全 文 ：植物生理学通讯 第 44卷 第 3期，2008年 6月454
紫花苜蓿逆境胁迫诱导相关转录因子MsDREB1基因克隆与分析
牛一丁，哈斯阿古拉 *，张丽，扈廷茂
内蒙古大学生命科学学院生物工程中心，内蒙古自治区牧草与特色作物生物技术重点实验室，呼和浩特 010021
提要：利用 RT-PCR方法，从紫花苜蓿中扩增得到一个新的转录因子MsDREB1基因 cDNA，克隆该 cDNA并进行序列
分析，结果表明该 cDNA包含一个长 651 bp的开放阅读框，编码一条含 216个氨基酸的多肽，分子量约为 24.9 kDa，等
电点为 6.11。蛋白质Blast数据显示，该多肽属于EREBP/AP2家族DNA结合蛋白的典型成员。进一步克隆了该基因的基
因组DNA，序列分析表明该基因无内含子。Southern blot分析表明，该基因在紫花苜蓿基因组中以 2拷贝存在。
关键词：紫花苜蓿；DREB转录因子；胁迫
Cloning and Analysis of a New Stress-inducible Transcription Factor MsDREB1
Gene from Alfalfa (Medicago sativa L.)
NIU Yi-Ding, Hasi Agula*, ZHANG Li, HU Ting-Mao
Inner Mongolia Key Laboratory of Herbage and Endemic Crop Biotechnology, Biotechnology Center, College of Life Sciences,
Inner Mongolia University, Hohhot 010021, China
Abstract: A new DRE-binding protein gene MsDREB1 cDNA that encoded an EREBP/AP2 type transcription
factor was isolated by RT-PCR from alfalfa (Medicago sativa L.) seedlings. The MsDREB1 had an open reading
frame of 651 bp, which encoded 216 amino acid residues. The putative protein was deduced to have a predicted
molecular mass of 24.9 kDa and a pI of 6.11. The Protein Blast data revealed that this protein could be classified
as a typical member of the EREBP/AP2 family of DNA-binding proteins. The comparison of the MsDREB1
cDNA with the MsDREB1 gene in genomic DNA showed that the size and nucleotide sequence of the cDNA
were the same as that of the genomic DNA. This indicates that the genomic MsDREB1 gene has no introns.
Southern blot analysis indicates that it is a double-copy gene.
Key words: alfalfa (Medicago sativa L.); DREB transcription factor; stress
收稿 2008-02-25 修定 2008-04-30
资助 国家自然科学基金(30460058)和内蒙古自然科
学基金(2 005 080 10 503 )。
* 通讯作者(E-mail：lshasi@imu.edu.cn；Tel：047 1-
4 9 9 2 2 0 9 )。
苜蓿是世界上分布范围最广、种植面积最大
的多年生豆科牧草，在我国也是最重要的牧草之
一。紫花苜蓿产量高、营养价值丰富、适口性
好，有“牧草之王”的美誉。但紫花苜蓿抗逆
性差，因此对它的抗逆性进行改良具有重要的应
用前景。
DREB类转录因子是植物特有的一类转录因
子，与植物对低温、干旱和高盐胁迫应答关系紧
密。Liu等(1998)分别从低温、干旱诱导的拟南
芥中分离得到 2类共 5个DREB类转录因子，利
用DREB1A培育的转基因拟南芥植株的低温耐性
比野生型植株显著增强。随后，关于DREB转录
因子的研究在国内外广泛开展了，大麦(Choi等
2002)、水稻(Dobouzet等 2003)、高羊茅(Tang等
2005)、甜瓜(Mizuno等 2006)、蓝桉(Gamboa等
2007)、大豆(Chen等 2007)、棉花(Huang等 2008)
等植物中均有DREB类转录因子基因分离鉴定的报
道。本文报道紫花苜蓿的一个DREB转录因子基
因 cDNA的克隆与分析。
材料与方法
紫花苜蓿(Medicago sativa L.)品种‘阿尔冈
金’ (‘Algonguin’)由中国农业科学院草原研究所
徐柱研究员提供。异硫氰酸胍购自华美生物工程
公司，反转录试剂盒 ThermoScriptTM RT-PCR Sys-
tem为 Invitrogen产品，UNIQ-10型柱式 PCR产物
纯化试剂盒购自上海生工生物工程有限公司，
Ta q D N A 聚合酶、dN TP、pM D 19 - T 载体、
DL2000 DNA Marker购自宝生物工程(大连)有限公
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司(TaKaRa)，随机引物标记试剂盒为 Promega公
司产品，[α-32P]dCTP为北京福瑞生物工程公司产
品，尼龙膜 Immobilon-NY+为Millipore产品。E.
coli DH5α为本实验室保存。
根据本实验室已克隆得到的野生黄花苜蓿逆
境胁迫诱导转录因子MfDREB1基因 cDNA序列
(GenBank登录号 EF654111)设计基因特异引物：
上游引物P1：5-CAAACTCTCTCCAATTCCGAC-
3，下游引物 P2：5-GGATGAGATGCACTTTAT-
GC-3，引物由上海生工生物工程公司合成。
以常规异硫氰酸胍法(Sambrook和 Russell
2001)提取经 4 ℃冷诱导 12 h的紫花苜蓿总 RNA，
反转录按照 Invitrogen公司产品说明书进行。以反
转录得到的 cDNA第一链为模板，P1、P2为上
下游引物进行 PCR扩增。扩增条件：94 ℃预变
性 5 min，然后进行循环反应，即 94 ℃变性 30
s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 60 s，循环 30次，
最后 72 ℃保温 10 min。PCR产物经 1.2%的琼脂
糖凝胶电泳检测。扩增片段用 UNIQ-10型柱式
PCR产物纯化试剂盒纯化。纯化产物与 pMD19-T
载体连接。连接物转化用 CaCl2法制备的 E. coli
DH5α感受态细胞，在含有Amp、IPTG和X-gal
的LB平板上挑选白色菌落，用快速提质粒法筛选
出重组子，用 PCR方法鉴定阳性克隆。随机挑
取 3个独立的重组克隆进行测序。
取无菌培养的紫花苜蓿幼苗叶片，用 SDS法
(安宝燕 2005)提取总DNA。取 300 ng DNA为模
板，P1和 P2为上下游引物，按照上述条件进行
PCR扩增。将扩增片段和RT-PCR产物同时经1.2%
的琼脂糖凝胶电泳检测。同时按照上述方法克隆
基因组 D NA，进行测序。
Southern杂交时取无菌培养的紫花苜蓿幼苗叶
片，用 SDS法(安宝燕 2005)提取基因组DNA，用
限制性内切酶 BamHI、EcoRI和 XbaI分别完全消
化 20 µg基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳，用毛
细管转移法将 DNA 转移至尼龙膜 Immobi lon-
NY+，以 α-32P标记MsDREB1基因 cDNA片段作
为杂交探针，按照文献(Sambrook和Russell 2001)
方法进行杂交。
实验结果
1 MsDREB1基因cDNA的克隆与序列分析
以反转录得到的 cDNA为模板，P1、P2为
引物扩增得到的 PCR产物长度约为 0.9 kb (图 1)。
序列分析表明得到的基因片段长 902 bp，包含一
个 651 bp的ORF (开放阅读框)、68 bp的 5-UTR
(5端非编码区)及 183 bp的 3-UTR (3端非编码
区)，该基因编码一个 216个氨基酸残基的多肽，
分子量约为 24.9 kDa，等电点为 6.11，将得到的
基因命名为MsDREB1，序列提交 GenBank，注
册号为 EU233782 (图 2)。根据推测的氨基酸序
列，MsDREB1蛋白含有一个高度保守的 EREBP/
AP2结构域，MsDREB1与其他植物CBF/DREB类
转录因子氨基酸序列对比结果见图 3。
图 1 紫花苜蓿MsDREB1 cDNA RT-PCR 扩增
Fig.1 Amplification of MsDREB1 cDNA by
RT-PCR from alfalfa
1：MsD REB1 cDN A；M：D L-2 0 0 0 Ma rker。
2 基因组中MsDREB1基因的分析
分别用苜蓿基因组 DNA和 cDNA为模板，
P1、P2为上下游引物进行 PCR扩增，扩增片段
同时经 1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测；同时将基因
组DNA测序结果与 cDNA序列对比。结果显示，
以基因组DNA为模板进行PCR反应得到的扩增片
段与以 cDNA为模板进行 PCR反应得到的扩增片
段大小相同(图 4)，基因组DNA序列与 cDNA序
列完全一致，这说明紫花苜蓿基因组中MsDREB1
基因无内含子。
3 Southern杂交分析
用限制性内切酶 BamHI、EcoRI和XbaI分别
完全消化紫花苜蓿基因组DNA，毛细管转移法将
消化产物转移至尼龙膜 Immobilon-NY+，以 α-32P
标记的MsDREB1基因cDNA片段作为杂交探针进
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行 Southern杂交，杂交膜在-80 ℃进行放射自显
影 7 d，X光片经显影、定影处理。杂交结果(图
5)显示，经 BamHI、EcoRI和 XbaI完全酶切后均
出现 2条较明显的杂交条带，这表明MsDREB1基
因在紫花苜蓿基因组内为 2个拷贝。
讨 论
通过对紫花苜蓿MsDREB1基因的cDNA及基
因组 DNA进行分析，证明该基因与其他物种的
DREB基因一样，基因内无内含子存在。紫花苜
蓿为异源四倍体牧草，遗传背景较为复杂，其基
因组DNA分别经BamHI、EcoRI和XbaI完全酶切
后，与基因探针进行杂交，均出现 2条明显的杂
交条带，该结果表明MsDREB1基因在紫花苜蓿
基因组中以 2拷贝存在。
国内外许多研究表明DREB转录因子与植物
对干旱、低温、高盐胁迫应答密切相关(刘强等
2000；Choi等 2002；刘录祥等 2003；韩兆雪等
2004；阳文龙等 2006)，在DREB转基因植物中，
DREB转录因子基因的超表达可以激活下游靶基因
的表达，从而提高植物对低温、高盐、干旱等
逆境的耐受性。但是对于紫花苜蓿DREB基因的
研究，在国内外还未见正式报道。本研究首次从
紫花苜蓿中分离得到MsDREB1基因，将为改良
紫花苜蓿品质，改善其抗逆性状提供一个候选目
的基因。
图 2 MsDREB1基因 cDNA核苷酸序列及推测的氨基酸序列
Fig.2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of MsDREB1 cDNA
虚线下划线部分为引物序列，实线下划线部分为 E RE BP /A P2 结构域。
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图 3 MsDREB1与其他植物CBF/DREB类转录因子氨基酸序列对比
Fig.3 Amino acid sequence alignment of MsDREB1 and other CBF/DREB transcription factors
GenBank 登录号分别为：MsDREB1 (EU233782)、TaCBF (AF376136)、FaDREB1 (AY423713)、HvCBF (AF239616)、
OsDREB1A (AF300970)和 AtDREB1A (AB007787)。
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图 4 基因组中MsDREB1基因大小分析
Fig.4 Analysis of the size of the genomic MsDREB1 gene
1：以紫花苜蓿基因组 D N A 为模板时的 P C R 产物；2：
RT-PCR 产物；M：D L-2 0 00 Ma rk er。
图 5 Southern blot分析
Fig.5 Analysis of the Southern blot
B：B a m H I 酶切杂交结果；E：E c o R I 酶切杂交结果；
X：X b a I 酶切杂交结果；M：分子量标记。
参考文献
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