全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 469
簸箕柳AP3同源基因 SsMADS的克隆与特性分析
陈英，关亚丽，程强，曹友志，黄敏仁 *
南京林业大学林木遗传和基因工程重点实验室，南京 210037
提要：用 cDNA末端快速扩增(rapid-amplification of cDNA ends，RACE)方法从簸箕柳雄花序中克隆了一个 AP3同源基
因的 cDNA，长 826 bp，包括完整的编码区、5-UTR和 3-UTR，并将其相应的基因命名为 SsMADS。该基因由 7个外显
子和6个内含子组成，编码区长723 bp，编码241个氨基酸，其N-端具有典型的MADS保守结构域。序列分析表明，SsMADS
编码的氨基酸序列与毛果杨(Populus trichocarp) AP3同源蛋白有 95.7%相似性，与其他几种柳属植物的AP3同源蛋白相
似性达 96.1%~99.6%。实时定量RT-PCR表明，SsMADS在叶、茎和根中表达量极低，在花序中表达量较高，并且其表达
量在花器官的早中期发育阶段逐步提高，说明该基因在簸箕柳花器官的发育中起作用。
关键词：簸箕柳；SsMADS；AP3；实时定量 RT-PCR；系统进化树分析
Cloning and Character Analysis of Salix suchowensis AP3 Homologue Gene
SsMADS
CHEN Ying, GUAN Ya-Li, CHENG Qiang, CAO You-Zhi, HUANG Min-Ren*
Key Laboratory of Forest Genetics and Gene Engineering, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China
Abstract: A new AP3 homologue gene cDNA, named SsMADS was cloned by RACE method from male
inflorescence of Salix suchowensis, it has 7 extrons and 6 introns. The full length cDNA of SsMADS is 826 bp
long, including the whole coding region and 5-UTR and 3-UTR. The coding region of 732 bp codes for a
polypeptide of 241 amino acids, containing a typical MADS-conserved domain in N-ends. Its amino acid
sequence shows 95.7% identity to that of Populus trichocarp AP3 homologue gene PTD, and 96.1%–99.6%
identity to the proteins of Salix AP3 homologue genes. Its expression quantity is very low in leaf, shoot and
root, but very high in inflorescence as demonstrated by real-time quantitative RT-PCR analysis, and the quantity
increases at the early and middle development stages of floral organs but decreases at the late stage. The above
results indicate that SsMADS plays a very important role in the floral organ development of Salix suchowensis.
Key words: Salix suchowensis; SsMADS; AP3; real-time quantitative RT-PCR; phylogenetic tree analysis
收稿 2007-04-06 修定 　2007-05-14
资助 国家自然科学基金(30 4 71 4 0 6)。
* 通讯作者(E-mail：mrhuang@njfu .com.cn；Tel：025-
8 5 4 2 7 4 1 2 )。
开花是高等植物个体发育过程的中心环节。
植物的花发育是环境信号与植物内在的遗传机制共
同作用的结果。有人认为，许多基因的相互作用
构成一个复杂的网络调控系统，共同调控植物的
花发育过程(Levy和Dean 1998)。在花发育的遗传
网络中，花器官特征基因(floral organ identity gene)
决定花器官，即花器官原基发育成萼片、花瓣、
雄蕊和心皮。当内外条件达到协调时，开花基因
就会启动花分生组织特征基因，使植物从营养生
长转变到生殖生长；接着，花器官特征基因开始
表达，并激活其下游基因，从而形成不同的花器
官。
花发育的ABC/ABCDE/四聚体模型显示，花器
官特征基因决定花器官的机制(Coen和Meyerowitz
1991；Theissen 2001；Jack 2004)。植物花器官
发育Ｂ类基因包括 APETALA3 (AP3)/DEFICIENS
(DEF)和 PISTILLATA (PI)/GLOBOSA (GLO)，控
制双子叶植物花瓣和雄蕊的发育，它们属于
MADS-box基因家族，编码转录因子，这些基因
的突变能导致花瓣转变为萼片，雄蕊转变为心皮
(Krizek和Meyerowitz 1996)。近年来有关植物花
发育Ｂ类基因的基因克隆、基因表达和转基因研
究取得了重要的进展，但多限于一些草本模式植
物，在木本植物中的研究很少。
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由于杨树全基因组序列的公布( Tuska n 等
2006)，杨树成为木本植物研究领域的模式物种。
但杨树一般需 6~8年才能开花，研究其花发育难
度很大。而与其同属杨柳科(Salicaceae)的柳属
(Salix)植物中，灌木柳(如簸箕柳)无论是实生苗还
是扦插苗一年即可开花，是研究木本植物开花机
制不可多得的理想材料。柳树每一花序含有许多
独立的花原基，继而发育为单性花，雌雄异株。
通常大部分开单性花的植物在花器官形成早期，
均具有两性组织，但在花发育的过程中其中一种
性器官发育停止，从而形成单性花。而柳树在花
原基起始阶段就是真正意义上的单性花。因此，
柳树花器官仅含两轮，高度缩小的花被包被雄蕊
或心皮。
本文从簸箕柳雄株花序中分离和克隆了柳树
A P3 同源基因，并对该基因的表达特征作了分
析，从理论上对林木花器官形成发育机制研究作
了补充，还为建立适用于林木花器官发育生物学
研究的模式植物系统作了初步探索。
材料与方法
植物材料为簸箕柳(Salix suchowensis)，取自
本校杨树育种圃，春季取雄株幼叶用于提取基因
组 DNA。春季枝条萌发出根、叶和花序时，分
别取样。根据出现花序后时间点，分别取不同发
育时期的花序，液氮速冻，−70 ℃下保存备用。
RNA分离用 RNeasy plant mini kit (Quagene)，
分别从不同发育时期的花序、叶、幼茎和根等器
官提取 RNA。按Murray和 Thompson (1980)的方
法用 CTAB法提取总DNA。
根据毛果杨AP3同源基因(PTD)的核酸序列，
设计合成了 5端引物 P1 (5-TTG GAT CCA TGG
GTC GTG GAA AGA-3)和 3端引物 P2 (5-AAG
AGC TCT CAA GGA AGG CGA AGT T-3)，以簸
箕柳基因组DNA为模板，用以上引物进行PCR扩
增。20 µL PCR反应混合物含有：2 µL的 10×PCR
缓冲液，2 µL的 dNTP (2 mmol·L-1)，1.2 µL的
MgCl2 (25 mmol·L-1)，10 pmol 5端引物，10 pmol
3端引物，2 µL簸箕柳基因组DNA，1 U Taq酶
(TaKaRa)，32个循环 PCR产物用 1%琼脂糖电泳
分离。切胶回收(优晶生物)，连接于 pMD19T-
simple (宝生物)载体上，测序(lnvitrogen)。
SsMADS全长 cDNA的克隆用花序总RNA为
材料，使用 RT-PCR第一链合成系统(first-strand
synthesis system for RT-PCR，invitrogen)进行寡
聚脱氧胸腺嘧啶Oligo (dT)12-18反转录 cDNA第一
链。根据 SsMADS的基因组预测外显子序列合成
特异引物 5 SsMADS outer (GTC TCG GAG ATG
GAT ATG GC)、5 SsMADS inner (CTT CTT CCT
GCA GGT GTC GTT)、3 SsMADS outer (ATC
TCA ATC TTT CCA CGA CCC)和3 SsMADS inner
(CCG CCA ACC TCT TTG CAT TCC)，采用基于
RNA连接酶的cDNA末端快速扩增法试剂盒(RLM-
RACE kit，Ambion)进行 SsMADS cDNA的 5和 3
端序列快速扩增，并进行序列拼接。再根据拼接
结果设计扩增 SsMADS cDNA全长的引物：fulll-
length-F (TAGCTAGCGCTACAGCTTTCACAA)；
fulll-length-R (CCCAGGCGCCTCTTAGATTA-
TTA A)。扩增产物切胶回收、连接、测序。
SsMADS的表达分析时，根据 SsMADS的
cDNA序列合成特异引物P3 (5-CCG CCA ACC TCT
TTG CAT TCC-3)和 P4 (5-GCC ATA TCC ATC
TCC GAG ACA A-3)，以簸箕柳泛素类似物基因
(ubiquitin-like，UBQ-L)做对照，用不同发育时期
的花序、嫩茎、根和叶的总 RNA，在ABI 7500
实时定量 PCR仪上进行 RT-PCR。20 µL的 PCR
反应混合物含 3 mL第 1链 cDNA，10 µL的 2×绿
色荧光染料PCR反应混合物(SYBR Green PCR Mas-
ter Mix)，P3引物 10 pmol，P4引物 10 pmol，
去离子水 4.6 µL。PCR反应条件为 50 ℃ 2 min，
95 ℃ 10 min，后 40个循环为 95 ℃ 15 s，60 ℃
1 min，同时每对引物设无模板对照(NTC)，每个
反应扩增效率采用 Ramakers等(2003)提出的方法
计算(LinRegPCR软件)。
根据 SsMADS序列，设计引物，以垂柳(S.
babylonica L.)、黄花柳(S. caprea L.)、黄枝白柳
(S. alba var. vitellina)、杞柳(S. integra Thunb.)、
绵毛柳(S. erioclada)基因组 DNA为模板，进行
PCR扩增，测序。根据获得的簸箕柳 cDNA全长
序列及其剪切规律，以及得到的垂柳、黄花柳、
黄枝白柳、杞柳、绵毛柳等的 DNA序列，预测
得到了 5 种柳树的全长 c D N A 序列，然后用
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softberry软件预测各个 cDNA编码的氨基酸。使
用EMBL-EBI中的Align程序，对柳属植物AP3同
源基因进行 cDNA和氨基酸同源序列比对分析。
运用DNAMAN软件对簸箕柳 AP3同源基因
SsMADS编码的氨基酸序列与其他植物AP3同源基
因的氨基酸序列作同源性比较。系统进化树分析
(phylogenetic tree analysis)采用 Phylip 3.64软件包，
邻位相连法(neighbor-joining)，并进行 1 000次抽
样置换检测。
实验结果
1 柳树AP3同源基因 SsMADS基因的分离和克隆
根据毛果杨AP3同源基因(PTD)的核酸序列设
计引物，以簸箕柳雄株基因组总DNA为模板进行
PCR 扩增，获得了与预期产物大小相一致的片
段，测序分析，SsMADS基因组序列全长为 2 133
bp。
根据 SsMADS基因序列设计 RACE引物，使
用RLM-RACE方法对簸箕柳AP3同源基因进行5
和 3端扩增，实验结果显示 5和 3RACE均能扩
增出特异性条带(图 1)。
将特异性条带切胶回收纯化，克隆到 T载体
上，测序，序列拼接后获得簸箕柳 AP3同源基因
的全长 cDNA序列。并采用 SsMADS cDNA全长
引物扩增得到其全长 cDNA序列，长 826 bp，编
码 241个氨基酸，预测分子量大小为 28 kDa。将
SsMADS基因组序列与cDNA序列通过http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/IEB/ Research/Ostell/Spidey/进行分
析比较，结果(图 2)表明，该基因包含 7个外显
子和 6 个内含子。
通过 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/
lexington/lexington.cgi?cmd=rps蛋白结构域预测工
具，发现SsMADS在N末端具有MADS-box和K-
box保守结构域(图 3)。进一步分析表明，簸箕柳
AP3同源基因编码的氨基酸序列同毛果杨AP3蛋
白具有 95.7%相似性，可见该基因在杨属植物和
柳属植物之间具有极高的保守性。
2 SsMADS的表达分析
采用UBQ-L基因作为内对照基因，进行实时
定量 RT-PCR分析，研究 SsMADS基因主要在簸
箕柳不同发育阶段的花器官以及在根、茎、叶中
表达模式。结果(图 4)表明，SsMADS基因不同组
织的相对表达量有明显差别，在花器官中的表达
量随着花器官的发育而提高，在 2~3 cm花序期时
达到最大，其相对表达量是 0.5~1 cm花序期的 2
倍多(2.27:1.00)。而到了>3 cm花序期，SsMADS
基因的相对表达量又有所下降(1.29)。说明随着花
器官的成熟，该基因的表达量会有所下降。在
叶、茎和根中，SsMADS基因的相对表达量非常
低，均不到 0.01。花器官发育早期(0.5~1 cm花
序期)中的表达量是其 100多倍，在花器官中表达
量最大时可以达到其 200多倍(2.27:0.01)。该结果
表明 SsMADS基因在花器官中是特异表达的，对
于花器官的形成具有重要作用。
3 柳属植物AP3同源基因全长 cDNA克隆与分析
根据获得的簸箕柳 cDNA全长序列及其剪切
规律，以及测序得到的垂柳、黄花柳、黄枝白
图 2 SsMADS基因结构
Fig.2 The frame of SsMADS
图中方块表示外显子、粗线条表示内含子，数字的单位是 bp。
图 1 5RACE和 3RACE扩增图谱
Fig.1 The results of 5RACE and 3RACE
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柳、杞柳、绵毛柳等的 DNA序列，预测得到了
5种柳树的全长 cDNA序列，分别用 SbMADS、
ScMADS、SaMADS、SiMADS和 SeMADS表示，
然后使用 Softberry软件预测各个 cDNA编码的氨
基酸。
使用EMBL-EBI中的Align程序，对柳属植物
AP3同源基因进行cDNA和氨基酸同源序列比对分
析，结果表明，柳属不同物种中的 AP3同源基因
在核苷酸水平和氨基酸水平均有很高的相似性，
其中核苷酸水平的相似性为95% (黄枝白柳和黄花
柳之间)~98.7% (簸箕柳和杞柳之间) (表 1)，氨基
酸水平的相似性为95.2% (黄枝白柳和绒毛柳之间)
~99.6% (簸箕柳和杞柳之间) (表 2)。
4 系统进化树分析
用DNAMAN软件比较簸箕柳 AP3同源基因
SsMADS编码的氨基酸序列与其他植物AP3同源基
因的氨基酸序列作同源性的结果表明，簸箕柳与
毛果杨(Populus trichocarpa，AF057708) AP3同
源基因编码的氨基酸序列有 95.7%同源性，而与
苹果(Malus domestica，AJ251116)、玫瑰(Rosa
rugosa，AB055966)、百合(Lilium regale，AF503913)、
矮牵牛(Petunia hybrida，AF230704)、大丁草
(Gerbera hybrida，AJ009724)、郁金香(Tulipa
gesneriana，AB094966)、萱草(Hemerocallis
hybrid，AF209729)和向日葵(Helianthus annuus，
AY173070)的同源性则分别为50.4%、49.2%、46.8%、
76.1%、51%、43.2%、47.4% 和 45%。
采用 Clustal X软件比较分析分别来自簸箕
柳、毛果杨、苹果、玫瑰、大丁草、矮牵牛、
百合、郁金香、拟南芥、向日葵和萱草的 A P3
同源基因的氨基酸序列的结果表明，来自不同植
物的 AP3同源基因其编码的氨基酸序列在近 5端
图 3 SsMADS结构分析
Fig.3 The analysis of structure of SsMADS
图 4 实时定量RT-PCR技术对簸箕柳 SsMADS的表达分析
Fig.4 Expression analysis of SsMADS by real-time RT-PCR
1：0.5~ 1 cm 大小的花序；2：1~ 2 cm 大小的花序；3：
2 ~ 3 c m 大小的花序；4：> 3 c m 大小的花序；5：叶；6：
茎 ； 7 ： 根 。
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有较高的同源性，而该区域属于高等植物非常保
守的MADS-box基序(motif)，是转录因子的一个
重要特征。因此，推测本研究获得的簸箕柳 AP3
同源基因可能具有转录因子的功能。
图5为采用Phylip 3.64软件包构建的以上几种
植物 AP3同源基因系统进化树。来自菊科的大丁
草和向日葵聚成一类，蔷薇科的玫瑰和苹果聚成
一类，百合科的郁金香和百合聚成一类，簸箕柳
等 6 种柳树与杨属的毛果杨聚成一类。结果表
明，以 AP3同源基因序列为基础构建的进化树，
与传统的植物学分类基本吻合。因此认为，基于
同源序列比对所构建的系统进化树能够比较准确地
反映物种之间的亲缘关系。
讨 论
AP3/DEF和 PI/GLO基因编码的蛋白质形成
异二聚体，为多种植物花瓣和雄蕊发育所必需。
AP3基因表达的调节分两步：AP3最初表达是由
花分生组织基因(AP1、LFY、UFO)诱导的。AP3
的表达起始后，这些基因编码蛋白质可以自动调
节维持其自身基因在花瓣和雄蕊中的表达。AP3
启动子能够由AP3类固醇诱导形式激活，这种激
活可能是由 AP3启动子中的 2个CArGbox调节的
(Honma和 Goto 2000，2001)。AP3可直接调节
NAP (NAC-LIKE，ACTIVATED BY AP3/PI)基因，
NAP在花发育后期表达，在发育中的花瓣和雄蕊
中表达，其表达与花瓣和雄蕊组织由细胞分裂到
细胞体积增大的转变有关(Sablowski和Meyerowitz
1998)。微阵列技术研究表明，AP3/PI直接调节
负责花瓣和雄蕊细胞形成过程中的基因(Zik和Irish
2003)。
拟南芥 AP3在花瓣和雄蕊整个发育过程中均
表达，但在非花组织中不表达(Serrano-Cartagena
等 2000)。而在玉米中AP3基因在种子、叶片和根
中均表达(Munster等 2001；Yu等 1999；Southerton
等 1998)。Skipper (2002)利用原位 PCR技术发现
冬乌头(Eranthis hyemalis)中Ｂ类基因在发育中的块
茎组织的维管束、花梗、胚原基中均有表达，
在茎和叶片中也发现有 AP3 基因的表达。桉树
(Eucalyptus)、挪威云杉(Picea abies)等几个植物中
也有研究报道MADS-box基因在维管组织中表达
(Decroocq 1999；Sundström等 1999)。本文结果
表 2 柳属植物 AP3同源基因氨基酸序列的相似性比较
Table 2 Comparison on similarity of amino acids sequences in homologous AP3 gene from Salix
基因 SbMADS ScMADS SaMADS SsMADS SiMADS SeMADS
SbMADS ** * 96.1 97.4 97.0 97.4 95.7
ScMADS − ** * 95.3 97.8 97.8 97.8
SaMADS − − ** * 96.1 96.5 95.2
SsMADS − − − ** * 99.6 98.3
SiMADS − − − − ** * 98.3
SeMADS − − − − − ** *
表中数字为氨基酸相似百分比。
表 1 柳属植物 AP3同源基因 cDNA序列的相似性比较
Table 1 Comparison on similarity of cDNA sequences in homologous AP3 gene from Salix
基因 SbMADS ScMADS SaMADS SsMADS SiMADS SeMADS
SbMADS ** * 95.6 98.2 97.4 97.5 96.4
ScMADS − ** * 95.0 97.1 96.9 97.1
SaMADS − − ** * 96.5 96.7 95.3
SsMADS − − − ** * 98.7 98.0
SiMADS − − − − ** * 97.7
SeMADS − − − − − ** *
表中数字为核苷酸相似百分比。
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月474
表明，SsMADS基因在不同组织的相对表达量有
明显差别，说明 SsMADS基因在簸箕柳花器官中
是特异表达的，对其花器官的形成起作用。
植物B类基因属于MADS-box基因家族 II型，
包含MADS区、I区、K区和 C-末端 4个高度保
守结构域，因此也称为MIKC-type MADS-box基
因(Lamb和 Irish 2003)。AP3同源基因的突出特点
是含有非常保守的MADS-box，一般认为该区域
的功能是与DNA的结合有关。由于MADS-box具
有与DNA结合和形成二聚体的功能而参与转录调
控，所以这些基因编码的蛋白属于转录因子。本
文结果表明，在柳属植物中 AP3基因同源基因相
当保守。分化后碱基的替代事件发生少，氨基酸
序列变化不大。一般认为，如果蛋白质序列间在
至少80个氨基酸左右的区域中具有25%或更高的
相似性，那么它们一般具有相类似的生物学性
质，因而有可能在不同物种中执行着相同功能。
所以可以认为，柳属不同物种的 AP3同源基因可
能在花器官的发育中执行着相同或相似的功能。
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图 5 AP3同源基因的系统进化树
Fig.5 Phylogenetic tree analysis of homologous AP3 gene
植物生理学通讯 第 43卷 第 3期，2007年 6月 475
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