全 文 ：收稿日期:2009-03-12
基金项目:海南师范大学青年教师科研资助项目（QN0708）
簸箕柳组织培养初步研究
关亚丽 1， 陈 英 2， 黄敏仁 2
摘 要：对簸箕柳组织培养技术进行了初步探索. 结果表明：以簸箕柳嫩枝条为外植体，消毒以
70 %（体积分数）乙醇 30~40 s+0.1 %（质量分数）HgCl24~5 min 为宜；用 White 为基本培养基，激
素组合以 6-BA1.0 mg·L-1+NAA 0.01 mg·L-1诱导腋芽效果最好；BA 对腋芽的诱导率有显著影
响，回归方程为 Y = 29.806 +126.517X-64.522X2；基本培养基对丛生芽的诱导无明显影响；不加
激素的 White和 B5培养基均可诱导无菌苗生根.
关键词：簸箕柳；茎段；组织培养
中图分类号：S 722.3 文献标识码：A 文章编号：1671-8747（2009）02-0204-05
（1. 海南师范大学 生命科学学院，海南 海口 571158；
2. 南京林业大学 江苏省林木遗传与基因工程重点实验室，江苏 南京 210037）
研究某个基因的功能一般需要获得该基因的
突变体. 木本植物由于树体高大，生长周期长，建立
数目庞大的突变体库进行突变体筛选十分困难，因
此常采用定向诱变技术，如 RNAi、基因打靶、反义
基因抑制等. 但以上研究大多需要建立一个高效的
组织培养体系 . 簸箕柳（Salix suchowensis）属杨柳
科柳属，主要分布在北起辽宁中南部，南至长江流
域，东自山东半岛，西至甘肃东南部 . 灌木，雌雄
异株，实生苗和扦插苗在一般情况下 1 a就可开花.
因此，簸箕柳较其他木本植物而言，世代短，是研究
林木发育生物学的理想材料. 簸箕柳的组织培养尚
未见有报导，本文以簸箕柳的茎段为初始外植体，
探索其组织培养技术体系，为后续的簸箕柳转基因
研究提供技术平台.
The Preliminary Study on Tissue Culture of Salix Suchowensis
GUAN Yali1, CHENG Ying2, HUANG Minren2
Abstract：Tissue culture technique of Salix suchowensis was studied in this paper. The result indicated that the opti-
mum sterilizing conditions were 0.1% mercuric chloride for 4~5 minutes and 70% alcohol for 30~40 seconds by using
tender stem with lateral bud as explants. The best phytohormone combination for inducing axilla bud was 1.0 mg·L-1 of
6-BA+0.01mg·L-1 of NAA when the basic medium B5 was used. The concentration of BA had remarkable effect on
axilla buds induction,and the regression equation is Y=29.806+126.517X-64.522X2. But the induction of shoot clusters
could not distinctly be effected by basic medium. Rooting plants could be induced in whether White or B5 medium
with no phytohormone.
Key words：Salix suchowensis；stem；tissue culture
（1. College of Life Sciences, Hainan Normal Univercity，Haikou 571158，China；
2. Key Laboratory of Forest Genetics and Gene Engineering，Nanjing Forestry University，
Nanjing 210037，China）
2009年 6月 Journal of Hainan Normal University（Natural Science） Jun. 2009
第 22 卷第 2 期 海南师范大学学报(自然科学版) Vo1.22 No.2
［1］
1.1 材料
簸箕柳，取自南京林业大学. 冬天采枝条用自
来水培养，每 3 d 更换 1 次培养用水，待春天枝条
萌芽后分别取当年春季萌生的新枝条和冬枝作为
组培材料.
1.2 方法
1.2.1 材料的处理
分别剪取春季新萌芽枝条和冬枝上带腋芽的
茎段，剪去叶片，留部分叶柄（以防止消毒液对幼嫩
的腋芽产生伤害），用洗衣粉浸泡 30 min左右，流水
冲洗不少于 3 h，备用.
1.2.2 初代接种
将冲洗干净的外植体转到超净工作台上，用
70 %（体积分数）乙醇和 0.1 % （质量分数）HgCl2进
行消毒，再用无菌水冲洗 5~7次. 然后剪取 1 cm 左
右的带芽茎段接种于诱导培养基上，每瓶 1~3 个外
植体. 对于外植体的消毒，采用了正交设计法，设有
3个因素，即：外植体（A）、70 %乙醇的消毒时间（B）
和 0.1 ％HgCl2的消毒时间 （C），A因素设 2个水平：
分别为当年春季新萌发的枝条和冬枝；B 因素设 3
个水平：分别为 30、40、60 s；而 C 因素的设计则分
为两种情况讨论，即对于 A1设计了 3个水平分别为
3、4、5 min；而对于 A2设计了 4个水平分别为 5、4 +
3（即 0．1 ％HgCl2浸泡 4 min 后，用无菌水荡洗 3~5
次，再置于 0.1 ％HgCl2中浸泡 3 min）、4 + 4 min
（即 0.1 ％HgCl2浸泡 4 min 后，用无菌水荡洗 3~5
次，再置于 0.1 ％HgCl2中浸泡 4 min）和 10 min.
1.2.3 培养基和培养条件
初代培养基： White +激素+琼脂 5.4 g·L-1+蔗
糖 30 g·L-1，pH5.8 左右. 采用 BA、NAA 两种激素，
其浓度分别为 0.5、1.0、2.0 mg·L-1. 培养 30 d 后统
计萌芽率.
增殖培养基：以 White 和 B5为基本培养基，附
加 BA 1 mg·L-1和 NAA 0.01 mg·L-1，蔗糖、pH 和琼
脂同上. 培养 30 d后统计丛生芽诱导率.
生根培养基：分别以不含激素的 White和 B5作
为基本培养基，添加蔗糖 20 g·L-1，pH 和琼脂同上.
选择 2～3 cm 左右的苗作为供试材料，经过 1 个月
培养，统计生根情况.
培养条件：光照强度 1 200 lx，光照时间每日
12 h，温度 25~27 ℃.
2.1 外植体生理状态对初代培养的影响
对于无菌培养系的高效、快速获取，选择适当
的外植体来源是十分重要的. 两种不同取材，其初
代培养污染率具明显差异 （见表 1）. 由表 1 可知，
以当年春季萌生的新枝条为外植体进行初代培养，
其污染率较低，因此，当年春季萌生的新枝条是较
好的外植体来源.
2.2 不同消毒处理对初代培养的影响
酒精对细胞具有较强的穿透性和杀伤性，容易
使被处理的材料受到损伤，因此把握好消毒时间是
保持材料活性的关键. 由实验结果可知，幼嫩的茎
段以浸泡 30 s 左右为宜，木质化程度较高的茎段
以浸泡 40~60 s为宜. 质量分数为 0.1 ％HgCl2的消
毒效果虽然较好，但它对外植体的褐化、分化等方
面的影响却是最大的. 因此，为得到有效无菌的外
植体，对于木质化程度较高的茎段较为有效的消毒
途径为两次消毒：即将酒精处理后的外植体用无菌
水冲洗后，用0.1 ％HgCl2 浸泡 3~4 min，无菌水冲
洗后再次用 0.1 ％HgCl2处理 3~5 min，最后用无菌
水冲洗 3~5次. 这样处理的消毒效果最好，同时褐变
程度也最低. 表 2 为不同消毒处理对外植体培养的
影响结果，由表可知，当年春季萌生的新枝条的最
佳消毒方法为：先用 70 %乙醇处理 30~40 s，再用
0.1 %HgCl2浸泡 4~5 min；而对于冬枝的最佳消毒
方法为：先用 70 %乙醇消毒 40 s，倒去酒精后再用
0.1 % HgCl2 浸泡 4 min，接着用无菌水冲洗 2~3次，
然后再用 0.1 % HgCl2浸泡 4 min.
2.3 不同激素组合对初代培养的影响
从表 3可知，不同激素的组合对芽的萌发有明
显的影响. 在 BA 为 1.0 mg·L-1、NAA 为 0.01 mg·L-1
时，萌芽率达到了最大，为 100 %；此时平均诱导芽
数为 3；芽的生长状况也最好：苗高且粗，叶片舒
展，叶色翠绿. 方差分析结果表明（见表 4）：NAA及
其与 BA 交互效应 NAA∶BA 对芽的诱导率没有显
1 材料和方法 2 结果与分析
表 1 不同来源外植体初代培养污染情况表
Table 1 The different explants polluting ratio
外植体来源 接种数 污染数 平均污染率/%
当年春季萌条
冬枝
207
303
4
265
1．93
87.50
平均污染率（%）=污染数/接种总数×100%注
第 2期 关亚丽等： 簸箕柳组织培养初步研究 205
206 海南师范大学学报（自然科学版） 2009年
表 2 不同消毒方法初代培养污染情况比较
Table 2 The explants polluting ratio by using different sterilizing method
外植体来源
不同的灭菌处理时间
70%（体积分数）乙醇/s 0.1%（质量分数）HgCl2/min
接种数 存活数 无菌率/%
春季新萌发的枝条
春季新萌发的枝条
春季新萌发的枝条
春季新萌发的枝条
春季新萌发的枝条
春季新萌发的枝条
冬枝
冬枝
冬枝
冬枝
冬枝
冬枝
冬枝
冬枝
冬枝
冬枝
冬枝
30
30
30
40
40
40
30
30
30
30
30
40
40
40
60
60
60
3
4
5
3
4
5
5
7
4+3
4+4
10
4+3
4+4
10
4+3
4+4
10
15
15
130
15
15
17
79
90
30
12
13
12
12
12
13
15
15
13
15
129
14
15
17
2
4
2
4
2
6
6
2
3
4
3
86.7
100
99.2
93.3
100
100
2.5
4.4
6.7
33.3
15.4
50
50
16.7
23.1
26.7
20
表 3 不同激素组合对簸箕柳芽萌发的影响
Table 3 Effects of phytohormone combinationson shoot induction of Salix suchowensis
外植体数 已分化芽外植体数 芽的诱导率/% 苗的生长状态BA NAA
激素组合/（mg·L-1）
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
2.0
2.0
2.0
2.0
0.01
0.05
0.1
0.01
0.05
0.1
0.01
0.05
0.1
0
62
60
60
62
65
65
62
63
63
62
47
52
41
62
56
58
18
16
20
8
75.8
86.7
68.3
100
86.2
89.2
29
25.4
31.7
12.9
长势一般
长势一般
长势一般
苗高且壮
长势一般
长势一般
生长快速，苗不壮
生长快速，苗不壮
生长快速，苗不壮
生长快速，但玻璃化严重
丛生芽的诱导率（%）=诱导出芽的外植体数/接种的外植体数×100%注
表 4 簸箕柳芽诱导率方差分析
Table 4 F test of shoots induction on Salix suchowensis
变异来源 DF SS MS F 值 Pr>F
NAA
BA
NAA：BA
误差
1
1
1
6
227．734
6 593.021
232.710
2291.791
227.734
6 593.021
232.710
381.965
0.596 22
17.260 79
0.609 25
0.469 336 9
0.005 980 2
0.464 742 6
第 2期 关亚丽等： 簸箕柳组织培养初步研究 207
著影响，而 BA对芽的诱导率有显著影响.
对结果进行进一步处理，以 X代表 6-BA浓度，
Y代表芽诱导率，通过 DPS v3. 01 专业统计软件建
立自变量 6-BA（X）与簸箕柳芽诱导率 Y 的回归方
程为：Y=29.806+126.517X-64.522X2. 为了检测该
回归方程的有效性，对该回归方程进行了显著性检
验（见表 5），在 0.05 水平上达到显著. 在该回归方
程中，复相关系数 R为 0.974，决定系数 R2为 0.933，
经过检验复相关系数显著. 通过对回归方程的各项
系数进行显著性检验，各项系数均在 0.01水平上达
到极显著. 这说明构建的回归方程可以说明 6-BA
的浓度对芽诱导率存在着显著影响， 对以后的实
验具有理论指导意义.
另外，实验中还发现 BA 的浓度对丛生芽的形
态也有影响. 随着 BA浓度的增加，丛生芽诱导所需
的时间有缩短的趋势，但玻璃化现象加重，有效芽
数减少，诱导的芽由翠绿变为含水量很多的深绿色
玻璃化苗，可能是细胞分裂素浓度过高所致，特别
是对于培养基中只添加了 BA 的植株，玻璃化现象
更为严重. 对于出现玻璃化的苗，可以将其转入不
附加任何激素的基本培养基中，培养 1 周后症状有
所缓解.
2.4 基本培养基对丛生芽诱导的影响
当外植体诱导得到的芽长至 3~4 cm 时，切下
并分别继代到附加 BA 1 mg·L-1、NAA 0.01 mg·L-1
的 White 和 B5两种不同培养基中. 30 d 后统计结
果，发现两种基本培养基对丛生芽诱导的影响并无
太大区别.
2.5 生根诱导
当丛生芽长到 3 cm左右时，切下，诱导其生根.
生根诱导培养基为不加激素的 White 和 B5两种基
本培养基.结果表明，无论是当年生外植体还是冬枝，
所诱导的芽均能在这两种培养基中生根，并且生根
率高达 90 %以上（见图 1）.
（a）冬枝外植体上
腋芽的分化
（c）丛生芽 （b）生根苗（b）当年生外植体上
腋芽的分化
图 1 簸箕柳离体培养与植株再生过程
Fig.1 Procedure of In vitro plant regeneration of S. suchowensis
不同的植物器官和组织，其形态发生能力不同 .
Murashige 曾指出, 植株增长速度和再生植株的品
质，最关键的决定因素是起始的外植体 . 尤其是一
些较难培养的植物种类，需要仔细考虑外植体的来
源和生理状态，包括不同的个体，同一个体不同器官
或器官上的不同部位. 虽然从理论上讲，每一种植物
的任何部位、任何一个细胞都能恢复胚性，但由于技
术和条件的限制，在实践中这种可能性不能完全成
为现实. 有必要依据培养对象的生理特性和生态学
特性选择适宜的外植体. 本实验证明以当年春季萌
生的新枝条为外植体进行初代培养，其污染率最低，
利于快速、高效建立无菌培养系，是较好的外植体
来源.
本研究在丛生芽的增殖过程中出现了玻璃化
3 讨论
［2］
［3］
表 5 回归方程显著性检验
模型
误差
总计
2
7
9
8 861.479
483.777
9 345.256
4 430.740
69.111
64.111 0.000
DF SS MS F 值 Pr>F
Table 5 The test of singnificance of the
regression equation
208 海南师范大学学报（自然科学版） 2009年
苗的现象，主要表现在玻璃化丛生芽的芽体弱小，叶
片脆化，明显呈现出水渍状，叶色淡，这种苗若继代
培养，虽能增殖形成新的丛生芽，但芽体玻璃化症
状更加明显，且有褐化枯死现象，因此玻璃化苗基
本上不能作为生产或再生产的材料. 关于组培中的
玻璃化苗现象的原因，多数研究认为 BA 浓度的升
高会使玻璃化程度加剧，本研究结果也呈现出同样
的趋势. 除此之外，还有其他些因素与玻璃化苗出
现也有一定的关系，郭东红 认为外植体部位、大小
和培养基中 NH4
+
-N 与 NO3
-
-N 浓度对瑞香玻璃化
苗的产生有一定影响.
近些年，随着生物技术的不断发展，生物技术
的应用为柳树遗传育种开创了新途径. 柳树的组织
培养的难易与基因型与培养基的类型有密切的关
系. Stoehr 等 用 S.exigua 无性系叶外植体进行繁
殖，在含 0.1或 0.5 mg·L-1 BA和 2，4-D的 3 种培养
基上可以诱导出愈伤组织，0.1 或 0.5 mg·L-1 BA 上
继代培养可以诱导出芽原基，茎在无激素的 1/2 MS
培养基上生长超过 10 cm 长后，即可生根. Agrawal
D.C.等 用杂种柳（S.fragilis × S.lispoclados）的子房
进行微体快速繁殖，认为离体茎在不含激素的 SH
培养基中培养时具有最高的生根率，杂种小植株在
田间生长良好. 李洁 对雪柳的组织培养进行了初
步研究，她认为雪柳培养的基本培养基以 B5为好，
GS、MS次之，激素组合以 6-BA0.5 mg·L-1+NAA0.01
mg·L-1诱导腋芽效果明显. 本文以簸箕柳的茎段为
初始外植体，结果 6-BA1.0 mg·L-1 +NAA0.01 mg·
L-1诱导腋芽效果较好，而基本培养基对芽的增殖影
响不大. 目前我们正在扩大繁殖，如何继续提高芽
的增殖系数和试管苗的成苗速度，建立高效的遗传
转化体系等问题还有待于进一步研究.
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责任编辑：黄 澜