全 文 ：植物生理学通讯 第 43卷 第 2期，2007年 4月226
收稿 2006-11-06 修定 　2007-03-15
资助 国家转基因植物研究与产业化专项基金(JY03-B-19-2)和
河南省杰出人才创新基金(02 2 1 00 0 9 0)。　
* 通讯作者( E-ma i l：x i n j i a n @ 3 7 1 . n e t；T el：0 3 7 1 -
6 3 9 7 8 3 1 8 )。
转DREB基因烟草悬浮细胞系(BY-2)的建立及其几个与抗盐和抗渗透胁迫
相关指标的检测
陈军营 1，阮祥经 1，杨凤萍 2，张晓东 2，陈新建 1,*
1河南农业大学农学院，郑州 450002；2北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心，北京 100089
提要：用基因枪法将DREB基因和诱导型启动子 rd29B构建的载体pBAC128F转入烟草悬浮细胞。通过除草剂抗性筛选、
PCR和 PCR-Southern检测，获得转DREB基因的细胞系。以 300 mmol·L-1 NaCl和 15% PEG6000处理 14 d后，转基因细
胞系存活并生长，而野生型则接近死亡。转基因细胞系的脯氨酸含量和超氧物歧化酶活性普遍高于野生型的，而丙二醛
含量则相反。
关键词：转基因烟草；DREB基因；渗透胁迫；盐胁迫；抗性
Establishment of DREB Transgenic Tobacco (Nicotiana tobacam L.) BY-2 Cell
Line and Detection of Some Indexes Related with Its Tolerances to Salt and
Osmotic Stresses
CHEN Jun-Ying1, RUAN Xiang-Jing1, YANG Feng-Ping2, ZHANG Xiao-Dong2, CHEN Xin-Jian1,*
1College of Agronomy, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China; 2Beijing Agro-biotechnology Research Center,
Beijing Academy of Agriculture and Forestry, Beijing 100089, China
Abstract: By particle bombardment, expression plasmid pBACl28F carrying DREB gene and inducing promoter
rd29B, was transformed with BY-2 (bright yellow 2) suspension cells of tobacco (Nicotiana tobacam). After
screen by Bialaphos and identification by PCR, PCR-Southern blotting, transgenic suspension cell line were
produced. Under 300 mmol·L-1 NaCl or 15% PEG6000 stress for 14 d, transgenic cell line could grow, but wild
type (WT) was near to death. The results showed that proline content and SOD activity were higher in transgenic
cell line than those in WT, but MDA content was opposite.
Key words: transgenic Nicotiana tobacum; DREB gene; osmotic stress; salt stress; resistance
通过转基因方法提高农作物的抗旱和盐能力
是现代农业生物技术应用中的热点( W a n g 等
2003)。用于植物抗逆性基因工程改良的外源目的
基因依据其产物的作用分为两大类。一类是一些
功能蛋白和渗透调节因子的基因 ( 如 L E A 、
P5CS、mtl、gutD和 BADH等)。这类基因一直
受到国内外广泛重视，研究得比较透彻，并已获
得了一些耐旱和耐盐能力得到改善的转基因植物。
第二类主要为传递信号和调控基因表达的转录因子
(如 bZIP、MYC、MYB和 DREB等) (Shen等
2003)。这类基因表达特性及基因产物调控作用的
研究是植物分子生物学领域中的前沿性工作。其
中，脱水响应元件结合蛋白(dehydration-respon-
sive element binding，DREB)转录因子在基因工程
方法综合性改良植物抗逆性中的应用日益受到关
注。DREB转录因子和脱水响应元件(dehydration-
responsive element，DRE)在干旱和高盐胁迫信号
传递中起作用，一个DREB转录因子可以调控多
个与植物干旱和高盐耐性有关的功能基因的表达，
从而综合提高植株的抗逆性(刘强等 2000；Xiong
和 Fei 2006)。
BY-2 (bright yellow 2)悬浮细胞生长迅速、易
于培养、受环境因子干扰少、细胞分散性好、胁
迫处理均匀、研究周期短、不受季节限制等多种
优点，是研究转化基因功能的良好试材。本文采
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用基因枪转化法，于诱导型启动子 rd29B的控制
之下将DREB基因转入 BY-2细胞系，检测了转
DREB基因细胞系的抗盐和抗渗透胁迫能力。
材料与方法
烟草(Nicotiana tabacum L.)悬浮细胞(BY-2，
河南农业大学刘卫群先生提供)接种于MS基本培养
基中。MS液体培养基：MS大量元素、MS微量
元素、MS铁盐、0.2 g·L-1 KH2PO4、0.1 g·L-1肌
醇、1 mg·L-1 VB1、0.6 mg·L-1 2,4-D、2 mg·L-1甘
氨酸和 30 g·L-1蔗糖，pH 5.8。在 25 ℃，震幅
为 l25 r·min-1黑暗条件下培养，每隔 7 d，将其
中 2 mL的培养液转移到另一新的盛有 50 mL基本
培养液的三角瓶中。MS 固体培养基：MS 液体
培养基用琼脂粉 8 g·L-1固化。固体培养的接种方
法：将 30 µL液体培养 7 d的溶液加到固体培养
基的表面，25 ℃黑暗条件下培养。
指南进行制备。选用可裂膜片压力为 7 579 kPa，
真空度为 27~28 Pa，靶材料距离载样膜为 9 cm，
对靶材料进行轰击。转化后的BY-2继续在上述高
渗培养基中培养 16 h，然后转移到固体培养基中
过渡培养 1周，之后将 BY-2转到添加了除草剂
Bialaphos的液体培养基中进行筛选培养，最后得
到抗除草剂的稳定细胞系。
收集具有除草剂抗性的转 DRE B 基因细胞
系，采用CTAB法提取总DNA。以野生型的为阴
性对照、质粒 pBAC128F为阳性对照，PCR产物
用 1%凝胶电泳检测。转基因 BY-2的 PCR检测，
根据 D R E B 基因设计引物，上游引物：5
TCCGATTACGAGCCTCAA 3；下游引物：5
CAAAGCGACACGTCACCA 3。以质粒酶切的目
的基因为探针DNA，用地高辛随机引物法标记探
针，采用 Roche公司生产的地高辛试剂盒对 PCR
产物进行 Southern杂交分析。
分别对转基因 BY-2和野生型细胞系进行盐
胁迫和渗透胁迫处理：在含 1 0 0、2 0 0、3 0 0
mmol·L-1 NaCl和 5%、10%、15% PEG6000的MS
固体培养基中对转基因细胞系和野生型细胞系进行
胁迫处理 14 d。培养皿的一半接种转DREB基因
细胞系，另一半接种野生型细胞系，接种量为 30
µL (液体培养 7 d 后的 BY-2悬浮细胞系)，以供
观察细胞生长情况。在MS液体培养基模拟盐和
渗透胁迫处理：在 M S 液体培养基中分别添加
150、200、250 mmol·L-1 NaCl和 10%、15% PEG6000，
并对细胞处理 24、48和 72 h，以未经处理的细
胞系为对照，测定相关指标。
细胞中的脯氨酸提取采用磺基水杨酸法的方
法(张殿忠等 1990)。超氧物歧化酶(superoxide
dismutase，SOD)活性测定采用NBT光化还原法
( B e a u e h a mp 和 F r i d o r i c h 1 9 7 1 )。丙二醛
(malondialdehyde，MDA)含量测定参照朱广廉等
(1990)的方法。
结果与讨论
1 转DREB基因烟草细胞系的筛选和检测
基因枪转化后将 BY-2转到添加了 4 mg·L-1
Bialaphos的液体培养基中进行筛选培养，2周后，
用于基因枪转化 BY-2的质粒为 pBAC128F
(图 1)，含有来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的
DREB基因和受 CaMV35S强启动子调控的 bar基
因(王军卫等 2006)。
转化前将 BY-2转到固体培养基上预培养 1
周，然后转移到含有 3.64% (W/V)山梨醇和 3.64%
(W/V)甘露醇的固体培养基上预处理 4~6 h。采用
Bio-Rad公司生产的 PDS-1000/He基因枪进行转
化，轰击金粉的制备参照Bio-Rad公司基因枪操作
图 1 表达载体 pBAC128F质粒图谱(王军卫等 2006)
Fig.1 Schematic map of expression vector pBAC128F
括号内数字表示酶切位点。
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挑选存活下来的细胞系转到含有8 mg·L-1 Bialaphos
的液体培养基中继续筛选培养 3周，最后得到抗
Bialaphos的稳定细胞系。并且分别提取细胞中
DNA。PCR检测结果(图 2)表明，可以扩增出预
期的 500 bp左右的特异性条带，此带与质粒扩增
的条带大小相同，但未经转化的细胞系则未扩增
出相应的条带，初步显示外源DREB基因已经在
受体中存在。
为进一步验证 PCR检测结果的可靠性，对上
述转基因细胞系进行 PCR-Southern 杂交分析结果
(图 3)显示，在 500 bp的位置均出现了与质粒一
pBAC128F相同的带，而野生型细胞则无，这进
一步证明外源DREB基因已整合在转基因细胞的
基因组中。
2 转DREB基因烟草细胞系的抗盐和抗渗透胁迫
能力的鉴定
通过添加外源的 100、200、300 mmol·L-1 NaCl
和 5%、10%、15% PEG6000到MS固体培养基中，
对转基因及野生型的细胞系进行胁迫处理14 d的结
果(图 4)显示，在正常的生长条件下，转基因和野
生型的细胞生长良好，呈现亮黄色致密的小颗
粒。在 100和 200 mmol·L-1 NaCl下的转基因细胞
系依然保持黄色并能生长，而野生型细胞生长缓
慢并有发白的趋势。经 300 mmol·L-1 NaCl处理的
转基因和野生型细胞的生长均受到抑制，但转基
因细胞系仍能存活，而野生型则发白并接近死
亡。同样，经 15% PEG6000处理的转基因细胞
图 4 转基因烟草细胞系的抗盐和抗渗透胁迫能力鉴定
Fig.4 Identifications of resistance of transgenic tobacco cell line to osmotic and salt stresses
培养皿上半部为转基因细胞系(T R) ； 下半部为野生型细胞系(WT)。
图 2 转基因烟草细胞系的 PCR检测
Fig.2 PCR analysis of transgenic tobacco cell line
M：2 000 bp DNA标准分子量；1~5：转基因细胞系； 　
6 ：质粒； 7 ：野生型细胞。
图 3 转基因烟草细胞系的 PCR-Southern 杂交
Fig.3 PCR-Southern blotting of transgenic tobacco cell line
1~5：转基因细胞系；6 ：质粒；7 ：野生型细胞。
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系生长受到轻微抑制但依旧呈现黄色，而野生型
的细胞系的生长则严重受抑并呈灰白颜色。这表
明转DREB基因细胞系的抗盐和抗渗透胁迫能力
增强。
图 6 NaCl和 PEG胁迫下烟草细胞中 SOD活性的变化
Fig.6 Changes in SOD activities of tobacco cells under NaCl and PEG stresses
图 7 NaCl和 PEG胁迫下烟草细胞中MDA含量的变化
Fig.7 Changes in MDA contents of tobacco cells under NaCl and PEG stresses
图 5 NaCl和 PEG胁迫下烟草细胞中脯氨酸含量的变化
Fig.5 Changes in proline contents of tobacco cells under NaCl and PEG stresses
T R ：转基因细胞系；W T ：野生型细胞系。下图同此。
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3 转DREB基因烟草细胞系的几个与抗盐和抗渗
透胁迫相关生理指标的变化
图 5~7显示：(1)在NaCl和 PEG胁迫下的转
基因及野生型细胞系的脯氨酸含量均有明显积累。
250 mmol·L-1 NaCl处理 48 h的转基因细胞系的脯
氨酸含量比野生型高出 4倍。PEG胁迫下的转基
因细胞系脯氨酸含量也普遍高于野生型。未经
NaCl和PEG胁迫的转基因细胞系和野生型的脯氨
酸含量较低(图 5)。
(2) NaCl和PEG胁迫的转基因细胞系和野生型
的SOD活性均不同程度地增强。200 mmol·L-1 NaCl
胁迫 24 h的转基因细胞系的 SOD活性比野生型的
高出 1倍。转基因细胞系 SOD活性普遍高于野生
型的，未经NaCl和 PEG胁迫的转基因细胞系和野
生型的 SOD活性均保持在较低的水平上(图 6)。
(3) NaCl和 PEG胁迫下的转基因及野生型细
胞系MDA的含量均明显增加。但NaCl和PEG胁
迫的野生型细胞系高于转基因的。未经盐和 PEG
胁迫处理的转基因细胞系和野生型的MDA含量较
低(图 7 )。
总之，我们建立的转DREB基因烟草悬浮细
胞系为研究其它与抗盐和抗渗透胁迫相关基因功能
的检测提供理想的实验系统，可为其它相关研究
提供借鉴。
参考文献
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