处理。播种后培养条件为
2000～25o0 b【，光照 12 h，温度(25±1)cI=。
1．2 单因子随机区组实验
不同贮藏时间对孢子萌发、配子体和孢子体形
成的影响采用单因素随机区组实验。设不同贮藏时
间 1周、4个月、5年为 3个处理，每个处理重复 4
次，每个重复播种3盆(盆为10×12 cln的土钵)，共
12盆，培养基质为腐殖土。主要观察记录孢子萌发
过程、配子体及其孢子体形成时间，其中配子体形成
时间以培养钵的1／5面积上土面变绿(在显微镜下
观察心型的原叶体初形成时期)时进行统计；幼孢
子体形成时间以1／3配子体形成孢子体(此时孢子
体多数只有一片叶片，此时间是指从播种到形成孢
子体的时间)来计算。同时用光学显微镜定期观察
并拍摄孢子萌发及配子体的形态发育过程，直至形
成幼孢子体。记载每盆中杂菌入侵情况，从配子体
的出现到孢子体形成期间共记载 7次，并参照烟草
病虫害等级划分方法 ¨将其量化。
1．3 裂区实验
不同培育条件、播种密度和基质对孢子体形成
的影响采用裂区实验进行。不同的培育条件为主处
理(A)，分别为两个水平：A1培养室[(25±1)℃，
2000—25o0 b【光照 12 h]，A2温室(1O～27cI=，自然
光照)；第一副处理为不同的基质(B)，分别为两个
水平 ：B1(沙)和 B2(腐殖土)；第二副处理为不同的
栽培密度(c)，分别为三个水平，即：c1(30彬 培养
nn)，C2(60彬 培养皿)，C3(90彬 培养皿)，培养
皿直径为6 cm。此实验采用播种后 67 d萌发形成
的心形原叶体(此时原叶体生长大概 2O多天)为材
料，参照季华 ¨对荷叶铁线蕨不完全培养的方法进
行处理，即将原叶体按照不同的密度分别移栽到放
有已灭菌的不同基质的培养皿中，移栽后盖上玻璃
盖。配子体移栽参考徐惠珠等 的方法并进行改
进，具体方法为：用宽竹签将需要移栽的配子体撬
起，用小刀片划成几毫米的小块，最后用小剪刀将破
损的和多余的配子体剪除，保证每小块有一完整配
子体，均匀置于培养皿中。移栽后，每 2 d观察 1
次，记录孢子体形成时间，其中孢子体形成时间以
第一株幼孢子体(此时孢子体只有一片叶片)形成
时间(指从配子体移栽到形成孢子体的时间)为
标准。
1．4 数据统计分析
所有的数据均用 SPSS 12．0进行分析，采用单
因素方差分析 和多重 比较 (最 小显 著差数 法，
LSD)¨ 比较不同贮藏时间对配子体和孢子体形成
时间的影响及不同贮藏时间孢子萌发后的杂菌污染
情况；采用裂区分析方法和多重比较 (最小显著差
数法 ，LSD)E121分析不同环境、基质和密度对荷叶铁
线蕨孢子体形成的影响。
2 结果与分析
2．1 孢子萌发及配子体的形态发育
荷叶铁线蕨孢子不含叶绿素。孢子播种后 1周
吸水膨胀，并开始萌发，逐渐发育形成丝状体、片状
体和原叶体。孢子萌发时的细胞分裂为向心型或
Vitaria型，丝状体具有 2～5个细胞 ，原叶体发育为
铁线蕨型(Adiantum type)E131。
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第2期 潘 利等：荷叶铁线蕨孢子的不同贮藏时间与培养条件对配子体和孢子体形成的影响 175
2．2 不同贮藏时间对配子体和孢子体形成时间的
影响及杂菌污染情况
贮藏 1周与4个月的孢子在配子体形成时间上
不存在差异，但在孢子体形成时间上差异显著，大约
提前 9 d；贮藏 5年与 1周的孢子在配子体形成时间
上差异极其显著，与贮藏 4个月也差异显著(见表
1)。实验过程中同时观察到在整个萌发生长阶段
都有杂菌污染，不同贮藏时间杂菌污染情况不相同，
贮藏 5年的孢子其配子体在生长 20 d后由于杂菌
污染没有能形成孢子体就死亡。贮藏 1周与5年的
孢子在杂菌污染方面差异极其显著，与贮藏4个月
之间的差异显著；贮藏4个月与 5年间的差异极其
显著。
表 1 不同贮藏时间对配子体、孢子体形成时间和
杂茵污染的影响
Table 1 The efect ofthe diferent spore storage period
on gametophyte and spomphyte formation and
fungus contamination
统计变量 些 竺竺 F值
Statistical Vaimble8 ，、1
One
周
wee．k Four
堋
mont．hs F1．y
5
e
年
years
F Value
F配予 形盛时间( ) 29．3aA 32．5aAB 38．ObB 5．78· ornlstlon ot gam etopnyte 一
璺子够形摩时间(_d 96．0 105．Ob 一 9．0· ormalon ot sporoD1wte
c意 骶 2．50&A 4．50bAB 10．0B 67．8”
注：大小写字母分别表示0．O1和0．05显著水平(最小显著差
数法，LSD)；·在 0．05概率水平上显著。··在 0．01
概率水平上显著；一：贮藏 5年的因受杂菌污染影响最终
没有孢子体的形成。
Notes：The capital and smal letters represent significance level of
Ppcauge of fungus contamination．
2．3 不同培养条件对荷叶铁线蕨孢子体形成的影
响
原叶体移栽后无明显的缓苗期，播种 87 d后，
生长到大约O．8～1．2 cm长的时候，在培养室的沙
基质里面首先长出了第一株孢子体，在此之后各培
养皿中的孢子体逐渐形成，其孢子体形成率都在
90％ ～100％之间。从表2可知，不同环境、不同基
质和不同栽培密度对荷叶铁线蕨的孢子体的形成影
响差异极其显著，并且环境和密度之间的交互作用
差异极其显著，基质和密度之间的交互作用差异显
著。在不同密度之间，密度越大，形成孢子体时间越
短，三个不同的密度之间差异显著，在 30彬 培养皿
和90株／培养皿之间差异极其显著。
从最早形成孢子体到达到孢子体最大形成率之
间的时间，不同密度之间只存在 1～2 d的差异，在
不同环境和基质中亦存在一定的差异，其时间分别
为：培养室沙基质约7 d，培养室腐殖土约 11 d，温室
沙基质约 20 d，温室腐殖土中约 30 d。但是各处理
之间的最早形成孢子体的时间存在极大的差异，如
培养室环境比温室环境平均提早 7 d、沙基质比腐质
土提早4 d形成孢子体，最早形成孢子体(培养室沙
基质)与最迟形成孢子体(温室腐殖土)的时间相差
30 d。
表 2 不同影响因子对荷叶铁线蕨孢子体形成的影响
Table 2 Th e efect of diferent efectors on the
porophyte form ation
注：大小写字母分别表示 0．O1和0．05显著水平(最小显著
差数法 ，lJsD)；·在 0．05概率水平上显著，··在 0．O1
概率水平上显著。
Notes：The capital an d small letters repr~ent significance level of
P<0．01 and P<0．05，respectively；Level of signifcance：
·P3 讨论
3．1 不同贮藏时间对荷叶铁线蕨配子体和孢子体
形成的影响
荷叶铁线蕨孢子为不含叶绿素的孢子。徐惠珠
等研究发现荷叶铁线蕨孢子贮存一年后仍具有良好
的育苗效果。本研究首次证实荷叶铁线蕨孢子在室
温下保存5年以上时间依然具有活力，孢子保存对
于荷叶铁线蕨的种质保存来说是一种有效的方法。
孢子不同的贮藏时间对配子体和孢子体的形成影响
较大，一方面可能是由于不同贮藏时间对孢子的活
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176 武 汉 植 物 学 研 究 第 25卷
力有一定影响；另一方面贮藏时间越久孢子附着的
杂菌越多，杂菌明显影响了配子体和孢子体的形成。
杂菌污染对最终幼孢子体的形成具有重要的影响，
参照病虫害等级划分方法将杂菌污染量化进行相关
分析表明：杂菌污染与幼孢子体的形成具有很大的
相关性 (／．2=0．89，P<0．001)。Simabukuro 等建
议在培养基质中加人制霉菌素(Nystatin)可有效地
防止细菌和真菌的污染，且不影响孢子的萌发和配
子体的发育。Quintanila【1 等在对蕨类植物的贮藏
研究中发现，贮藏温度和湿度对孢子的活力影响很
大，并且干藏对于相对湿度要求比较大的蕨类植物
来说并不很合适。荷叶铁线蕨是生活在对相对湿度
要求比较高的环境下的一种蕨类，本研究采用的贮
藏方法是室温干藏保存，但由于保存的材料是整个
孢子叶，可能有利于维持一定湿度，但贮藏时间越
长，滋生的杂菌也越多。需进一步探讨抑菌保存孢
子叶孢子的最佳保存方式，对比研究不同湿度、温度
和贮藏时间对孢子萌发及配子体和孢子体萌发的
影响。
3．2 配子体的形态发育
本研究中发现荷叶铁线蕨丝状体具有 2—5个
细胞，与季华 ¨对荷叶铁线蕨及包文美 对掌叶
铁线蕨报道的相一致，但是与徐惠珠 观察的荷叶
铁线蕨丝状体多数为2个细胞和周玲革 报道的
铁线蕨丝状体为 2—8个细胞存在一定的差异，这说
明铁线蕨属丝状体的细胞数量在种内及种间都存在
一 定差异。荷叶铁线蕨丝状体多为2—5个细胞长
的单列丝状体，有些荷叶铁线蕨丝状体长到 2个细
胞时前端细胞即进行纵裂再进行横裂，形成 2列或
多列丝状体 ¨ 。荷叶铁线蕨配子体发育为铁线蕨
型，与已报道的铁线蕨属其他植物相同。
3．3 培养条件对配子体和孢子体形成的影响
对于大多数蕨类来说，对孢子萌发和孢子体形
成具有重要影响的培养条件是相对湿度、温度、光照
和基质。史红文等 对荷叶铁线蕨的生境特征研
究发现，空气湿度和光照条件对荷叶铁线蕨的野外
分布较为重要，本实验是将相对湿度控制在90％以
上的基础上进行的，结果发现，在光照条件为2000—
2500 Ix光照 12 h的培养室的沙基质中，从孢子播种
到形成孢子体时间最短，为87 d，这与前期报道的最
短时间 110 d相比，大大缩短了荷叶铁线蕨从孢子
播种到幼孢子体形成时间。总体来看，在最早形成
孢子体的时间上，培养室环境比温室环境平均提早
7 d，说 明培养室 (25±1)℃恒温 和每天 2000—
2500 Ix 12 h光照条件对荷叶铁线蕨孢子体形成比
较有利。
播种基质对孢子萌发和配子体发育的影响在蕨
类播种繁殖中研究比较多，大多数研究表明，具有一
定营养物质的基质更有利于孢子的萌发和配子体的
发育，这一结论在很多蕨类的无菌培养中得到了验
证 9¨加]。但是，关于培养基质对孢子体发生的研究
报道较少，本实验发现在沙基质中比在腐殖土中更
有利于孢子体的形成，这与季华L1u在对荷叶铁线蕨
组织培养研究中发现孢子体诱导阶段最佳方案为以
河沙为基质的不完全组织培养相吻合。这可能因为
沙比腐殖土具有更大的孔隙度，在较大的孔隙度之
间存在更多流动的水，更利于精子传播。这意味着
在孢子体诱导过程中受外界提供营养影响比较小，
甚至是不需要外界提供营养，而流动水的含量对此
具有至关重要的影响。但是在孢子体后期生长阶
段，在腐殖土中的孢子体生长势比沙中的更优。
徐惠珠等报道荷叶铁线蕨播种密度对配子体的
生长势有影响，这可能会对后期孢子体的形成有一
定的影响。本实验发现配子体栽培密度不超过3株
每平方厘米的情况下，密度越大孢子体的形成时间
越早，这可能是在一定密度范围之内配子体密度高，
精子到达颈卵器所需时间更短、几率可能会更大，更
易受精，同时较高的培养密度可以促进精子器的形
成-2¨。当然不同蕨类植物的交配系统和性别分化
有关，特别是同型孢子蕨的配子体的性别分化受密
度影响很大，在不同密度条件下配子体生长会形成
竞争，进而会发育成具有多种精子器和颈卵器的配
比。当然影响性别比例的因素很多，成精子囊素和
密度一样是影响蕨类植物性别表达的重要因素之
一
，同型孢子蕨的配子体中大多能产生成精子囊
素，孢子萌发后生长较快的形成雌配子体并分泌成
精子囊素，而生长较慢的则在成精子囊素的影响下
形成雄配子体。荷叶铁线蕨性别表达差异的影响因
素和配子体种植密度的不同如何引起性别比例差异
从而影响孢子体形成值得进一步探讨。
参考文献 ：
[1] Ⅱ0yd R M，Klekowski E J jr．Spore germination and viability in
Pteridophyta：evolutionary significance of chlorophyllous spores
[J]．Biotropica，1970，2(2)：129—137．
[2] 秦仁昌，邢公侠．中国植物志(第 3卷 ，第 1分册)[M]．北京：
科学出版社。1990．178．
[3] 林尤兴．中国铁线蕨属的新分类[J]．植物分类学报，1980。
l8(1)：1O1—105．
[4] 陈卓良，金义兴，郑重，王诗云．珍稀植物荷叶铁线蕨的生境及
维普资讯 http://www.cqvip.com
第2期 潘 利等：荷叶铁线蕨孢子的不同贮藏时间与培养条件对配子体和孢子体形成的影响 177
[5]
[6]
[7]
[8]
【9]
[10]
[12]
[13]
[14]
其引种栽培环境研究[A]．见：中国植物学会植物园协会编．
植物引种驯化集刊(第 7集)[C]．北京：科学出版社，1990．
129—136．
周涛，朴永吉，林元雪．中国野生花卉资源的研究现状及展望
【J]．世界林业研究，2004，x7(4)，45—48．
康明．三种濒危植物的保育遗传研究[D]．武汉：中国科学院
武汉植物园，2006．7．
谢宗强．三峡工程对库区特有濒危植物荷叶铁线蕨的影响与
对策[J]．生物多样性，1993，1(1)：16—18．
曾建红，彭正松．三峡库区珍稀濒危植物荷叶铁线蕨的生物学
特性及保护对策[J]．中国野生资源，2002，21(5)．34—36．
徐惠珠 ，金义兴，江明喜，吴金清．三峡库区珍稀特有植物荷
叶铁线蕨的孢子繁殖[J]．长江流域资源与环境，1998，7(3)：
237—241．
国家烟草专卖局．烟草病害分级及调查方法[s]．中国标准：
YC／T 39—1996，1996—4—3．
季华．铁线蕨属植物的组织培养【D]．武汉 ：华中农业大学，
2O0o．7．
李春喜，王文林等．生物统计学 [M]．北京：科学出版社 ，
1998．
Nayar B K，Kaur S．Gametophytes of homosporous ferns[J]．
The Botan／calRed~w，1971，37(3)：295—396．
Simabukuro EA ，DyerA F ，FelippeG M．Thed~cct of sterili-
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
[2O]
[21]
[22]
zation and storage conditions on the viability of the spores of
Cyathea ddgad~i[J]．Am Fern J，1998，88(2)：72—80．
~intanla L G，Amigo J，Pangua E，Pajam S．Efect of storage
method on spore viability in five Oob~Uy threatened fern species
[J]．Annals ofBotany，2002，90：461—467．
包文美，敖志文，刘保东．东北蕨类配子体发育的研究 Ⅳ．铁
线蕨属[J]．植物研究 ，1987，7(4)：63—7O．
周玲革．铁线蕨孢子培养方法的研究[J]．荆州师专学报(自
然科学版)，1996，19(5)：81—84．
史红文，黄汉东，江明喜，金霞．三峡地区特有植物荷叶铁线
蕨的群落特征及其保护对策[J]．武汉植物学研究，2005，23
(3)：262—266．
鲍敏，吴学明，丁莉．蔗糖和生长辅助物质对蕨孢子人工繁殖
的影响[J]．青海师范大学学报(自然科学版)，2002，3：39—
43．
Shefield E，Douglas G E，Heame S J，Huxham S，Wynn J M．
Enhancement of fern spore germination and gametophyte growth in
artifcial media[J]．Am Fern_，，2001，91(4)179—186．
Raghav~rl V．Developmental Biology of Fern Gametophytes[D]．
Cambridge：Cambridge Univ．1 989．203—226．
刘建武，刘宁．蕨类植物配子体发育及其性器官分化的研究
进展【J]．植物学通报，2001，is(2)：149—157．
维普资讯 http://www.cqvip.com