全 文 ：植物生理学通讯 第 40卷 第 6期，2004年 12月702
胡桐悬浮培养细胞中苯丙氨酸解氨酶活性与红厚壳素产量的关系
崔堂兵1,* 罗焕亮1 郭勇1 王菊芳1 代建国2
1华南理工大学食品与生物工程学院，广州 510641; 2深圳职业技术学院生物应用工程系，深圳 518055
提要 胡桐 CR2 细胞悬浮培养过程中，苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性上升后红厚壳素产量即增加。加入真菌诱导子后，PAL
活性与红厚壳素产量呈一定的正相关。以PAL 抑制物降低PAL活性后，红厚壳素产量也降低; 诱导物与抑制物同时加入，
PAL 活性与红厚壳素产量均界于诱导物处理与未处理之间。
关键词 苯丙氨酸解氨酶；细胞悬浮培养；红厚壳素；胡桐
Relationship Between Phenylalanine Ammonia-lyase Activity and Inophyllums
Production in Suspension Cultured Cells of Calophyllum inophyllum
CUI Tang-Bing1,*, LUO Huan-Liang1, GUO Yong1, WANG Ju-Fang1, DAI Jian-Guo2
1College of Food & Bioengineer, South China University of Technology, Guangzhou 510641; 2Department of Applied Biological
Engineering, Shenzhen Polytechnic College, Shenzhen 518055
Abstract Changes in phenylalanine ammonia-lyase (PAL) activity and inophyllums production were analysed,
showing that PAL activity increased preceding the inophyllums production during the process of suspension
culture. PAL activity changed after adding fungal elicitor, followed by changes of inophyllums production.
Addition of the PAL inhibitor L-2-amono-3-phenylpropionic acid at 10 mmol·L-1 suppressed the induction of
PLA activity and the corresponding inophyllums production. When the fungal elicitor was added with the
inhibitor, the both PAL activity and inophyllums production were between those induced by fungal elicitor and
control. There existed a significantly correlation between PAL activity and inophyllums yield in CR2 suspension
cultured cell of Calophyllum inophyllum.
Key words phenylalanine ammonia-lyase; cell suspension culture; inophyllums; Calophyllum inophyllum
收稿 2004-10-13
资助　 广州市科技新星计划项目(2000-K-003-01)。
* E-mail:fetbcui@scutedu.cn,Tel: 020-87113847
红厚壳素被认为是很有开发潜力的抗艾滋病
的免疫缺陷病毒(HIV)天然药物[1]。热带雨林树种
胡桐(Calophyllum inophyllum)即含有这类物质[2]。
我国仅在海南岛有胡桐植物分布，储量并不丰
富。为了不破坏胡桐植物资源而又能获得红厚壳
素，我们从2000年起着手通过胡桐细胞培养生产
红厚壳素的研究，并建立了胡桐细胞悬浮培养体
系，选育出相对高产的胡桐 CR2 细胞株。为进一
步提高胡桐悬浮培养细胞中红厚壳素的产量，本
文探讨胡桐细胞中与产生红厚壳素有关的苯丙氨酸
解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL）活性
变化，及其与红厚壳素产量的关系，以期提高红
厚壳素的产量。
材料与方法
取经选育、生长稳定的胡桐(Calophyllum
inophyllum)CR2愈伤组织，按5 g(DW)·L-1的接种
量，接种于添加2.0 mg·L-1 2,4-D、0.32 mg·L-1 6-BA、
35 mg·L-1蔗糖的B5新鲜液体培养基中，悬浮培养
的温度为25℃，全天光照，光照度1 200 lx，摇
床转速为110 r·min-1。
从感病的胡桐叶中分离的病原菌——壳多孢菌
(Stagonospora curtisii)，诱导胡桐悬浮培养细胞产
生红厚壳素。用改良的PDA[3]培养基震荡，于25℃
下暗培养3 d后挑取菌丝接种在上述去掉琼脂的液
体培养基中，暗培养6 d (120 r·min-1)后抽滤收集
菌丝，用蒸馏水清洗 3 次，清洗后的菌丝加等体
积蒸馏水匀浆，抽滤得菌丝提取液，分别制成真
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菌诱导子，于121℃下消毒25 min备用。诱导子
加入量按菌液中的含糖量计算，单位为mg(GE)·L-1
(GE: glucose equivalent, 葡萄糖当量)，糖含量测
定用蒽酮法[4]。
经布氏漏斗真空抽滤后，收集培养液，测定
红厚壳素含量。细胞用 5 倍体积的蒸馏水充分洗
涤，抽干后称细胞湿重，于60℃烘箱中烘干至恒
重，放在干燥器中冷却后称细胞干重，计算细胞
含水率。生物量以每升培养基中细胞干重表示[g
(DW)·L-1(培养液)]。同时，测定细胞中红厚壳素
含量。以红厚壳素P(inophyllum P)为标准品，按
略加修改的文献 5 的方法，以 HPLC 检测红厚壳
素含量(mg·L-1)。
苯丙氨酸解氨酶活性按文献 6 的方法测定。
取5 g过滤收集的培养细胞，加10 mL 含5 mol·L-1
巯基乙醇的硼酸缓冲液、0.5 g 聚乙烯吡咯烷酮
(PVP)、少量石英砂在研钵中研磨，用23 kHz 超
声波破碎。匀浆后抽气过滤，滤液以11 180 g离
心15 min，上清液为酶粗提液。上述操作均在0~4
℃下进行。测定酶活性：取 1 mL 酶液，加 1 mL
0.02 mol·L-1 L-苯丙氨酸、2 mL蒸馏水，总体积
为 4 mL；对照不加底物，加 1 mL 蒸馏水。反
应液置30℃恒温水浴中保温。0.5 h后用紫外分光
光度计测定290 nm处光密度值。以每小时在290
nm处光密度值变化0.01所需酶量为1单位(相当每
毫升反应物形成肉桂酸)。
实验结果
1 胡桐CR2细胞悬浮培养过程中的PAL活性和红
厚壳素产量变化
图 1 显示，PAL 活性在接种后 6 d 开始快速
上升，21 d 达最大值，之后急速下降，30 d 又
回落到初培养时的水平。而红厚壳素积累比 PAL
活性上升速度明显滞后，产量达最大值之前，两
者的变化趋势基本一致，也就是说，PAL 活性的
升高相应地带来红厚壳素产量的升高。
2 真菌诱导子对PAL活性和红厚壳素产量的影响
从图2可见：(1)胡桐细胞悬浮培养期间不同
时刻加入真菌诱导子后，PAL 活性均迅速升高，
24 h时出现一个短暂的峰值，然后缓慢下降，培
养至 96 h 的 PAL 活性下降，与不加诱导子的相
当。3种情况下的PAL 活性峰值以培养18 d 时加
入的增幅最大，实验开始时加入的次之，9 d 加
入的最小。这说明植物细胞感受外界刺激后，调
节内部代谢能力与细胞所处的生长阶段有关。 (2)
在诱导子作用下，红厚壳素产量均有提高，合成
速度也快，3者均在诱导培养72 h 时出现明显的
峰值，增长幅度以 18 d 时加入的最大，96 h 的
图2 培养后不同时间内加入真菌诱导子对
PAL活性和红厚壳素产量的影响
Fig.2 The influence of added fungi elicitor at different
times on PAL activity and inophyllums
production during the cell culture
图 1 CR2细胞悬浮培养过程中PAL活性
与红厚壳素产量的变化
Fig.1 Changes in PAL activity and yield of inophyllums in
cell suspension culture of C. inophyllum
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虽略有下降，但仍比不加诱导物的明显高。开始
时加入真菌诱导子后72 h的红厚壳素产量达到一
定高值之后，仍缓慢升高。这显示 PAL 活性上升
与红厚壳素产量增加之间似有一定的相关性。
3 PAL活性抑制物对红厚壳素含量的影响
图3表明，加入抑制物L-2-氨基-3-苯丙酸
后，P A L 活性下降。同时加入抑制物与诱导子
时，PAL 活性在单加诱导子与不加诱导子之间，
24 h出现短暂峰值，之后缓慢下降；红厚壳素积
累量也在两者之间。
讨　　论
苯丙烷类代谢途径是植物次级代谢中一条重
要的途径。这一途径中的莽草酸途径产生的莽草
酸通过分酸、预苯酸经转氨作用生成苯丙氨酸后
进入苯丙烷类代谢途径，苯丙烷类代谢可生成反
式肉桂酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产
物，进一步转化为香豆素、绿原酸，也可形成
CoA 酯，再进一步转化为类黄酮、木质素等[7]。
PAL 是连接初级代谢和苯丙烷代谢、催化苯丙烷
类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键
酶和限速酶，也是研究最多的酶。另外，香豆
素是植物受侵染或胁迫而产生的一类低分子量抗微
生物的植保素，它是苯丙烷类代谢直接或间接产
物。据报道，香豆素等植保素的生物合成与 PAL
活性成正相关[8]。Kitamura等[9]和Bohlman等[10]分
别根据珊瑚菜和芸香细胞悬浮培养过程中 PAL 活
性与其相应代谢产物量呈正相关的结果，推论
PAL 是呋喃香豆素生物合成的关键酶。本文中悬
浮培养的胡桐细胞不同生长阶段的 PAL 均与红厚
壳素产量呈明显的相关性，似乎也说明苯丙氨解
氨酶是胡桐细胞形成红厚壳素过程中的重要酶。
这显示从提高 PAL 活性来增加胡桐悬浮培养细胞
中的红厚壳素产量是值得考虑和探讨的课题。
参考文献
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图 3 PAL抑制物对PAL活性和红厚壳素积累量的影响
Fig.3 Effect of the PAL inhibitor on PAL activity and
inophyllums yield in the elicitor-treated cell culture
PAL 抑制剂的终浓度为 10 mmol·L-1。