全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 5期，2007年 10月 905
收稿 2007-06-13 修定　 2007-08-27
资助 河南农业大学重点学科建设基金(1 0466 -S09 0201 )。
* E - m a i l：z h u d a o y u @ y a h o o . c o m；T e l：0 3 7 1 -
63555837
用流式细胞仪鉴定中华猕猴桃的多倍体
朱道圩 1,*，杨宵 1，郅玉宝 2，易明林 2，理莎莎 1，符真珠 3
1河南农业大学林学园艺学院，郑州 450002；2河南省农业科学院，郑州 450002；3广西大学农学院，南宁 530005
Identification of Polyploidy in Actinidia chinensis Planch. by Flow Cytometer
ZHU Dao-Yu1,*, YANG Xiao1, ZHI Yu-Bao2, YI Ming-Lin2, LI Sha-Sha1, Fu Zhen-Zhu3
1College of Forestry and Horticulture, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2Henan Academy of Agricultural
Sciences, Zhengzhou 450002, China; 3College of Agriculture, Guangxi University, Nanning 530005, China
提要：中华猕猴桃叶中酚类物质多而黏性较大，对流式细胞仪检测多有不便。文章参照已有方法，改进细胞核提取液配
方和提取方法，建立了快速、准确鉴定秋水仙素诱导中华猕猴桃多倍体的方法，效果较好。
关键词：秋水仙素；中华猕猴桃；流式细胞仪；倍性鉴定
流式细胞仪(flow cytometer，FCM)也称倍性
分析仪(ploidy analyzer)，它集电子技术、计算机
技术、激光技术、流体理论于一体，是比较先
进的检测仪器。它可定量地测定某一细胞中的
DNA、RNA或某一特异蛋白的含量，以及细胞
群体中上述成分含量不同细胞的数量，近年来得
到越来越广泛的应用。特别在植物育种方面，采
用流式细胞仪可快速准确地鉴定各种植物的倍性，
从而提高育种工作效率(朱道圩等 2006)。流式细
胞仪鉴定植物倍性的原理为，待测细胞制成的单
细胞悬浮液经特异性荧光染料染色后加入样品管
中，在气体压力推动下进入流动室，流动室内充
满鞘液，在鞘液的约束下，被包绕成细胞液柱。
这种同轴流动的设计，使鞘液和样品流组成一个
圆形的流束，并与水平方向的激光光束垂直相
交。根据样品流和鞘液有气压差的层流原理，使
细胞依次排列成单行，每个细胞以均等时间依次
通过测量区，经荧光染料染色的细胞受到激光照
射后即发出荧光，由于DNA含量与荧光信号强度
成正比关系，细胞发出的荧光信号强度可代表所
测细胞核内的DNA含量，因而可用于植物倍性鉴
定。但流式细胞仪对细胞内黏性过高的样品测定
效果较差。这些黏性物质分布在细胞质中，细胞
质紧密地和细胞核粘在一起，分离的细胞核纯度
会受到影响，还会加速细胞核老化，增加样品黏
度，阻碍流式细胞仪中鞘液流动，以致不能准确
地检测出待测样品的倍性。而中华猕猴桃叶中含
有大量酚类物质，黏性较大，给流式细胞仪的检
测工作带来诸多困难。为此，本文参照前人的方
法(李赟等 1998a，b；张俊娥等 2003；马爱红
等 2005；陈绪中和罗正荣2005；Lee和Lin 2005)，
改进了细胞核提取液配方和提取方法，建立了一
种快速、准确和高效鉴定秋水仙素诱导中华猕猴
桃多倍体的方法。
材料与方法
1 材料
选取整齐一致的中华猕猴桃( A c t i n i d i a
chinensis Planch.)的萌发种子，接入加有 0.5%二
甲基亚砜和不同浓度的秋水仙碱的MS培养基中培
养。秋水仙碱浓度分别为 0 (对照)、10、20、
40、60、80和 100 mg·L-1，分别培养 3 d后再
接入不加任何生长调节物质的MS培养基中。培
养 1个月后，转入MS+0.3 mg·L-1 NAA+1 mg·L-1
ZT的培养基(朱道圩 1997)中，不仅产生愈伤组
织，而且还分化出不定芽苗，可用于流式细胞仪
的检测。
2 方法
取约0.2 g的不定芽苗顶部叶为多倍体检测材
料。采用 BD FACS Calibur流式细胞仪进行倍性
鉴定。检测工作在河南省农业科学院河南省农作
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物新品种重点实验室进行。为了防止中华猕猴桃
叶中酚类和黏性物质的干扰，在前人工作基础
上，修改和优化了细胞核提取液配方和提取方
法。操作流程如下。
(1)缓冲液的配制。MgSO4缓冲液的组成为：
10 mmol·L-1 MgSO4·7H2O+50 mmol·L-1 KCl+5 mmol·L-1
HEPES (1 mol·L-1 HEPES：将 23.8 g HEPES溶于约
90 mL的水中，用NaOH调至 pH 8.0，然后用水
定容至 100 mL)+0.25% (V/V) Triton X-100。
(2)提取液的配制。提取液 A：MgSO4缓冲
液中附加 1% (W/V)聚乙烯吡咯烷酮(PVP)-30，贮
藏于 4 ℃中备用；提取液 B：MgSO4缓冲液附加
0.40 mg·mL-1碘化丙锭(propidium iodide，PI)和
0.04 mg·mL-1 RNase (DNase-free)，现配现用。
制备无DNA酶的RNA酶时，将RNA酶A溶
于 10 mmol·L-1 Tris·HCl (pH 7.5)、15 mmol·L-1
NaCl中，配成 10 mg·mL-1的溶液，于 100 ℃中
加热 15 min，缓慢冷却至室温后分装成小份，保
存于 –20 ℃中。
(3)取中华猕猴桃叶片加入 1 mL 0 ℃的提取
液 A 中，在培养皿里用锋利的刀片快速将其切
碎，以二倍体中华猕猴桃或六倍体的美味猕猴桃
叶片作对照。
(4)溶液用30 µm尼龙网过滤至1.5 mL离心管
中，以 180×g的转速离心 5 min，弃去上清液至
0 . 1 刻度处。
(5)加入 500 µL提取液B，此时避光适温保存。
(6)荧光染色液染色 5~15 min，并充分混匀。
(7)进行流式细胞仪检测并通过与之连接的电
脑软件 BD FACS Calibur Software Package分析检
测结果、绘制成图。
上述为一步离心法。两步离心法为：在做完
步骤(4)后，再加入 1 mL提取液A于沉淀中，充
分混匀，以 180×g的转速离心 5 min，弃去上清
液至 0.1刻度处，以后的操作步骤与一步法相同。
实验结果
1 黏性物质含量不同的植物出峰效果的比较
一般提取液中不加 PVP，对黏性较小的大花
高代(Godetia grandiflora)来说，不加 PVP也能很
好地出峰(图 1)。而中华猕猴桃叶中含有大量酚类
物质，黏性较大，不加 PVP的出峰效果很差，且
容易堵塞机器。由图 1可知，提取液不加 PVP的
中华猕猴桃叶中 DNA含量分布不能正确显示出
来，在荧光通道值为 200和 400处都没有明显的
尖峰出现，但杂峰则很明显。而大花高代叶中
DNA在荧光通道值 200处有一条很明显的尖峰。
2 一步离心法与两步离心法的检测结果比较
由图 2 可知，一步离心法由于细胞碎片过
多，杂峰明显，影响检测结果；两步法在荧光
通道值 200处有一条很明显的G1 (DNA合成前间
期，DNA尚未加倍)细胞尖峰，在荧光通道值 400
处G2 (DNA合成后间期，DNA已加倍)细胞的小峰
明显。据此认为两步离心法比一步离心法的结果
更清晰，且不容易阻塞机器。
3 不同倍性植物的检测结果比较
由图 3可以看出，3种植物的荧光通道值不
同。二倍体中华猕猴桃在荧光通道值 200处，六
图 1 黏性物质含量不同的植物出峰效果的比较
中华猕猴桃叶片经过 8 0 mg· L -1 秋水仙素处理，大花高代则没有处理。
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猕猴桃为四倍体。
4 加倍植物的倍性鉴定
采用上述改良的实验配方，用流式细胞仪检
测所有经过秋水仙素处理得到的中华猕猴桃(各个
处理均为20~30棵植株)倍性的结果(图4)表明，秋
水仙素的诱变效果因浓度不同而异。在一定范围
内，加倍率随着秋水仙碱浓度的增加而增加，超
过 40 mg·L-1时，加倍率下降。本文的最适浓度
为 40 mg·L-1，加倍率可达 76%。
图 2 二倍体中华猕猴桃叶中的DNA含量分布
图 3 不同倍性植物检测结果的比较
图 4 不同浓度秋水仙碱诱导中华猕猴桃的加倍率
讨 论
流式细胞仪的最大特点是可以自动快速地测
定同一个细胞的多种相关参数，并同时可以获得
细胞的2种散射光强以及3种不同波长荧光强度的
信息。这些信息可以代表细胞或细胞器的各种形
态参数、生物学特性、生化成分以及细胞功能，
因而可用于多种用途的检测工作，近年来得到越
来越广泛的应用(李琳等1996；中国科学院上海植
物生理研究所和上海市植物生理学会 1999)。
倍体美味猕猴桃在荧光通道值 6 0 0 处和经 1 0 0
mg·L-1秋水仙素处理的中华猕猴桃在荧光通道值
400处各有一个尖峰，说明秋水仙素处理的中华
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流式细胞仪对细胞内黏性过高的样品检测效
果较差。此前，我们曾用流式细胞仪做过豌豆、
红薯、辣椒、花生、大花高代等作物的倍性检
测，由于这些植物含有的黏性物质较少，在不加
PVP的情况下都能很好地出峰，其中豌豆(资料未
列出)和大花高代的效果最佳(图 1)。而中华猕猴
桃叶中含有大量酚类物质，黏性较大，不加 PVP
时的出峰效果很差，且容易堵塞机器(图 1)。为
此，我们对已有方法进行了改进。主要改进之处
为：(1)加入 PVP；(2)去掉常用方法的配方中常用
的巯基乙醇，改进配方的效果很好；(3)常用方法
的配方中在提取液A和 B中均加入 Trion X-100，
改进的配方只加在MgSO4缓冲液中，且不必分别
加入， 步骤简化了许多；(4)改变碘化丙锭和RNA
酶的用量，效果良好；(5)一步离心法改为二步离
心法，对粘性物质含量较大的植物的效果更好。
流式细胞仪鉴定植物倍性的可靠性已得到众
多实验的证实，本文用流式细胞仪鉴定出的四倍
体中华猕猴桃与二倍体中华猕猴桃的差异很明显，
可从以下两方面得到证明。(1)从形态学来说，鉴
定出的四倍体植株比二倍体植株的叶片显著增大、
增厚，叶色加深，叶缘缺刻明显，叶毛长而多，
植株健壮，生长势强。(2)四倍体植株的叶片保卫
细胞长度和宽度均显著大于二倍体的。前者的保
卫细胞大小为 42.45 µm×26.16 µm，长宽比为 1.62；
后者为 24.86 µm×14.78 µm，长宽比为 1.68，叶
片气孔的密度较大，为四倍体的 1.94倍。总之，
流式细胞仪鉴定的四倍体植物符合多倍体的特征，
结果准确可靠。
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