全 文 ：植物生理学通讯 第 40 卷 第 4期，2004 年 8 月 479
植物根内皮层凯氏带染色的小檗碱-苯胺蓝对染法
徐建华1,* 陶冶1 黄艳1 孙家林2,**
1 中国科学院高能物理研究所，北京 100039；2 清华大学物理系，北京 100084
A Berberin-aniline Blue Counterstaining Method for Dying Caspary Band in
Root Endodermis
XU Jian-Hua1,*, TAO Ye1, Huang Yan1, SUN Jia-Lin2,**
1The Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100039; 2Department of Physics, Tsinghua University,
Beijing 100084
提要 介绍了一种能观察到植物根内皮层凯氏带精细结构的小檗碱 - 苯胺蓝对染法。
关键词 植物根；内皮层；凯氏带；小檗碱；苯胺蓝
收稿 2003-10-20 修定 　 2004-02-17
资助　 国家自然科学基金(10174043)。
* E-mail:xujianhua@ihep.ac.cn,Tel:010-88235978
** 通讯作者(E-mail:jlsun@mail.tsinghua.edu.cn,Tel:010-
62772687)。
构成植物根内皮层凯氏带的物质主要是木质
素和木栓。用于这类物质的染色法很多[1,2]，如国
内常用的番红-固绿对染、苏丹III染色等[3]。但
这些方法或者对检测少量物质不够灵敏，或者操
作程序复杂，因此较少使用，限制了对内皮层的
研究。荧光显微技术出现后，由于其光学镜头在
暗场的陪衬下，对比度大，灵敏度高[4]，极大地
促进了对凯氏带典型结构的观察。1941年，Elisei[5]
首先报道一些取自白屈菜(Chelidonium majus) 活体
根的提取物可以充当凯氏带的荧光染色剂，便于
在荧光显微镜下观察。后经证实，这些化学物质
包括小檗碱、白屈菜红碱、血根碱、白屈菜胺
以及其他异喹啉生物碱[6]。经研究发现，不仅白
屈菜根内含有这类生物碱，其它许多植物种内也
含有这些物质[7]，这就为荧光染色提供了大量的
自然染色资源。Wilcox[8]及Peirson和Dumbroff[9]
是较早使用这种提取物染内皮层凯氏带和木质素
的。Peterson等[10]也采用这一方法清楚地看到禾
谷类和葱等植物根外皮层中的凯氏带。但使用这
一方法时，细胞内容物和靠近木栓层的酚类物质
需要热碱清除掉，而植物组织切片经碱处理后往
往变得很柔软，难以操作和固定。为了解决这个
问题，Brundrett等[11]比较了以上几种生物碱的特
性，发现可以用小檗碱染植物的新鲜切片，苯胺
蓝用作对染，以取代热碱清除步骤。经检测，用
苯胺蓝作小檗碱的对染剂，既可除去背景荧光，
又解决了组织切片过程中由于其过于柔软而难以控
制的问题。
我们采用小檗碱-苯胺蓝对染法研究了几种植
物根内皮层的结构，现介绍如下。
材料与方法
1 材料
植物材料为玉米(Zea mays)，水稻(Oryza
sativa)、野牛草(Buchloe dactyloides)。
2 方法
将以上几种植物幼根的成熟区(距根冠10~12
mm 处)在水中切下后，快速冷冻切片，或不经冷
冻作徒手切片，挑选出完整而均匀的切片置于载
玻片上，按以下步骤荧光染色：(1)切片浸泡在
0.1%(W/V)小檗碱半硫酸盐(berberin hemi-sulphate,
Sigma，C.I.no.75160)中 1 h，试剂用蒸馏水配
制。(2)用蒸馏水反复清洗 5 次左右。(3)浸泡在
0.05%(W/V)苯胺蓝(aniline blue，Polysciences, C.I.
no.42755)中约0.5 h，以后的清洗步骤如上。试剂
用蒸馏水配制。(4)样品置于经过滤的0.5%(W/V)
FeCl3与甘油的混合液(体积比1∶1)中，几分钟(一
般为5 min)后即可用于观察。FeCl3固定的目的是
使染色保留的时间更持久。
3 荧光显微镜成像
染色完毕的切片用Zeiss Photomicroscope III
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和 Zeiss Aziophot microscope, UV照明，激发滤
器G365(365 nm发射峰)，色差分光器FT395(395
nm)，阻挡滤片 LP420(允许大于420 nm波长的光
通过)。多数照片用 100 ASA 胶片拍摄。虽然用
FeCl3固定后染色时间可持续1 d多，但最好应在
染色后几小时内观察，这样拍摄的照片效果更
好。根据我们的经验，将染色后的样品放在4~5℃
冰箱内，不但可保存多日，而且观察效果也非常
理想　。
结果与讨论
图1-a是玉米根的染色结果。从中可以看出，
经小檗碱染色的中柱导管木质化细胞壁呈黄色；
内皮层凯氏带呈黄白色；根部内皮层内外的薄壁
组织细胞均被苯胺蓝染成蓝色。在图1-b野牛草根
中，内皮层中的凯氏带染成黄白色，而位于凯氏
带外部的木栓层则染成蓝白或蓝色。某些植物的
凯氏带基本退化，如适应水中生长的水稻和水生
植物，一般方法很难观察到。但采用此法亦可较
清楚地看到仅存于水稻内皮层细胞侧向壁的凯氏带
结构(图1-c)。由此可见，小檗碱-苯胺蓝对染法
是观察木质化细胞壁、凯氏带、木栓层的快速、
简单而又灵敏的方法。根据Peterson等[12]对洋葱
根表皮和皮层细胞的染色模式的解释，认为洋葱
表皮细胞壁包含酚醛类及自发荧光的混合栓质，
可被小檗碱染色，而部分则被苯胺蓝去除。皮层
薄壁细胞壁通常无自发荧光，几乎全部小檗碱的
染色都能被苯胺蓝去除。小檗碱-苯胺蓝可使外皮
层细胞凯氏带的荧光变得很强，而在未染色切片
中则由于能自发荧光以致无法辨认。总之，小檗
图1 几种植物根内皮层的小檗碱-苯胺蓝染色
箭头所示均为内皮层。a、b 和 c 分别是玉米、野牛草和水稻根的染色结果，d 为松针叶中的内皮层。
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碱-苯胺蓝染色技术可以很容易鉴定根内皮层和中
柱的各个不同结构。
除植物根中的内皮层外，此法对其他组织
中的内皮层也很适用，如松针叶的内皮层染色(图1-
d)。
1 苯胺蓝的对染特点
在生物组织染色中很重要的一点就是要去除
背景荧光，突出所要观察的结构。实验证明，苯
胺蓝作为对染剂的效果很好。例如，当完全没有
染色的根切片用 UV 光检测时，管状分子壁和内
皮层凯氏带以及栓质层均产生自发荧光，这就使
得位于“三明治式结构”中间的凯氏带很难辨
别。苯胺蓝染色会减轻管状分子自发荧光，并能
部分去除木栓层的自发荧光，因此，内皮层凯氏
带能清楚地看到。另外，小檗碱染色引起的木质
部荧光太强，以致在同样的曝光条件下无法观察
到内皮层栓质。苯胺蓝对染可以减弱多余的木质
部荧光，在突出木栓质层的同时，还可以部分去
除木质化细胞壁的染色，特别是不成熟的木质部
细胞吸收染色较差，可以根据其着色的程度判断
木质部发育的不同阶段。苯胺蓝也能去除植物组
织中的初生荧光，包括叶绿素及许多次生代谢产
物，其对不成熟木质部管道(没完全木质化)的去
除程度大于已完全木化的；去除木栓层的程度也
大于凯氏带的(特别是前者相对薄时)。细胞壁各
组分的荧光去除可以苯胺蓝处理切片的时间长短加
以调控。
需要注意的是，最好在使用前苯胺蓝溶液就
配好并过滤，避光保存，这样的染色效果更好；
而临时配制苯胺蓝溶液往往染色不够均匀，小檗
碱也是如此。根据我们的经验，提前准备溶液和
溶液过滤对能否染出颜色柔和、结构清晰的效果
很重要，这一细节容易忽略，应该考虑。
2 小檗碱的染色特点
白屈菜的几种生物碱提取物中，除白屈菜胺
未表现出染色特性外，小檗碱、白屈菜红碱、血
根碱和白屈菜胺的染色特点都很相似，均能产生
不同强度的黄或橙色。但在 UV 光照射下，后三
者生物碱染色产生的荧光都会很快衰退。在具有
染色能力的生物碱中，只有小檗碱的染色能力
好，抗漂白能力强，是植物组织染色中最好的染
色剂。事实上，小檗碱早已用于各种组织结构的
染色，包括动物细胞中的肝素和 DNA[13]以及植物
细胞中的纤维壁等[14]。小檗碱在紫外和蓝光部分
有几个激发带，较宽的发射峰在550 nm左右[13]。
用这种染色法进行紫外激发会得到较好的结果。
与蓝光和紫光激发相比，加紫外滤光片更多的可
见光可以通过。
UV照射引起的荧光衰退常使染色切片无法在
高倍下进行观察和检测。衰退速率可能与光强、
波长和荧光团浓度有关。抗氧化剂如对苯二胺、
没食子酸和重氮双环辛烷都可用于防止其他荧光团
的衰退[15,16]，但对小檗碱不起作用。这可能是因
为染色壁较厚，氧化剂无法进去。一个简单的降
低衰退速度的方法是在 UV 激发前通过白光聚焦，
尽可能地减少 U V 的照射时间。
小檗碱和白屈菜提取物对细胞壁有很强的吸
附性，在足以穿透细胞壁的浓度下也会出现细胞
内含物和纤维壁呈非特异性染色的现象。因此，
木栓质和木质素在植物组织中的特殊位置需用苯胺
蓝的对染予以加强。当高浓度的苯胺蓝固定在
FeCl3 中时，会与多余的荧光试剂发生反应，形
成无荧光的化合物。可用于去除细胞壁中小檗碱
的荧光。
小檗碱和苯胺蓝染色的切片固定在甘油中会
迅速退色。只有含FeCl3的甘油可以防止苯胺蓝和
小檗碱退色。用这种浸片剂染色可以长时间保
存。环氧树脂和异丁烯酸包埋的切片无法用苯胺
蓝作小檗碱的对染剂。即便去除包埋剂之后也是
如此。由于切片过程中的固定、脱水和渗透等处
理使细胞壁的透性受到破坏，因而染色剂无法着
色。
总之，以小檗碱 - 苯胺蓝对染法观察内皮层
结构比传统的组织化学方法有以下几个优点：操
作简单；灵敏度高，例如用传统的方法无法区别
木栓层和凯氏带，而用此法借助苯胺蓝的对染，
不但可以清晰地辨认凯氏带、木栓层等内皮层的
精细结构，还可以根据细胞壁木质化和着色程度
的不同来判断细胞的不同发育阶段。这一点对研
究植物发育及解剖结构与生理功能之间的联系尤其
有价值。植物根部内皮层中的凯氏带对根内外物
质运输很重要，这已得到普遍认同[17]，而外皮层
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凯氏带对根的生长发育所起的作用也日渐引起人们
的关注，只是因其不易观察到而常被忽略，用本
文中的对染法则可以像研究内皮层凯氏带一样研究
外皮层凯氏带的结构[18]。由于此法有以上特点，
所以近年来已得到广泛应用[19,20]。
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