全 文 ：武汉植物学研究 2000, 18( 4) : 347～350
Journal of Wuhan Botanical Research
荷叶铁线蕨等位酶分析初步研究

王传华　黄宏文

　许天全　吴金清　郎　萍
(中国科学院武汉植物研究所　武汉　430074)
A PRELIMINARY STUDY ON ISOZYME ANALYSIS IN
ADIANTUM RENIFORME VAR. SINENSE
Wang Chuanhua　Huang Hongw en　Xu T ianquan　Wu Jinqing　Lang Ping
( Wuhan I nst itute of Botany, T he Ch inese A cad emy of S cienc es　Wuhan　430074)
关键词　荷叶铁线蕨, 凝胶电泳,等位酶分析
Key words　A diantum r enif orme var . sinens e, Gel electr ophor esis, Iso zyme analy sis
中图分类号: Q949. 36; Q347　文献标识码: A　文章编号: 1000-470X ( 2000) 04-0347-04
荷叶铁线蕨( Adiantum r enif orme var . sinense)是铁线蕨科铁线蕨属肾叶铁线蕨的一个变种〔1〕,分布
于重庆市万县、石柱等县的沿江近 100 km 长的狭长地段, 分布高度局限于海拔 80～430 m 之间〔2〕。受其
自身生物学、生态学习性的局限和人为的破坏, 该物种正濒于灭绝的边缘。三峡工程修建后, 库区内
175 m线以下的地区将被淹没,将更加剧该物种的濒危程度。为了挽救这一物种已经采取了许多措施,迁
地保护是其中的重要措施之一, 中国科学院武汉植物研究所在这一方面已经做了一些工作〔3～5〕。为了有
效地实施迁地保护, 保存该物种的大部分遗传基础, 就必须制定科学的取样策略, 因而对其野生居群及
已迁地保护居群的遗传多样性进行评价就显得十分重要。等位酶分析是研究物种遗传多样性的有效手
段之一, 有关荷叶铁线蕨同工酶方面的资料尚未见到。本实验运用超薄平板聚丙烯酰胺凝胶电泳技
术〔6〕, 对荷叶铁线蕨等位酶研究中的提取液, 取样部位及可供遗传分析的酶系统及等位酶位点进行了筛
选, 为进一步的工作奠定了基础,现简报如下。
1　材料
样本随机取自中国科学院武汉植物研究所三峡组迁地保存的不同荷叶铁线蕨植株,株龄约 2 年,取
样时间为 1998 年 12 月至 1999年 1月。
2　方法
2. 1　电泳系统
采用黄宏文改进的 Mulcahy 等的超薄平板聚丙烯酰胺等电聚焦系统( IEF-PAGE ) 〔6〕, 该系统具有
操作简单、高分辨率、高效率、低耗材的特点。
( 1) 凝胶配方: Acr ylamide—N-N′-Met hy lenebis Acrylamide 180
L〔( 4. 75 g Acr + 0. 25 g Bis) /




通讯作者。
收稿日: 1999-03-09,修回日: 1999-11-24。第一作者:男, 1974年生,硕士,从事植物学研究。
中国科学院生物分类与区系学科发展特别支持费资助项目,中国科学院生物科学与技术研究特别支持费(财政
部专项)资助项目及国务院三峡建设委员会办公室和长江三峡开发总公司“九五”科研攻关项目的部分内容。
10 mL H2O〕, T EMED 30
L ( 0. 20 mL TEMED/ 10 mL H2O) ,过硫酸铵 180
L ( 0. 025 g / 10 mL H2O) ,
两性电解质( pH3. 5～10) 90
L, H2O 750
L。
( 2) 制胶用品: A . GelBond 膜; B. 塑料间隔条 (厚度约 0. 3 mm ) ; C. 玻璃平板 (大小为 75 mm×
50 mm×1 mm ) , 其处理方法是, 先在 500 mL 蒸馏水中加入柠檬酸, 调 pH 值至 3. 5, 再加入 3 mL
Silane A 17, 搅拌 30 min, 然后将玻璃片放入其中浸泡 0. 5 h, 捞起,用蒸馏水冲洗 3次, 室温下阴干备用。
( 3) 注胶:把 GelBond 膜放在玻璃板或其它平面上 (疏水面向上) , 再把两条塑料间隔条平行放置在
膜上, 相距约 40 mm ,然后将处理过的疏水玻璃平板放在间隔条上, 玻璃板和膜间的空隙(高约 0. 3 mm)
用于灌注凝胶。灌胶时用滴管灌胶, 要防止气泡产生。凝胶聚合时间约 20 min。
2. 2　制样
提取缓冲液的筛选: 提取缓冲液 5 种, 1、2、3、4 号配方参见王中仁〔7〕1、2、3、4号配方; 5号提取液为
Soltis 配方三〔8〕。
取样部位: A . 成熟叶, B. 展开嫩叶(浅黄色) , C. 未展开嫩叶, D. 幼嫩茎(未木质化) , E. 老茎, F . 根,
G .配子体。
研磨样品时, 加入样品 150～200 mg ,再加入提取液 200
L, 冰镇研磨。研磨液在 5 000 r / m in 下离
心 5 min 后, 在冷冻状态下保存。
2. 3　电泳
( 1) 上样: 在低温状态下 (胶下放冰) ,用 1 mm2 的Watman 3 号滤纸制作的纸芯子吸取上清液(酶
液) ,加在距阳极 3～4 mm 处,样品间距约 1 mm, 每块胶可上 25个样。
( 2) 电泳:电泳槽用一塑料槽代替,最下层放冰袋, 冰袋上再放置一纤维海绵布,其上放一块玻璃板
并使其水平, 然后将防滑的橡胶垫放在玻璃板上, 最后将上过样的凝胶玻璃板放在橡胶垫上。电泳前先
将两条 8 mm×70 mm 的滤纸条紧贴凝胶的较长的两条边, 然后吸取正极( pH3. 5)、负极( pH10)缓冲液
润湿滤纸条, 确保电极丝浸在电极缓冲液中。除 AAT 外, 样品均从正极向负极电泳,电压控制为 50 V、
100 V、200 V、300 V、400 V 各 15 m in。
2. 4　染色
除 PGI外一律用液染。配方参见 So ltis〔8〕, 用量减半。分别染 ACP ( 酸性磷酸酶 E. C. 3. 1. 3. 2)、
AMP(氨基肽酶 E. C. 3. 4. 11. 1)、AAT (天冬氨酸 E. C. 2. 6. 1. 1) 、ADH(乙醇脱氢酶 E. C. 1. 1. 1. 1)、
DIA (还原型辅酶Ⅰ心肌黄酶 E. C. 1. 6. 2. 2)、EST (酯酶 E. C. 3. 1. 1. -)、FBA (果糖二磷酸醛缩酶 E. C.
4. 1. 2. 3. ) 、FBP(果糖二磷酸酶 E. C. 3. 1. 3. 11)、G6PD ( 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 E. C. 1. 1. 1. 49)、PGI ( 6-
磷酸葡萄糖异构酶 E. C. 3. 2. 1. 21)、GDH(谷氨酸脱氢酶 E. C. 1. 4. 1. 2)、G3PD(甘油醛-3-磷酸脱氢酶
E. C. 1. 2. 1. 12) 、HK(己糖激酶 E. C. 2. 7. 1. 1)、IDH(异柠檬酸脱氢酶 E. C. 1. 1. 1. 42)、M DH(苹果酸脱
氢酶 E. C. 1. 1. 1. 37)、ME 苹果酸酶 E. C. 1. 1. 1. 40)、PRX(过氧化物酶 E. C. 1. 11. 1. 7)、PGM(磷酸葡
萄糖变位酶 E. C. 5. 4. 2. 2)、PGD( 6-磷酸葡萄糖脱氢酶 E. C. 1. 1. 1. 44)、SKD(莽草酸脱氢酶 E. C. 1. 1.
1. 25) 20 种酶系统。
3　结果与分析
3. 1　提取缓冲液及制样部位的筛选
结果表明: 2、3、5提取液均能用于制备样品,以 5 号最佳, 2 号其次, 3号再次。但是 2号不能久置 , 1
号、4号效果差。所有参试的酶类中 , DIA 2 号优于 5 号;对于 M DH、ACP、PGI、G6PD、AAT , 5 号优于 2
号; EST 5 号与 2 号相当。
各取样部位表达的酶系统及其活性差异显著, 其中以老叶为部位制样后经电泳所得到的酶谱最清
晰, 可供遗传学分析,其它部位制样或酶带较淡或位点不够多或完全不显带,不宜选为制样部位。
3. 2　等位酶位点的确定
( 1) 同工酶系统的筛选: 在前述的 20 种酶系统中, MDH、EST、DIA、ACP、PGM 可以得到较清晰的
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酶谱供遗传学分析, PGI 酶带色较浅, AAT、G6PD、PRX 显模糊带,其它酶系统不显带。
( 2) 等位酶位点的确定:由于荷叶铁线蕨等位酶分析方面的资料尚无报道,等位酶位点的确定是根
据荷叶铁线蕨染色体的倍性( 2n= 120) 〔9〕、各酶类的亚基数目, 以及基因型与酶谱表型的对应关系,同时
参照了其他物种等位酶位点确定的方法加以确定的〔7〕。等位酶位点的记录,以阿拉伯数字 1、2、3⋯⋯表
示某一酶类位点的顺序, 用英文小写字母 a、b、c、d⋯⋯表示同一位点的等位基因。荷叶铁线蕨等位酶共
有 5 个酶系统可供遗传学分析, 具体分带结果见图 1。
图 1　荷叶铁线蕨 5种等位酶的位点及等位基因区分图
(图片上端为阳极,制样用 5号提取液,样本为不同荷叶铁线蕨个体的成熟叶片)
Fig. 1　Allele and locu s des ignat ion in five enzym es in A diantum renif or me var. sinense( Anode is tow ar d the top;
each sample is made by m ature leaf of d iff erent A diantum renif or me var. sinense individual, w ith No. 5 ex tract ion)
　
酸性磷酸酶 ACP : 单体酶,有 4 个位点表达,第 1 个位点 2个等位基因, 由于聚焦于低 pH 端, 有时
分辨率不高; 第 2 位点酶谱清晰; 2 个等位基因; 第 3、4位点酶谱清晰, 1 个等位基因。
苹果酸脱氢酶 M DH:二聚体酶, 受 9 个位点控制。第 1 位点酶谱清晰, 2 个等位基因;第 2、5个位点
酶谱清晰, 1个等位基因; 第 3、4、6、7、9 位点酶谱不清晰。
酯酶 EST :单体酶, 有 8 个位点表达,其中第 1、4、5、6、7、8 位点酶谱清晰;第 2、3 位点显带稍弱。第
2、6 位点各有两个等位基因;第 1、3、4、5、7、8 位点各只有 1 个等位基因。
还原型辅酶 I 心肌黄酶 DIA : 单体酶,有 5 个位点表达,第 1、2、3 位点显弱带,第 4、5 位点酶谱清晰。
第 1、3 位点 1 个等位基因; 第 2、4、5位点 2个等位基因。
磷酸葡萄糖变位酶 PGM :单体酶, 有 3 个位点表达。第 1 个位点做的情况好才显带; 受 2 个等位基
因控制; 第 2 个位点谱带清晰, 2 个等位基因; 第 3位点谱带清晰, 1 个等位基因。
4　讨论
根据实验的结果, 荷叶铁线蕨不同制样部位表达的同工酶位点及其活性差异显著。由于等位酶具有
在细胞液、质体、线粒体、微粒体等亚细胞结构中分室表达的特点〔7〕, 在某些部位表达的酶在其它部位不
一定表达, 因而根据一组特殊位点的酶带来确定某种酶的亚基数目具有特别的意义。本实验中含有叶绿
体的部位(如老叶)在某些酶类(如 MDH、DIA、EST )中就表达出一些特殊的酶带,这为位点的确定及进
349　第 4期　　　　　　　　　　　　王传华等:荷叶铁线蕨等位酶分析初步研究
一步的遗传学分析提供了便利。
在等位酶的研究中,个别酶系统其酶谱分布于 pH 值阳极端, 分辨率不高, 因此,对这些酶系统电泳
时所需要的恰当的两性电解质有进一步实验的必要,比如选用 pH 范围 3. 5～5. 5 或 4～6 的两性电解
质, 以提高分辨率。
荷叶铁线蕨是一种三峡库区特有的珍稀濒危植物, 总种群数量有限。随着人类对大自然了解的深
入, 对荷叶铁线蕨的研究也得到了逐步的开展。1980 年,林尤兴将其作为一个变种发表〔1〕,许天全等对其
野外分布状况进行了调查〔2〕,陈卓良等对其进行了引种栽培实验〔3〕, 徐惠珠等对其孢子繁殖进行了研
究〔4〕; 在细胞生物学方面, 林尤兴报道了该物种的染色体数目 ( 2n= 120) 〔9〕, 这些工作为荷叶铁线蕨以等
位酶为手段进行遗传学分析及进一步迁地保护工作奠定了基础。因此,根据现有的资料及实验手段,对
荷叶铁线蕨现存的野外分布状况及其遗传多样性水平进行评价, 并在此基础上提出能涵盖该物种的大
部分遗传基础的取样策略, 真正从居群水平上实现对一个濒危物种的迁地保存,是一项切实可行而又富
有意义的工作。
参　考　文　献
1　林尤兴.中国铁线蕨属的新分类群.植物分类学报, 1980, 18( 1) : 101～105
2　许天全,郑重,金义兴.论荷叶铁线蕨的分布特点.武汉植物学研究, 1987, 5( 3) : 247～251
3　陈卓良,金义兴,郑重等.珍稀植物荷叶铁线蕨的生境及其引种栽培环境研究.植物引种驯化集刊(第 7集) .北京:
科学出版社, 1990. 129～136
4　徐惠珠, 金义兴,江明喜等.三峡库区珍稀特有植物荷叶铁线蕨的孢子繁殖.长江流域资源与环境, 1998, 7( 3) :
237～241
5　郑重.长江三峡库区种子植物的中国特有分布.武汉植物学研究, 1994, 12( 4) : 341～347
6　黄宏文.超薄平板微型聚丙烯酰胺凝胶的等电聚焦电泳方法——介绍一种高效、快速的生物同工酶分析方法.武汉
植物学研究, 2000, 18( 3) : 224～228
7　王中仁.植物等位酶分析.北京:科学出版社, 1994.
8　Solt is . Isoz yme in Plan t Biology. Port land: Dios corides Pres s, 1989.
9　Lin Y X. Th e sexual propagat ion and ch romosome number of A d iantum r enif orme L. var. Y. X. L in. Cathaya, 1989
( 1) : 143～148
《植物遗传资源科学》简介
《植物遗传资源科学》是中国农业科学院作物品种资源研究所和中国农学会遗传资源
分会联合主办的专业性学术期刊, 由中国工程院院士董玉琛研究员担任主编, 2000年创
刊。主要发表植物遗传资源研究报告,介绍研究成果和学科进展,进行学术交流,提供可供
遗传育种和农业生产利用的优异资源以及国外有关研究信息。
读者对象: 从事植物遗传资源科学研究工作的人员, 各有关大专院校的师生, 农业行
政和推广人员。季刊, 16开本, 64页。准印证号:京内资准字 99-L0722。每期收工本邮寄
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